本發(fā)明涉及口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位，本發(fā)明還涉及所述口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位在口蹄疫診斷或防治中的應(yīng)用，屬于口蹄疫的防治領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

口蹄疫(foot-and-mouthdisease,fmd)是由口蹄疫病毒(footandmouthdiseasevirus,fmdv)引起的，嚴(yán)重危害偶蹄動(dòng)物的重要傳染病之一，該病可引起幼畜死亡、產(chǎn)奶量下降、肉食減少、肉品下降、動(dòng)物的生產(chǎn)性能降低等，造成巨大的經(jīng)濟(jì)損失?？谔阋呔哂袠O強(qiáng)的傳染性，可形成大范圍流行，預(yù)防和控制口蹄疫的關(guān)鍵是免疫接種以及準(zhǔn)確診斷方法的應(yīng)用。

口蹄疫病毒(fmdv)屬于小rna病毒科口蹄疫病毒屬的成員，為單股正鏈rna，其基因組rna全長(zhǎng)約8.5kb。根據(jù)免疫原性，口蹄疫病毒有o、a、c、sat1、sat2、sat3和asial共7個(gè)血清型及65個(gè)以上的亞型，各血清型之間無(wú)交叉免疫保護(hù)。目前中國(guó)主要流行o、a和asial型fmd?？谔阋卟《镜目乖Y(jié)構(gòu)十分復(fù)雜，不同血清型、基因型和分離株的抗原位點(diǎn)和抗原表位都不盡相同，存在廣泛的抗原變異。利用單抗逃逸突變株序列分析和交叉中和試驗(yàn)，已鑒定一些不同血清型fmdv的抗原位點(diǎn)，相關(guān)的研究主要來(lái)自o、a、c和asia1型fmdv，而某些相對(duì)保守的免疫顯性表位可誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生血清型共享型單抗，對(duì)于fmdv感染的診斷具有重要價(jià)值。因此，研究口蹄疫病毒血清型共享性單克隆抗體以及鑒定所述單克隆抗體所識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位，對(duì)于口蹄疫的有效防控將具有重要的意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的第一個(gè)技術(shù)問(wèn)題是提供口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位；

本發(fā)明所要解決的第二個(gè)技術(shù)問(wèn)題是將單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位應(yīng)用于口蹄疫的診斷或防治。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是：

本發(fā)明利用滅活并純化的a型口蹄疫毒株a/jlys/cha/2014免疫balb/c鼠，將免疫小鼠脾細(xì)胞與sp2/0細(xì)胞融合獲得雜交瘤細(xì)胞，經(jīng)有限稀釋法亞克隆，最終篩選獲得一株穩(wěn)定分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系。間接免疫熒光檢測(cè)結(jié)果顯示，單抗10b10與a、o、asia1型毒株均呈陽(yáng)性反應(yīng)，表明單抗10b10為fmdv血清型共享性單抗。

本發(fā)明將分泌口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10的雜交瘤細(xì)胞系提交專利認(rèn)可的機(jī)構(gòu)進(jìn)行保藏，其微生物保藏編號(hào)為：cgmccno.13841；分類命名為：分泌fmdv共享型單克隆抗體的雜交瘤細(xì)胞株。保藏單位：中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心；保藏時(shí)間是2017年4月24日；保藏地址：北京市朝陽(yáng)區(qū)北辰西路1號(hào)院3號(hào)。

本發(fā)明進(jìn)一步公開(kāi)了單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位，其氨基酸序列為seqidno：1所示；其中，x1-x7為任意一種氨基酸殘基。

作為本發(fā)明的優(yōu)選技術(shù)方案，x1為亮氨酸l或丙氨酸a，x4為精氨酸r或苯丙氨酸f；更優(yōu)選的，x1為亮氨酸l，x4為精氨酸r；x2、x3、x5-x7為任意一種氨基酸殘基。進(jìn)一步優(yōu)選的，x2為亮氨酸l，x3為谷氨酸e，x5為異亮氨酸i，x6為亮氨酸l、蛋氨酸m或纈氨酸v，x7為蘇氨酸t(yī)；更優(yōu)選的，x6為亮氨酸l。

本發(fā)明所述單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位，其氨基酸序列最優(yōu)選為seqidno：2所示。

本發(fā)明所述單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位，是o型、a型、c型、asia1型、sat1型、sat2型和sat3型七個(gè)血清型口蹄疫病毒的共享性表位。

本發(fā)明經(jīng)westernblot分析表明，單抗10b10識(shí)別口蹄疫病毒vp2蛋白的一個(gè)線性表位。本發(fā)明利用截短表達(dá)方法研究表明，單抗10b10所識(shí)別的表位基序?yàn)?sup>8tlledrilt¹⁶。為進(jìn)一步分析單抗10b10識(shí)別表位中各個(gè)氨基酸殘基在與單抗結(jié)合過(guò)程中所起的作用，本發(fā)明以單抗10b10識(shí)別的表位基序(tlledrilt)為基礎(chǔ)，合成一系列定點(diǎn)誘變肽并進(jìn)行westernblot分析，結(jié)果表明單抗10b10所識(shí)別表位的氨基酸序列中，thr⁸和asp¹²為關(guān)鍵氨基酸，leu⁹和arg¹³為重要氨基酸，其余殘基的替換對(duì)表位活性無(wú)影響。

本發(fā)明針對(duì)fmdv毒株攜帶該表位肽的氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)，單抗10b10識(shí)別的表位在genbank公示的fmdv毒株的vp2蛋白上是高度保守的，顯示它是7個(gè)血清型fmdv毒株的共享型表位。該表位氨基酸序列中突變最多的是leu¹⁵，可突變?yōu)閙et和val，但其為該表位的非必需氨基酸，突變后對(duì)表位活性不會(huì)產(chǎn)生影響；而thr⁸和asp¹²這兩個(gè)氨基酸殘基在所有已發(fā)表毒株的該表位氨基酸序列中是絕對(duì)保守的。leu⁹和arg¹³為10b10表位的重要氨基酸，其突變可使表位活性呈現(xiàn)一定程度的下降；序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)，274個(gè)毒株vp2蛋白只有3個(gè)leu⁹至ala突變和1個(gè)arg¹³至phe突變，并且主要局限在非洲型毒株，對(duì)該表位活性的影響有限。上述結(jié)果表明，單抗10b10識(shí)別的表位是針對(duì)fmdv7個(gè)血清型毒株的一個(gè)高度保守的線性表位。

本發(fā)明進(jìn)一步將單抗10b10識(shí)別的fmdv共享表位的氨基酸序列tlledrilt進(jìn)行定點(diǎn)誘變，leu⁹突變?yōu)閍la(a)，arg¹³突變?yōu)閜he(f)，leu¹⁵突變?yōu)閙et(m)或val(v)，然后將gst融合表達(dá)的表位肽及其表位突變肽作為抗原分別包被elisa板，檢測(cè)a型、o型和asia1型fmdv陽(yáng)性和陰性血清，以檢測(cè)單抗10b10識(shí)別的fmdv表位氨基酸序列及其突變體與a型、o型和asia1型口蹄疫病毒抗體的反應(yīng)能力。結(jié)果表明，單抗10b10識(shí)別的fmdv表位肽⁸tlledrilt¹⁶及其表位突變肽(l15m和l15v)與a型、o型和asia1型fmdv的陽(yáng)性血清呈現(xiàn)良好的反應(yīng)能力，表位突變肽(l9a和r13f)與a型、o型和asia1型fmdv的陽(yáng)性血清呈現(xiàn)中等的反應(yīng)能力；而上述表位肽及表位突變肽與fmdv陰性血清沒(méi)有反應(yīng)，能夠特異性區(qū)分a型、o型和asia1型fmdv的陰陽(yáng)性血清。因此，本發(fā)明所述單抗10b10識(shí)別各血清型fmdv毒株vp2蛋白上的共享性表位⁸tlledrilt¹⁶及其系列表位突變肽，在口蹄疫診斷中具有重要的價(jià)值和應(yīng)用潛力，為口蹄疫病毒及其抗體泛檢測(cè)試劑的開(kāi)發(fā)提供了理論依據(jù)和實(shí)驗(yàn)材料。

本實(shí)驗(yàn)室已有一株針對(duì)口蹄疫病毒vp2蛋白上的血清型共享性單抗4b2，其所針對(duì)的抗原表位為²kkteettlledr¹³。本發(fā)明比較了單抗10b10識(shí)別的fmdv共享表位⁸tlledrilt¹⁶與單抗4b2所識(shí)別表位的差異性：westernblot分析顯示，單抗10b10只與vp2蛋白上8-16位的⁸tlledrilt¹⁶短肽呈現(xiàn)反應(yīng)，而與vp2蛋白上2-13位的²kkteettlledr¹³短肽不呈現(xiàn)任何反應(yīng)；進(jìn)一步分析表明，10b10所識(shí)別表位的氨基酸序列中，thr⁸和asp¹²為關(guān)鍵氨基酸，leu⁹和arg¹³為重要氨基酸，其余殘基的替換對(duì)表位活性無(wú)影響；而4b2所識(shí)別表位的氨基酸序列中，glu¹¹為關(guān)鍵氨基酸，thr⁸和leu¹⁰為重要氨基酸。單抗10b10重鏈類型為igg2a，輕鏈為κ類型；而單抗4b2重鏈類型為igg1，輕鏈為κ類型。上述分析結(jié)果表明，本發(fā)明中單抗10b10所識(shí)別抗原表位與4b2識(shí)別表位分屬于不同的fmdvvp2表位。

本發(fā)明所述單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位能夠應(yīng)用于制備診斷、預(yù)防或治療口蹄疫的試劑或藥物。

本發(fā)明所述單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位能夠應(yīng)用于制備口蹄疫病毒抗體檢測(cè)的試劑。

本發(fā)明還公開(kāi)了一種用于口蹄疫病毒抗體檢測(cè)的elisa試劑盒，包括：包被抗原的固相載體、hrp標(biāo)記的羊抗牛igg抗體、洗滌液、底物溶液；其中，所述抗原為本發(fā)明所述單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位，其氨基酸序列為seqidno：1所示；其中，x1-x7為任意一種氨基酸殘基；優(yōu)選的，x1為亮氨酸l或丙氨酸a，x4為精氨酸r或苯丙氨酸f；更優(yōu)選的，x1為亮氨酸l，x4為精氨酸r。進(jìn)一步優(yōu)選的，x2為亮氨酸l，x3為谷氨酸e，x5為異亮氨酸i，x6為亮氨酸l、蛋氨酸m或纈氨酸v，x7為蘇氨酸t(yī)；更優(yōu)選的，x6為亮氨酸l。最優(yōu)選的，所述單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位的氨基酸序列為seqidno：2所示。本發(fā)明所述口蹄疫病毒包括：o型、a型、c型、asia1型、sat1型、sat2型或sat3型口蹄疫病毒中的任意一種或多種。

本發(fā)明技術(shù)方案與現(xiàn)有技術(shù)相比，具有以下有益效果：

本發(fā)明對(duì)單克隆抗體10b10識(shí)別的抗原表位進(jìn)行鑒定，確定單抗10b10識(shí)別各血清型fmdv毒株vp2蛋白上的共享性表位⁸tlledrilt¹⁶，該表位是七個(gè)血清型fmdv毒株的共享型表位。本發(fā)明所述單克隆抗體10b10識(shí)別的fmdv表位肽⁸tlledrilt¹⁶及其系列突變體(l9a、r13f、l15m與l15v)，能夠特異性區(qū)分a型、o型和asia1型fmdv的陰陽(yáng)性血清，在口蹄疫的診斷以及口蹄疫病毒抗體泛檢測(cè)等領(lǐng)域?qū)⒕哂兄匾膬r(jià)值和應(yīng)用潛力。

附圖說(shuō)明

圖1為滅活全病毒與單抗10b10的westernblot分析；

圖2為gst融合蛋白的sds-page(a,c,e)和westernblot分析(b,d,f)；

圖3為截短肽gst融合蛋白的sds-page(a,c)和westernblot分析(b,d)；

圖4為丙氨酸掃描突變合成肽的sds-page(a)和westernblot分析(b)；

圖5為10b10表位肽氨基酸序列的保守性分析；

圖6為gst融合表達(dá)的系列表位突變肽與a型fmdv陽(yáng)性、陰性、o型fmdv陽(yáng)性和asia1型fmdv陽(yáng)性血清的免疫反應(yīng)性；

圖7為gst融合蛋白的表位肽段⁸tlledrilt¹⁶和²kkteettlledr¹³的sds-page(a)和westernblot分析(b)。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合具體實(shí)施例來(lái)進(jìn)一步描述本發(fā)明，本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)和特點(diǎn)將會(huì)隨著描述而更為清楚。但是應(yīng)理解所述實(shí)施例僅是范例性的，不對(duì)本發(fā)明的范圍構(gòu)成任何限制。本領(lǐng)域技術(shù)人員應(yīng)該理解的是，在不偏離本發(fā)明的精神和范圍下可以對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的細(xì)節(jié)和形式進(jìn)行修改或替換，但這些修改或替換均落入本發(fā)明的保護(hù)范圍。

實(shí)施例1單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位的鑒定

1、材料和方法

1.1細(xì)胞系及主要試劑

口蹄疫病毒共享型單克隆抗體10b10，由微生物保藏編號(hào)為：cgmccno.13841的雜交瘤細(xì)胞系分泌。

elisa板購(gòu)自于corning公司，dab顯色液購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，bl21感受態(tài)購(gòu)自于天根公司，pgex-6p-1由本發(fā)明人實(shí)驗(yàn)室保存。

1.2衣殼蛋白的截短表達(dá)

根據(jù)fmdva/jlys/cha/2014株(aj131665)衣殼蛋白序列，設(shè)計(jì)9對(duì)特異性引物，將蛋白分為9個(gè)截短片段進(jìn)行表達(dá)。所有上下游引物均分別引入bamhi、xhoi酶切切位點(diǎn)，引物序列見(jiàn)表1，由invitrogen公司合成。以病毒rna反轉(zhuǎn)錄的cdna為模板，9對(duì)引物分別用于擴(kuò)增9個(gè)截短基因片段，其分布如表1所示。酶切后的基因片段插入pgex-6p-1的bamhi和xhoi之間，轉(zhuǎn)化bl21感受態(tài)細(xì)胞，用psti酶切鑒定重組質(zhì)粒，挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落過(guò)夜培養(yǎng)并測(cè)序驗(yàn)證，然后1:100稀釋接種于新鮮的液體lb培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至od600nm＝0.6，加入誘導(dǎo)劑iptg至終濃度為0.1mmol/l，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，收集菌體并用適量pbs重懸，融合蛋白分別命名為vp1、vp2、vp3、vp2-1、vp2-2、vp2-3、vp2-4、vp2-5和vp2-6。

表1用于衣殼蛋白及其截短片段表達(dá)的引物序列

1.3表位肽的gst融合表達(dá)

人工合成表位及其單氨基酸逐一截短表位的編碼dna的兩條互補(bǔ)寡核苷酸鏈，上游引入bamhi粘性延伸末端，下游引入終止密碼子以及xhoi粘性延伸末端，引物序列見(jiàn)表2、表3和表4。將兩條互補(bǔ)鏈直接退火形成帶粘性末端的雙鏈dna，插入pgex-6p-1的bamhi和xhoi之間，轉(zhuǎn)化bl21感受態(tài)細(xì)胞，用psti酶切鑒定重組質(zhì)粒。挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落過(guò)夜培養(yǎng)并測(cè)序驗(yàn)證，然后1:100稀釋接種于新鮮的液體lb培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至od600nm＝0.6，加入誘導(dǎo)劑iptg至終濃度為1mmol/l，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，收集菌體并用適量的pbs重懸。表達(dá)的融合蛋白分別命名為vp2-1-a、vp2-1-b、1-25至1-15、2-25至10-25、tlledrilt、t8a、l9a、l10a、e11a、d12a、r13a、i14a、l15a與t16a。

表2編碼截短肽及其截短突變體dna的互補(bǔ)寡核苷酸鏈

表3用于本發(fā)明的合成肽及其氨基酸序列

注：^a口蹄疫病毒a/jlys/cha/2014株vp2的8～16aa肽；

^b突變位點(diǎn)氨基酸均加粗并用下劃線標(biāo)出，按左右順序依次有一個(gè)殘基用丙氨酸(a)替換。

表4編碼合成肽dna的互補(bǔ)寡核苷酸鏈

1.4系列表位突變肽的gst融合表達(dá)

人工合成表位編碼dna的兩條互補(bǔ)寡核苷酸鏈，上游引入bamhi粘性延伸末端，下游引入終止密碼子以及xhoi粘性延伸末端，引物序列見(jiàn)表5。將兩條互補(bǔ)鏈直接退火形成帶粘性末端的雙鏈dna，插入pgex-6p-1的bamhi和xhoi之間，轉(zhuǎn)化bl21感受態(tài)細(xì)胞，用psti酶切鑒定重組質(zhì)粒，挑取單個(gè)陽(yáng)性菌落過(guò)夜培養(yǎng)并測(cè)序驗(yàn)證，然后1:100稀釋接種于新鮮的液體lb培養(yǎng)基中，37℃震蕩培養(yǎng)至od600nm＝0.6，加入誘導(dǎo)劑iptg至終濃度為1mmol/l，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h誘導(dǎo)蛋白的表達(dá)，收集菌體并用適量的pbs重懸，表達(dá)的gst融合蛋白分別命名為l9a、r13f、l15m與l15v。

表5編碼表位突變肽dna的互補(bǔ)寡核苷酸鏈

1.5sds-page電泳和westernblot檢測(cè)

sds-page電泳(15％tris-glycine)分離各融合蛋白，轉(zhuǎn)印至硝酸纖維素濾膜上(90v，45min)，用5％脫脂乳-pbs封閉液4℃封閉過(guò)夜，與單抗10b10于37℃溫1h，與hrp標(biāo)記的羊抗鼠igg室溫作用1h，dab(6mg/10ml)顯色。

1.6抗體檢測(cè)elisa

用上述1.4中的gst融合表達(dá)的表位肽作為抗原包被96孔板，加入100ul100倍稀釋的a型、o型和asia1型fmdv陽(yáng)性血清和陰性血清，37℃溫育1h后洗滌，加入1:5000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗牛igg抗體，洗滌后加入底物opd避光顯色10min，于波長(zhǎng)492nm測(cè)定吸光值。

2、實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.1單抗10b10識(shí)別表位的初步定位

用單抗10b10對(duì)口蹄疫a、o和asia1型全病毒進(jìn)行westernblot分析，均顯示明顯的特異性反應(yīng)條帶(圖1)，可見(jiàn)單抗10b10識(shí)別不同血清型fmdv毒株的同一個(gè)線性表位。

用融合表達(dá)的vp1、vp2和vp3進(jìn)行sds-page(圖2-a)分離，并以1：1000稀釋的單抗10b10作為一抗、1:5000稀釋的hrp標(biāo)記的羊抗鼠抗體作為二抗進(jìn)行westernblot分析(圖2-b)，結(jié)果顯示，10b10所識(shí)別的表位位于vp2蛋白上。為了進(jìn)一步定位10b10識(shí)別的表位，將vp2分為6段(vp2-1至vp2-6)截短進(jìn)行融合表達(dá)，sds-page(圖2-c)和westernblot分析(圖2-d)顯示，10b10所識(shí)別的表位位于vp2-1短肽上。為進(jìn)一步鑒定單抗10b10識(shí)別的表位，本發(fā)明以上下游引物退火形成目的片段為目的設(shè)計(jì)2對(duì)引物(表2)進(jìn)行短肽編碼基因的gst融合表達(dá)。sds-page(圖2-e)與westernblot(圖2-f)分析顯示，單抗10b10與vp2-1-a短肽呈現(xiàn)反應(yīng)。

2.2單抗10b10識(shí)別表位的精確定位

為進(jìn)一步精確鑒定單抗10b10識(shí)別的表位，本發(fā)明以上下游引物退火形成目的片段為目的進(jìn)而設(shè)計(jì)了20對(duì)引物(表2)，分別從vp2-1-a短肽的n端和c端以1個(gè)氨基酸殘基逐步遞減，直到c末端或n末端剩下15個(gè)氨基酸組成的短肽為止，通過(guò)gst融合表達(dá)以及sds-page電泳(圖3-a)和westernblot(圖3-b)分析顯示，單抗10b10與n端的¹dkkteettlledrilttrnghttst²⁵至⁸tlledrilttrnghttst²⁵以及c端的¹dkkteettlledrilttrnghttst²⁵至¹dkkteettlledrilt¹⁶發(fā)生特異性結(jié)合，而與其它融合肽以及gst對(duì)照均不反應(yīng)。上述結(jié)果表明，⁸tlledrilt¹⁶為單抗10b10識(shí)別表位的最小反應(yīng)活性單元，即單抗10b10識(shí)別表位的基序。

2.310b10識(shí)別表位的關(guān)鍵氨基酸

為進(jìn)一步了解單抗10b10識(shí)別表位中各個(gè)氨基酸殘基在與單抗結(jié)合過(guò)程中所起的作用，以10b10表位基序⁸tlledrilt¹⁶為基礎(chǔ)，用丙氨酸(a)從n端至c端進(jìn)行逐個(gè)氨基酸替換(表3和表4)，⁸tlledrilt¹⁶作為陽(yáng)性對(duì)照、gst空載體作為陰性對(duì)照。經(jīng)sds-page(圖4-a)與westernblot分析(圖4-b)顯示，10b10所識(shí)別表位的氨基酸序列中，thr⁸和asp¹²為關(guān)鍵氨基酸，leu⁹和arg¹³為重要氨基酸，其余殘基的替換對(duì)表位活性無(wú)影響。

2.410b10表位是七個(gè)不同血清型fmdv各基因型毒株的保守性表位

為驗(yàn)證10b10表位的保守性，選取genbank收錄的274條fmdv的vp2氨基酸序列進(jìn)行比對(duì)，以其中21條fmdv的vp2氨基酸序列為代表，比對(duì)分析結(jié)果(圖5)顯示，10b10表位的氨基酸序列在7種血清型fmdv毒株之間是高度保守的。在序列比對(duì)中發(fā)現(xiàn)，該表位氨基酸序列中突變最多的是leu¹⁵，可突變?yōu)閙et和val，但其為該表位的非必需氨基酸，突變后對(duì)表位活性不會(huì)產(chǎn)生影響；而thr⁸和asp¹²作為本發(fā)明鑒定的10b10表位的關(guān)鍵氨基酸，這兩個(gè)氨基酸殘基在所有已發(fā)表毒株的該表位氨基酸序列中是絕對(duì)保守的。本發(fā)明在鑒別10b10識(shí)別表位關(guān)鍵氨基酸的試驗(yàn)中(圖4-b)發(fā)現(xiàn)，leu⁹和arg¹³為10b10表位的重要氨基酸，其突變可使表位活性呈現(xiàn)一定程度的下降，本序列比對(duì)中274個(gè)毒株vp2蛋白只有3個(gè)leu⁹至ala突變和1個(gè)arg¹³至phe突變，并且主要局限在非洲型毒株，對(duì)該表位活性的影響有限。這些結(jié)果表明，10b10表位是針對(duì)fmdv7個(gè)血清型毒株的一個(gè)高度保守的線性表位。

2.5單抗10b10識(shí)別抗原表位及其突變體與口蹄疫病毒抗體陽(yáng)性血清的特異性反應(yīng)

在鑒定了單抗10b10所識(shí)別的表位基序⁸tlledrilt¹⁶后，為確定該抗原表位能否作為診斷抗原來(lái)檢測(cè)a型、o型和asia1型口蹄疫病毒抗體陽(yáng)性血清，本發(fā)明首先將10b10識(shí)別的fmdv共享表位的氨基酸序列⁸tlledrilt¹⁶進(jìn)行定點(diǎn)誘變：leu⁹突變?yōu)閍la(a)；arg¹³突變?yōu)閜he(f)；leu¹⁵突變?yōu)閙et(m)或val(v)，以gst融合的方式表達(dá)，分別命名為l9a、r13f、l15m和l15v。然后，將這些gst融合的表位肽作為抗原分別包被elisa板，同時(shí)，設(shè)立gst空載體作為對(duì)照，檢測(cè)a型、o型和asia1型fmdv陽(yáng)性和陰性血清，以檢測(cè)單抗10b10識(shí)別的fmdv表位的氨基酸序列tlledrilt及其突變體與a型、o型和asia1型口蹄疫病毒抗體的反應(yīng)能力，由此評(píng)價(jià)10b10識(shí)別的fmdv共享型表位的氨基酸序列tlledrilt在口蹄疫診斷中的價(jià)值。結(jié)果(圖6)表明：?jiǎn)慰?0b10識(shí)別的fmdv共享型表位肽及其表位突變肽(l15m和l15v)與a型、o型和asia1型fmdv的陽(yáng)性血清呈現(xiàn)良好的反應(yīng)能力，表位突變肽(l9a和r13f)與a型、o型和asia1型fmdv的陽(yáng)性血清呈現(xiàn)中等的反應(yīng)能力，而這些表位肽及其表位突變肽與fmdv陰性血清均沒(méi)有反應(yīng)，能夠特異性區(qū)分fmdv的陰陽(yáng)性血清。這些檢測(cè)結(jié)果，與10b10識(shí)別表位鑒定過(guò)程中發(fā)現(xiàn)的氨基酸殘基thr⁸和asp¹²是該表位活性的關(guān)鍵氨基酸、殘基leu⁹和arg¹³是該表位的重要氨基酸、而其余殘基替換對(duì)該表位的活性無(wú)影響的結(jié)果相一致(圖4-b)。由此，本發(fā)明確定了單抗10b10識(shí)別的fmdv表位的氨基酸序列tlledrilt及其系列表位突變肽對(duì)于建立共享型口蹄疫診斷方法的價(jià)值和應(yīng)用潛力。

2.6單抗10b10識(shí)別抗原表位與單抗4b2識(shí)別抗原表位的差異性分析

本實(shí)驗(yàn)室已有一株針對(duì)口蹄疫病毒vp2蛋白上的血清型共享性單抗4b2，其所針對(duì)的抗原表位(²kkteettlledr¹³)也已被本實(shí)驗(yàn)室所鑒定。為了比較單抗10b10識(shí)別的fmdv共享表位⁸tlledrilt¹⁶與單抗4b2所識(shí)別表位的差異性，將這2個(gè)表位進(jìn)行短肽編碼基因的gst融合表達(dá)，sds-page(圖7-a)與westernblot(圖7-b)分析顯示，單抗10b10只與vp2蛋白上8-16位的⁸tlledrilt¹⁶短肽呈現(xiàn)反應(yīng)，而與vp2蛋白上2-13位的²kkteettlledr¹³短肽不呈現(xiàn)任何反應(yīng)；進(jìn)一步分析表明，10b10所識(shí)別表位的氨基酸序列中，thr⁸和asp¹²為關(guān)鍵氨基酸，leu⁹和arg¹³為重要氨基酸，其余殘基的替換對(duì)表位活性無(wú)影響。而4b2所識(shí)別表位的氨基酸序列中，glu¹¹為關(guān)鍵氨基酸，thr⁸和leu¹⁰為重要氨基酸。進(jìn)一步分析顯示，單抗10b10重鏈類型為igg2a，輕鏈為κ類型；而單抗4b2重鏈類型為igg1，輕鏈為κ類型。上述比較分析結(jié)果均表明，本發(fā)明中單抗10b10所識(shí)別抗原表位與4b2識(shí)別表位分屬于不同的fmdvvp2表位。

sequencelisting

<110>中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所

<120>單克隆抗體10b10識(shí)別的口蹄疫病毒血清型共享性抗原表位及其應(yīng)用

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