本發(fā)明涉及一種基于離子調(diào)控的酶法定向制備低粘度及超低粘度褐藻膠的方法，具體是指以褐藻為原料，利用離子調(diào)控褐藻膠裂解酶的活性，以降解生產(chǎn)低粘度及超低粘度褐藻膠的方法。

背景技術：

褐藻膠是從海帶、馬尾藻等褐藻中提取出來的一種多糖類生物高分子，是由甘露糖醛酸和古羅糖醛酸組成的一種線型聚合物。與中、高粘度褐藻膠相比，低粘度及超低粘度褐藻膠具有分子量小、穩(wěn)定性好、滲透性強、水溶性好等特點，而被廣泛的應用于印染、醫(yī)療衛(wèi)生與食品行業(yè)。低粘度及超低粘度褐藻膠在世界藻膠中占有重要地位，其需求量約占總需求量得30-40%，且在德國、美國、日本、韓國和國內(nèi)市場都很大，但由于國內(nèi)以往無法生產(chǎn)，多年來處于空白地位。

當前國內(nèi)褐藻膠的生產(chǎn)多沿用傳統(tǒng)生產(chǎn)工藝，傳統(tǒng)工藝耗水量極大，每生產(chǎn)1噸褐藻膠產(chǎn)品約需要1000噸水；其產(chǎn)品規(guī)格也仍以中粘度褐藻膠為主，約占總產(chǎn)量的90%，但低粘度、超低粘度和高粘度褐藻膠產(chǎn)品所占比例極少，嚴重制約了褐藻膠產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的優(yōu)化與發(fā)展。目前國內(nèi)外低粘度及超低粘度的生產(chǎn)方法無外乎、高溫消化法、加酸蒸煮海帶法、脫鈣凝膠加溫法及褐藻酸鈉干粉加溫存放法等，缺點如專利cn104448032b一種從褐藻中提取褐藻酸鈉的方法，該工藝為了制備低粘度褐藻膠，采用高溫、強酸等方法以此來降低褐藻膠粘度，該方法具有成本高、能耗大、分子量不均一等缺點。

目前，一些研究者將酶解法應用到低粘度及超低粘度生產(chǎn)中，如專利cn105367684a一種低粘度海藻酸鈉的制備方法與專利cn103665183a一種超低粘度褐藻膠的生產(chǎn)方法，其工藝均為在堿消化前使用纖維素酶、蛋白酶、果膠酶進行酶解處理后，經(jīng)過堿消化、稀釋、脫色、鈣析、脫鈣、中和、醇沉后得到低粘度及超低粘度的褐藻膠產(chǎn)品，其中專利cn105367684a主要描述了該技術在低粘度褐藻膠的工業(yè)化生產(chǎn)中的應用。該種提取工藝利用纖維素酶、蛋白酶、果膠酶分解褐藻細胞壁，加快褐藻膠的溶出，從而提高出膠率，但纖維素酶、蛋白酶、果膠酶對褐藻膠無分解作用，很難得到低粘度及超低粘度褐藻膠。再如專利cn200610042119a一種生產(chǎn)低粘度褐藻膠的方法，該專利將稀釋后的可降解和液化褐藻膠的海洋細菌菌懸液噴灑于海帶表面，處理3-60天后，再以常規(guī)方法對海帶處理，得到低粘度的褐藻膠。該低粘度褐藻膠生產(chǎn)工藝中菌僅作用于海帶表面，對藻體內(nèi)部褐藻酸作用有限，具有酶解效率低，工藝歷時時間長等缺點。

論文《褐藻膠裂解酶系的酶化學_產(chǎn)物分析及應用研究》在第五章公開了“褐藻膠裂解酶在低粘度和超低粘度褐藻膠制備中的應用”，該方法利用褐藻膠裂解酶的粗酶液對堿消化后的消化液進行酶解處理，經(jīng)固色、消化、酶解、過濾、鈣析、脫鈣、烘干后制得低粘度及超低粘度褐藻膠，但該褐藻膠裂解酶系是由三個單體酶（酶a、酶b與酶c）組成，因該酶系的三個單體酶底物特異性不同，所以利用該粗酶液制備的低粘度及超低粘度褐藻膠分子量規(guī)格不均一，易出現(xiàn)小分子寡糖。與當前市場上的多數(shù)低粘度褐藻膠產(chǎn)品無異，分子量均一度較差。本專利通過金屬離子對褐藻膠裂解酶系的調(diào)節(jié)作用實現(xiàn)單體酶活性中心的開放和關閉，以控制底物的降解水平，再利用不同截留分子量的膜生物反應器生產(chǎn)制備出分子量規(guī)格較為均一的低粘度及超低粘度褐藻膠。

技術實現(xiàn)要素：

為解決傳統(tǒng)工藝耗水嚴重、分子量均一度差等問題，本發(fā)明提供一種利用褐藻膠裂解酶生產(chǎn)低粘度及超低粘度褐藻膠的方法。

本發(fā)明采用如下技術方案：一種基于離子調(diào)控的酶法定向生產(chǎn)低粘度及超低粘度褐藻膠的方法，包括以下具體步驟：

（1）原料預處理:鮮褐藻或加水泡發(fā)并洗去表面雜質(zhì)后的干褐藻切塊于0.5%-1%甲醛溶液中固色，清水洗去表面甲醛；

（2）消化:加入料液比為1:10-1:40（m/v）的4%-8%碳酸氫鈉溶液、50-70℃、80-400r/min攪拌條件下消化1-4h；

（3）酶活調(diào)控：在褐藻膠裂解酶液中用k⁺、na⁺和ba²⁺的溶液按摩爾比1：2-25:0.001-0.5比例調(diào)控單體酶酶活。具體操作時以1-200mmol/l的bacl2溶液加至褐藻膠裂解酶液中，30℃恒溫孵育5-30min，以此對褐藻膠裂解酶三個單體酶進行酶活調(diào)控；

（4）酶解：將經(jīng)過堿處理的消化液加入0.5-1倍體積水進行初步稀釋，冷卻至室溫后加入10%的鹽酸調(diào)節(jié)ph至5-7，分別置于截留分子量為12-100kda的膜生物反應器中，于30℃預熱5-15min后加入20-100u/g（酶活單位/原料重量）經(jīng)過上述處理褐藻膠裂解酶，30-150r/min攪拌條件下反應20-60min；待反應結(jié)束后升溫至60-90℃保持20min滅活，過濾分離后得清膠液；

（5）鈣析：邊緩慢攪拌邊向除去濾渣的清膠液中加入適量5%-10%的氯化鈣溶液；

（6）脫鈣與中和：將褐藻酸鈣凝膠加入一定量鹽酸中酸化20min，水洗至中性；之后加入一定量10%碳酸鈉溶液中和直至完全溶解，注意碳酸鈉加入量不易過多；

（7）醇沉：邊攪拌邊向樣品中加入2-3倍體積的95%乙醇，靜置一段時間后，離心獲得褐藻膠固體，烘干、粉碎后即得樣品；

（8）檢驗:取1g褐藻膠樣品加入100ml水中配成1%的褐藻膠溶液，于20℃下測量其粘度。取5mg褐藻膠樣品加入1ml水中配成5mg/ml的褐藻膠溶液，hpgpc測其分子量。

本發(fā)明所述低粘度褐藻膠粘度范圍在71-150mpa·s；超低粘度褐藻膠粘度范圍為5-70mpa·s。

本發(fā)明所述褐藻膠裂解酶系由三種褐藻膠裂解酶組成的酶系，其降解活性具有離子調(diào)性特性。

與現(xiàn)有技術相比，本發(fā)明的優(yōu)點和積極效果是：

1、本發(fā)明通過金屬離子對褐藻膠裂解酶系的酶活進行調(diào)控，達到了控制底物的降解水平的目的。

2、本發(fā)明利用褐藻為原料直接提取低粘度及超低粘度褐藻膠，避免了通過褐藻膠后續(xù)加工的成本增加。

3、本發(fā)明利用截留分子量12-120kda的膜生物反應器，一方面可使小分子褐藻膠及時分離出去反應的進行；另一方面可以連續(xù)操作，極大限度的利用酶，因而可以提高產(chǎn)量節(jié)約成本。

4、通過本發(fā)明方案制備的低粘度及超低粘度褐藻膠產(chǎn)品具有良好的分子量均一度，主組分含量在80-100%之間。

5、本發(fā)明通過酶解作用得到的消化液極易過濾，與傳統(tǒng)工藝生產(chǎn)相比，可節(jié)省60-80%的用水量，極大節(jié)約了水資源的消耗，減少了工業(yè)廢水的排放量，實現(xiàn)了節(jié)能減排。

6、本發(fā)明工藝簡單、連續(xù)性強，酶解過程在30min內(nèi)即可完成，克服了其他工藝酶處理時間長等問題。

附圖說明

圖1為實施例1產(chǎn)品的hpgpc液相圖譜；

圖2為實施例2產(chǎn)品的hpgpc液相圖譜;

圖3為hpgpc法標準曲線；

圖4為工藝流程圖。

具體實施方式

下面結(jié)合具體事例對本發(fā)明進行進一步說明：

實施例1：

（1）原料預處理：取100kg干海帶加入1000l水中浸泡除雜，之后于100l的0.5%甲醛溶液固色2h后，清水洗去表面甲醛；

（2）消化：在60℃、攪拌條件下，將原料于2000l的6%碳酸氫鈉溶液中消化3.5h；

（3）酶活調(diào)控：將kcl、nacl與bacl2溶液加至褐藻膠裂解酶粗酶液中，使其終濃度分別為150mmol/l、500mmol/l與5mmol/l，30℃恒溫孵育20min，以此實現(xiàn)對褐藻膠裂解酶三個單體酶的酶活調(diào)控。

（4）酶解過濾：將經(jīng)過堿處理的消化液加入2000l的水進行初步稀釋，冷卻至室溫后加入10%的鹽酸調(diào)節(jié)ph至6，分別置于截留分子量為80kda的膜生物反應器中，于30℃預熱10min后加入30u/g經(jīng)過上述處理褐藻膠裂解酶，100r/min攪拌條件下反應30min；待反應結(jié)束后升溫至70℃保持20min滅活，過濾分離后得清膠液。

（5）鈣析：邊緩慢攪拌邊向除去濾渣的清膠液中加入200l的10%的氯化鈣溶液；

（6）脫鈣：將褐藻酸鈣凝膠加入500l的3%鹽酸中酸化30min，水洗至中性；之后加入適量10%碳酸鈉溶液中和直至完全溶解；

（7）醇沉：向樣品中加入2倍體積的乙醇進行分級醇沉，烘干、粉碎后得干樣品29.5kg；

（8）檢驗：取1g褐藻膠樣品加入100ml水中配成1%的褐藻膠溶液，20℃下測得其粘度為101mpa·s。取5mg褐藻膠樣品加入1ml水中配成5mg/ml的褐藻膠溶液，hpgpc法僅測出3個峰，其中主峰分子量為87.6kda，其百分含量為85%，分子量均一度良好?？傆盟繛?.8噸，換算成生產(chǎn)一噸粘度為101mpa·s的產(chǎn)品的總用水量為264.41噸，與傳統(tǒng)工藝的生產(chǎn)每噸產(chǎn)品均用水量1000噸相比，節(jié)約了73.56%的用水。

實施例2：

（1）原料預處理：將30kg干巨藻用300l的水中浸泡3h后除雜，于30l的0.5%甲醛溶液固色4h后，清水洗去表面甲醛；

（2）消化：在65℃、攪拌條件下，將原料于450l的6%碳酸氫鈉溶液中消化2h；

（3）酶活調(diào)控：將kcl、nacl與bacl2溶液加至褐藻膠裂解酶粗酶液中，使其終濃度分別為200mmol/l、450mmol/l與2.5mmol/l，30℃恒溫孵育30min，以此實現(xiàn)對褐藻膠裂解酶三個單體酶進行酶活調(diào)控。

（4）酶解：將經(jīng)過堿處理的消化液加入300l的水進行初步稀釋，冷卻至室溫后加入10%的鹽酸調(diào)節(jié)ph至7，分別置于截留分子量為40kda的膜生物反應器中，于30℃預熱10min后加入50u/g經(jīng)過上述處理褐藻膠裂解酶，150r/min攪拌條件下反應30min；待反應結(jié)束后將酶解液于沸水中煮沸5min后滅活，過濾分離后得清膠液。

（5）鈣析：邊緩慢攪拌邊向除去濾渣的清膠液中加入60l的10%的氯化鈣溶液；

（6）脫鈣：將褐藻酸鈣凝膠加入200l的3%鹽酸中酸化30min，水洗至中性；之后加入適量10%碳酸鈉溶液中和；

（7）醇沉：向樣品中加入3倍體積的乙醇進行分級醇沉，烘干、粉碎后得干樣品10.2kg；

（8）檢驗：取1g褐藻膠樣品加入100ml水中配成1%的褐藻膠溶液，20℃下測得其粘度為46mpa·s。取5mg褐藻膠樣品加入1ml水中配成5mg/ml的褐藻膠溶液，hpgpc法僅測出3個峰，其中主峰分子量為41.9kda，其百分含量為89%，分子量均一度良好?？傆盟繛?.45噸，換算成生產(chǎn)一噸粘度為46mpa·s的產(chǎn)品的總用水量為240.19噸，與傳統(tǒng)工藝的生產(chǎn)每噸產(chǎn)品均用水量1000噸相比，節(jié)約了75.98%的用水。

表1分子量分布、產(chǎn)量及工藝耗水量

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。