本發(fā)明涉及生物技術(shù)領(lǐng)域，特別地，涉及一種口腔拭子dna提取方法及試劑盒。
背景技術(shù)：
dna提取是分子生物學(xué)的基本實(shí)驗(yàn)，它是不斷發(fā)展的基因芯片檢測(cè)中最基本的方法，也是基因芯片制備、分析和診斷的前提，因此，dna提取是生物學(xué)最基礎(chǔ)的技術(shù)之一。
成功的核酸分離純化需要四個(gè)重要的步驟：組織或細(xì)胞的破碎和裂解、核蛋白復(fù)合體的變性、核酸酶的滅活以及污染物的去除，通過(guò)理想的抽提方法可以獲取高質(zhì)量的靶核酸，同時(shí)沒(méi)有蛋白、糖、脂和其它核酸污染等。
目前，常用的dna提取方法主要有玻璃珠法、超聲波法、研磨法、凍融法等物理方法，ctab法、異硫氰酸胍法、堿裂解法等化學(xué)方式，以及酶提取法等生物提取方式；根據(jù)核酸分離純化方式的不同有硅質(zhì)材料、陰離子交換樹(shù)脂提取等。其中，植物來(lái)源的dna提取方法主要有十六烷基三乙基澳化按(ctab)法、sds法和高鹽低ph法等；細(xì)菌、真菌來(lái)源的dna提取方法為堿裂解法、煮沸法、sds裂解法以及triton-溶菌酶裂解法等；動(dòng)物來(lái)源的dna最為經(jīng)典的提取方法主要有酚抽提法、異丙醇沉淀法、甲酞胺裂解法，現(xiàn)行的很多方法都是在此基礎(chǔ)上改進(jìn)得來(lái)。
口腔黏膜為復(fù)層鱗狀上皮，具有代謝旺盛、更新快、易脫落的特點(diǎn)，它由多層細(xì)胞組成，基底層具有旺盛分裂能力，其上皮脫落細(xì)胞雖然細(xì)胞核固縮，但與其他組織細(xì)胞一樣具有完整的基因組dna，從而成為法醫(yī)學(xué)和遺傳學(xué)dna多態(tài)性檢測(cè)分型的生物性檢驗(yàn)材料。既往多采用酚氯仿法或chelex-100等方法，存在酚、氯仿污染或收獲率低、純度不高等缺點(diǎn)。
采用口腔拭子法(口腔脫落細(xì)胞)提取口腔上皮細(xì)胞是一種非介入、無(wú)痛苦、無(wú)創(chuàng)傷、簡(jiǎn)單的dna標(biāo)本采集方法，該方法適用于采集任何年齡段人群的dna樣本，同時(shí)也可應(yīng)用于新生兒、嬰幼兒或老弱病殘者等不便采血人群之用。目前，隨著口腔拭子法的廣泛應(yīng)用，單個(gè)樣本下客戶需求對(duì)應(yīng)檢測(cè)的項(xiàng)目越來(lái)越多，普通的dna提取方法得到的dna在濃度、質(zhì)量方面已日益不能滿足生產(chǎn)需求，很難滿足單個(gè)樣本需要檢測(cè)多項(xiàng)項(xiàng)目中所要求的dna的濃度與質(zhì)量；而且整個(gè)提取方法用時(shí)較長(zhǎng)、影響了實(shí)驗(yàn)檢測(cè)的進(jìn)度.迫切開(kāi)發(fā)出一種dna提取濃度高、質(zhì)量好，能充分滿足實(shí)驗(yàn)生產(chǎn)的要求的口腔拭子dna提取方法。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
本發(fā)明提供了一種口腔拭子dna提取方法，以解決了現(xiàn)有技術(shù)中dna提取方法提取產(chǎn)物濃度低、質(zhì)量差的問(wèn)題。
為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明提出了一種口腔拭子dna提取方法，包括如下步驟：
(1)取口腔拭子樣品進(jìn)行細(xì)胞的裂解和酶解處理，得到dna酶解液；
(2)取處理后的dna酶解液，以dna結(jié)合柱進(jìn)行純化提??；
(3)將提取dna后的結(jié)合柱以ddh2o為洗脫液，于60-80℃進(jìn)行dna洗脫處理；
(4)收集所得洗脫液，即為所需的含dna母液。
優(yōu)選的，所述步驟(3)中，所述ddh2o的ph值為7.0-8.5。
進(jìn)一步的，所述步驟(3)中，在進(jìn)行洗脫處理之前，還包括將所述ddh2o進(jìn)行預(yù)熱至60-80℃的步驟。
所述步驟(1)中，所述細(xì)胞的裂解和酶解處理步驟，具體包括：取所述口腔拭子加入裂解液和蛋白酶k充分混勻進(jìn)行細(xì)胞裂解和酶解；隨后加入緩沖液，靜置反應(yīng)至溶液變清亮，并加入無(wú)水乙醇混勻，固液分離后收集液體部分，即為所得dna酶解液。
可選的，所述步驟(1)中，所述裂解液為bufferatl，所述裂解步驟的溫度為50-60℃；所述緩沖液為bufferal，所述靜置反應(yīng)步驟的溫度為65-75℃。
所述步驟(2)中，所述純化提取步驟具體包括：
取所述dna結(jié)合柱加入所述dna酶解液，離心，棄濾液；
取處理后的所述dna結(jié)合柱，加入第一漂洗液混勻，離心并棄濾液；
取處理后的所述dna結(jié)合柱，加入第二漂洗液混勻，離心并棄濾液，即可。
所述步驟(2)中，還包括對(duì)所述dna結(jié)合柱進(jìn)行預(yù)處理的步驟，即取部分所述dna酶解液與所述dna結(jié)合柱混勻，離心并棄濾液；以及對(duì)提純后的所述dna結(jié)合柱進(jìn)行后處理的步驟，即將純化提取后的所述dna結(jié)合柱于原收集管內(nèi)再次離心，并棄濾液。
所述第一漂洗液為乙醇稀釋的buffergw1，所述第二漂洗液為乙醇稀釋的buffergw2，所述dna結(jié)合柱為hipurednaminicolumni。
本發(fā)明還公開(kāi)了一種口腔拭子dna提取試劑盒，包括：
hipurednaminicolumni結(jié)合柱；
本發(fā)明還公開(kāi)了所述的口腔拭子dna提取試劑盒的使用方法，包括如下步驟：
(1)取口腔拭子的頭端部位置于離心管內(nèi)，加入所述裂解液和酶解液，于50-60℃充分混勻進(jìn)行處理；隨后加入所述緩沖液，于60-80℃靜置反應(yīng)至溶液變清亮，并加入所述無(wú)水乙醇混勻，固液分離后收集液體部分，即為dna酶解液；
(2)把所述hipurednaminicolumni裝在收集管中，加入部分所述dna酶解液混勻，離心并棄濾液；
把處理后的dna結(jié)合柱裝回收集管中，并加入剩余dna酶解液，離心并棄濾液和收集管；
把所述hipurednaminicolumni裝入新的收集管中，加入所述第一漂洗液混勻，離心并棄濾液；
把所述hipurednaminicolumni裝入新的收集管中，加入所述第二漂洗液混勻，離心并棄濾液；
把所述結(jié)合柱裝回收集管中，離心并收集所述hipurednaminicolumni結(jié)合柱；
(3)將處理后的結(jié)合柱裝在新的離心管中，加入預(yù)熱至60-80℃的所述ddh2o至柱子的膜中央，并于60-80℃恒溫洗脫處理；
(4)收集所得洗脫液，即為所需的含dna母液。
有益效果：
本發(fā)明實(shí)施例提供了一種口腔拭子dna提取方法，在現(xiàn)有一般dna提取方法的基礎(chǔ)上，在以dna結(jié)合柱提純處理后，以ddh2o為洗脫液，并優(yōu)選在60-80℃條件下進(jìn)行加熱處理，極大的提高了口腔拭子提取的dna的濃度與質(zhì)量，避免了提取的dna因濃度與質(zhì)量不達(dá)標(biāo)而需要重提帶來(lái)的一系列不良影響，有效的節(jié)省了dna的提取時(shí)間，提高了生產(chǎn)效率，有助于節(jié)省成本。
本發(fā)明所述口腔拭子dna提取試劑盒，特別的以ddh2o為洗脫液，極大的提高了口腔拭子提取的dna的濃度與質(zhì)量，同時(shí)所述試劑盒使用方便，提取效率較高。
具體實(shí)施方式
實(shí)施例1
耗材：hipureblood&tissuednakit、移液槍(100-1000μl)、移液槍(10-100μl)、移液槍(0.1-2.5μl)、吸頭1000μl、20μl、10μl、1.5/2.0ml離心管、醫(yī)用剪刀、吸水紙、無(wú)水乙醇(96-100％)、1.5mlep管架；
實(shí)驗(yàn)器材：干式恒溫器(k30)、渦旋混勻器、冰箱、nanodrop2000、臺(tái)式離心機(jī)；
實(shí)驗(yàn)準(zhǔn)備：將proteasek粉末加入適量的proteasedissolvebuffer溶解至濃度為20mg/ml的酶解液，proteasek干粉可在2-8℃保存一年，但溶解的proteasek需分裝保存于-20℃，且反復(fù)凍融proteasek會(huì)影響其活性。
本實(shí)施例所述口腔拭子dna提取方法，具體包括如下步驟：
(1)用剪刀將拭子頭部分從其桿上剪入2.0ml離心管中，加入500μlbufferatl裂解液和20ulproteinasek酶解液溶液，渦旋15sec混勻，并置于干式恒溫器于56℃加熱處理40min，其間每10min渦旋混勻，且混勻的時(shí)間不低于15s；
加入500μlbufferal緩沖液，渦旋15sec混勻，并于70℃放置處理10min，此時(shí)溶液應(yīng)變清亮；
加入500μl無(wú)水乙醇，渦旋15s混勻，并簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴，然后擠壓去除拭子，得到dna酶解液；
(2)把hipurednaminicolumni裝在2ml收集管中，并轉(zhuǎn)移750ul混合液(包括沉淀)至柱子中，10000×g離心處理1minn；
倒棄濾液，并把柱子裝回收集管中，同時(shí)轉(zhuǎn)移剩余混合液(包括沉淀)至柱子中，10000×g離心處理1min，并棄去濾液和收集管；
把處理后的柱子裝在新的收集管中，加入500ulbuffergw1(已用乙醇稀釋)漂洗液至柱子上，10000×g離心處理1min；
倒棄濾液，把柱子裝在新的收集管中，加入650ulbuffergw2(已用乙醇稀釋)漂洗液至柱子上，10000×g離心處理1min；
倒棄濾液，把柱子裝回收集管中，10000×g離心2min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除，以避免漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、pcr等)實(shí)驗(yàn)；
(3)將漂洗后的柱子裝在新的1.5ml離心管中，并加入50μl已提前預(yù)熱至70℃的ddh2o(ph8.0)至柱子的膜中央，于70℃干式恒溫器(k30)中恒溫處理5min，10000×g離心處理1min；
將離心得到的洗脫溶液再加入至hipurednaminicolumn中，室溫下放置2min，10000×g離心2min；
(4)丟棄所述dna結(jié)合柱，收集所得洗脫溶液，即為含dna母液；將所得dna母液保存于2-8℃，若長(zhǎng)期保存需保存于-20℃；或者將所述dna母液加水稀釋，稀釋液4℃保存，母液放-20℃下保存。
實(shí)施例2
本實(shí)施例所述口腔拭子dna提取方法，具體包括如下步驟：
(1)用剪刀將拭子頭部分從其桿上剪入2.0ml離心管中，加入400μlbufferatl裂解液和15ulproteinasek酶解液溶液，渦旋15sec混勻，并置于干式恒溫器于50℃加熱處理40min，其間每10min渦旋混勻，且混勻的時(shí)間不低于15s；
加入400μlbufferal緩沖液，渦旋15sec混勻，并于60℃放置處理10min，此時(shí)溶液應(yīng)變清亮；
加入400μl無(wú)水乙醇，渦旋15s混勻，并簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴，然后擠壓去除拭子，得到dna酶解液；
(2)把hipurednaminicolumni裝在2ml收集管中，并轉(zhuǎn)移500ul混合液(包括沉淀)至柱子中，10000×g離心處理1minn；
倒棄濾液，并把柱子裝回收集管中，同時(shí)轉(zhuǎn)移剩余混合液(包括沉淀)至柱子中，10000×g離心處理1min，并棄去濾液和收集管；
把處理后的柱子裝在新的收集管中，加入400ulbuffergw1(已用乙醇稀釋)漂洗液至柱子上，10000×g離心處理1min；
倒棄濾液，把柱子裝在新的收集管中，加入600ulbuffergw2(已用乙醇稀釋)漂洗液至柱子上，10000×g離心處理1min；
倒棄濾液，把柱子裝回收集管中，10000×g離心2min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除，以避免漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、pcr等)實(shí)驗(yàn)；
(3)將漂洗后的柱子裝在新的1.5ml離心管中，并加入20μl已提前預(yù)熱至60℃的ddh2o(ph7.0)至柱子的膜中央，于60℃干式恒溫器(k30)中恒溫處理5min，10000×g離心處理1min；
將離心得到的洗脫溶液再加入至hipurednaminicolumn中，室溫下放置2min，10000×g離心2min；
(4)丟棄所述dna結(jié)合柱，收集所得洗脫溶液，即為含dna母液；將所得dna母液保存于2-8℃，若長(zhǎng)期保存需保存于-20℃。
實(shí)施例3
本實(shí)施例所述口腔拭子dna提取方法，具體包括如下步驟：
(1)用剪刀將拭子頭部分從其桿上剪入2.0ml離心管中，加入600μlbufferatl裂解液和25ulproteinasek酶解液溶液，渦旋15sec混勻，并置于干式恒溫器于60℃加熱處理40min，其間每10min渦旋混勻，且混勻的時(shí)間不低于15s；
加入600μlbufferal緩沖液，渦旋15sec混勻，并于80℃放置處理10min，此時(shí)溶液應(yīng)變清亮；
加入600μl無(wú)水乙醇，渦旋15s混勻，并簡(jiǎn)短離心以去除管蓋內(nèi)壁的液滴，然后擠壓去除拭子，得到dna酶解液；
(2)把hipurednaminicolumni裝在2ml收集管中，并轉(zhuǎn)移750ul混合液(包括沉淀)至柱子中，10000×g離心處理1minn；
倒棄濾液，并把柱子裝回收集管中，同時(shí)轉(zhuǎn)移剩余混合液(包括沉淀)至柱子中，10000×g離心處理1min，并棄去濾液和收集管；
把處理后的柱子裝在新的收集管中，加入600ulbuffergw1(已用乙醇稀釋)漂洗液至柱子上，10000×g離心處理1min；
倒棄濾液，把柱子裝在新的收集管中，加入700ulbuffergw2(已用乙醇稀釋)漂洗液至柱子上，10000×g離心處理1min；
倒棄濾液，把柱子裝回收集管中，10000×g離心2min，將吸附柱中殘余的漂洗液去除，以避免漂洗液中乙醇的殘留會(huì)影響后續(xù)的酶反應(yīng)(酶切、pcr等)實(shí)驗(yàn)；
(3)將漂洗后的柱子裝在新的1.5ml離心管中，并加入100μl已提前預(yù)熱至80℃的ddh2o(ph8.5)至柱子的膜中央，于80℃干式恒溫器(k30)中恒溫處理5min，10000×g離心處理1min；
將離心得到的洗脫溶液再加入至hipurednaminicolumn中，室溫下放置2min，10000×g離心2min；
(4)丟棄所述dna結(jié)合柱，收集所得洗脫溶液，即為含dna母液；將所得dna母液保存于2-8℃，若長(zhǎng)期保存需保存于-20℃。
實(shí)施例4試劑盒
本實(shí)施例所述口腔拭子dna提取試劑盒，包括：
hipurednaminicolumni結(jié)合柱；
本實(shí)施例所述口腔拭子dna提取試劑盒的使用方法，包括如下步驟：
(1)取口腔拭子的頭端部位置于離心管內(nèi)，加入所述裂解液和酶解液，于50-60℃充分混勻進(jìn)行處理；隨后加入所述緩沖液，于60-80℃靜置反應(yīng)至溶液變清亮，并加入所述無(wú)水乙醇混勻，固液分離后收集液體部分，即為dna酶解液；
(2)把所述hipurednaminicolumni裝在收集管中，加入部分所述dna酶解液混勻，離心并棄濾液；
把處理后的dna結(jié)合柱裝回收集管中，并加入剩余dna酶解液，離心并棄濾液和收集管；
把所述hipurednaminicolumni裝入新的收集管中，加入所述第一漂洗液混勻，離心并棄濾液；
把所述hipurednaminicolumni裝入新的收集管中，加入所述第二漂洗液混勻，離心并棄濾液；
把所述結(jié)合柱裝回收集管中，離心并收集所述hipurednaminicolumni結(jié)合柱；
(3)將處理后的結(jié)合柱裝在新的離心管中，加入預(yù)熱至60-80℃的所述ddh2o至柱子的膜中央，并于60-80℃恒溫洗脫處理；離心并得到的洗脫溶液再加入至hipurednaminicolumn中，室溫下放置2min，離心洗脫液；
(4)收集所得洗脫液，即為所需的含dna母液，保存?zhèn)溆谩?/p>
本實(shí)施例所述試劑盒置于室溫(15-25℃)干燥條件下，可保存12個(gè)月，更長(zhǎng)時(shí)間的保存可置于2-8℃。若所述試劑盒在2-8℃保存條件下，若溶液產(chǎn)生沉淀，使用前應(yīng)將試劑盒內(nèi)的溶液在室溫放置一段時(shí)間，必要時(shí)可在37℃水浴中預(yù)熱10min，以溶解沉淀。若緩沖液中有沉淀，可在37℃水浴中重新溶解，搖勻后使用。
實(shí)施例5試劑盒
本實(shí)施例所述口腔拭子dna提取試劑盒，包括：
hipurednaminicolumni結(jié)合柱；
本實(shí)施例所述口腔拭子dna提取試劑盒的使用方法同實(shí)施例4。
實(shí)施例6試劑盒
本實(shí)施例所述口腔拭子dna提取試劑盒，包括：
hipurednaminicolumni結(jié)合柱；
本實(shí)施例所述口腔拭子dna提取試劑盒的使用方法同實(shí)施例4。
對(duì)比例
本對(duì)比例所述口腔拭子dna提取方法同實(shí)施例1，其區(qū)別僅在于，所述步驟(3)中，以現(xiàn)有技術(shù)一般洗脫液bufferae在常溫下進(jìn)行洗脫處理。
實(shí)驗(yàn)例
分別按照實(shí)施例1和對(duì)比例1中方法，對(duì)同一批口腔拭子樣本進(jìn)行dna提取處理，并記錄各項(xiàng)參數(shù)于下表1。
表1口腔拭子dna提取結(jié)果
從上表數(shù)據(jù)可知，本發(fā)明所述口腔拭子dna提取方法，在dna結(jié)合柱提純處理后，以ddh2o為洗脫液，并在60-80℃條件下加熱處理有助于進(jìn)一步提高dna的得率和質(zhì)量，同時(shí)有效節(jié)省了dna的提取時(shí)間。
以上對(duì)本發(fā)明實(shí)施例進(jìn)行了詳細(xì)介紹，本文中應(yīng)用了具體個(gè)例對(duì)本發(fā)明的原理及實(shí)施方式進(jìn)行了闡述，以上實(shí)施例的說(shuō)明只是用于幫助理解本發(fā)明的方法及其核心思想；同時(shí)，對(duì)于本領(lǐng)域的一般技術(shù)人員，依據(jù)本發(fā)明的思想，在具體實(shí)施方式及應(yīng)用范圍上均會(huì)有改變之處，綜上所述，本說(shuō)明書內(nèi)容不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。