本發(fā)明屬于生物工程技術領域，尤其涉及一種日本醫(yī)蛭唾液腺細胞的原代培養(yǎng)方法。
背景技術：
隨著生命科學的迅速發(fā)展，不論對于整個生物工程技術，還是其中之一的生物克隆技術來說，細胞培養(yǎng)都是一個必不可少的過程，并推動著細胞生物學、分子生物學、生物化學等領域的發(fā)展。日本醫(yī)蛭(hirudonipponia)屬環(huán)節(jié)動物門，有環(huán)帶亞門，蛭綱，無吻蛭目，醫(yī)蛭科，醫(yī)蛭屬。據(jù)統(tǒng)計，分布在全世界的蛭類動物共有600多種，分布在我國的也有近100種。它們在江河、濕潤的陸地以及田間生活，有的以取食魚、蛙、水鳥及牛、馬、人這樣一些哺乳動物的血液為生，也有的靠取食蚯蚓、蝦、螺、蚌之類的無脊椎動物的體液、組織以至整個身體而得以生存。以吸食哺乳動物血液為生，唾液腺分泌物中含有水蛭素等多種生物活性物質并且在醫(yī)藥上具有廣闊應用前景的蛭類動物在國際上被統(tǒng)稱為醫(yī)學蛭類。研究發(fā)現(xiàn)，醫(yī)學蛭類唾液腺分泌物中含有多種活性物質：水蛭素、水蛭透明質酸酶、安替斯塔辛、麻醉劑、血管擴張劑、前列腺素等。而日本醫(yī)蛭作為天然水蛭素的重要來源之一，具有降血脂、保護心腦血管、抗凝血和抗腫瘤等功效，具有“軟黃金”之稱，更是具有重要的研究意義。目前國內(nèi)國際上獲取水蛭素的方法主要有兩種，一種是直接從醫(yī)蛭的唾液腺部位分離提取出天然水蛭素或者用精氨酸等刺激醫(yī)蛭使其分泌唾液腺分泌，再使用特殊裝置收集唾液，通過這種方法得到的天然水蛭素產(chǎn)量極小，耗費成本較高；另一種是通過基因工程的方法合成重組水蛭素，雖然在臨床上與天然水蛭素的差異并不大，但是抗凝活性低，抗凝血作用的特異性會受到重組水蛭素濃度的影響，純度高抗凝血作用也相應較高，因此，臨床上對天然水蛭素需求很大。
綜上所述，現(xiàn)有技術存在的問題是：目前獲取水蛭素的方法存在水蛭素產(chǎn)量極小，耗費成本較高，抗凝活性低的缺點。
技術實現(xiàn)要素：
針對現(xiàn)有技術存在的問題，本發(fā)明提供了一種日本醫(yī)蛭唾液腺細胞的原代培養(yǎng)方法。
本發(fā)明是這樣實現(xiàn)的，一種日本醫(yī)蛭唾液腺細胞的原代培養(yǎng)方法，所述日本醫(yī)蛭唾液腺細胞的原代培養(yǎng)方法包括將剪碎后的組織塊接種于25cm2的細胞封閉培養(yǎng)瓶中，加入5mlsfx-inscet昆蟲細胞培養(yǎng)基，置于生化培養(yǎng)箱中29℃靜止培養(yǎng)。
進一步，所述接種之前需要：
步驟一，用水去除日本醫(yī)蛭身體表面的粘稠狀分泌物。清除干凈之后，先放于0.3％高錳酸鉀溶液中浸泡，再放入酒精溶液中浸泡，對日本醫(yī)蛭進行消毒處理；
步驟二，在超凈工作臺內(nèi)，將經(jīng)過體表滅菌的日本醫(yī)蛭轉移到裝有pbs緩沖液的一次性無菌培養(yǎng)皿中，pbs緩沖液浸沒日本醫(yī)蛭，用經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的手術剪刀和鑷子取下日本醫(yī)蛭的前端頭部；
步驟三，將頭部轉移到另一個裝有pbs緩沖液的一次性無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，pbs緩沖液將其浸沒，將日本醫(yī)蛭的前端頭部沿著口咽中部剪開，去除咽壁內(nèi)表皮和外部皮膚，并用pbs漂洗；
步驟四，將唾液腺置于酒精溶液中浸泡后，迅速將其轉移至三個各裝有pbs緩沖液(含800u/ml的青霉素/鏈霉素/兩性霉素混合溶液)的器皿中各浸泡，并在第三個裝有pbs緩沖液(含800u/ml的青霉素/鏈霉素/兩性霉素混合溶液)的培養(yǎng)皿中，將其剪成組織塊。
進一步，所述步驟一中先放于0.3％高錳酸鉀溶液中浸泡10min，再放入10％酒精溶液中浸泡10min，對日本醫(yī)蛭進行消毒處理。
進一步，所述步驟四中將唾液腺置于75％酒精溶液中浸泡5-7s后，迅速將其轉移至三個各裝有1mlpbs緩沖液(含800u/ml的青霉素/鏈霉素/兩性霉素混合溶液)的器皿中各浸泡5min。
進一步，所述步驟四中剪成0.5mm3-1mm3大小的組織塊。
本發(fā)明的另一目的在于提供一種利用所述日本醫(yī)蛭唾液腺細胞的原代培養(yǎng)方法培養(yǎng)的日本醫(yī)蛭。
本發(fā)明的優(yōu)點及積極效果為：進行日本醫(yī)蛭唾液腺細胞原代培養(yǎng)方法、培養(yǎng)基種類、抗生素種類和濃度等的選擇篩選試驗，建立日本醫(yī)蛭原代細胞培養(yǎng)體系，實現(xiàn)醫(yī)學蛭類唾液腺細胞的原代培養(yǎng)，以進一步實現(xiàn)傳代培養(yǎng)。若日本醫(yī)蛭唾液腺細胞體外培養(yǎng)能夠實現(xiàn)，并且能夠達到傳代培養(yǎng)，天然水蛭素獲取方式——從體外培養(yǎng)的日本醫(yī)蛭唾液腺細胞中直接提取分離，始終維持較高水平的抗凝活性，并且大大提高天然水蛭素的產(chǎn)量，其產(chǎn)量明顯高于直接從醫(yī)蛭的唾液腺部位分離提取天然水蛭素以及用精氨酸等刺激醫(yī)蛭使其分泌唾液腺分泌再收集唾液的現(xiàn)有方法。極少量的野生日本醫(yī)蛭唾液腺細胞進行體外細胞培養(yǎng)后就能得到大量的唾液腺細胞，分離提取出大量天然水蛭素，有利于野生日本醫(yī)蛭種群的保護，達到既深度開發(fā)利用又大力保護動物種質資源的目標。采用本發(fā)明對日本醫(yī)蛭唾液腺細胞進行了原代培養(yǎng)，取得了較好的培養(yǎng)效果。
本發(fā)明快速、有效、重復性強，是對蛭類細胞培養(yǎng)的完善，為蛭類細胞原代培養(yǎng)的研究提供可靠的試驗數(shù)據(jù)與基礎。
附圖說明
圖1是本發(fā)明實施例提供的日本醫(yī)蛭唾液腺細胞的原代培養(yǎng)方法流程圖。
具體實施方式
為了使本發(fā)明的目的、技術方案及優(yōu)點更加清楚明白，以下結合實施例，對本發(fā)明進行進一步詳細說明。應當理解，此處所描述的具體實施例僅僅用以解釋本發(fā)明，并不用于限定本發(fā)明。
下面結合附圖對本發(fā)明的應用原理作詳細的描述。
本發(fā)明從rpmi1640培養(yǎng)基、sfx-inscet昆蟲細胞培養(yǎng)基、m199培養(yǎng)基這3種培養(yǎng)基中篩選出最合適的培養(yǎng)基sfx-inscet昆蟲細胞培養(yǎng)基；從卡那霉素、新霉素、鏈霉素、硫酸慶大霉素、青霉素/鏈霉素/兩性霉素b混合溶液、氨芐青霉素6種抗生素中篩選出最適合的抗生素青霉素/鏈霉素/兩性霉素b混合溶液；對青霉素/鏈霉素/兩性霉素b進行濃度梯度試驗，篩選出最適合的濃度800u/ml；從而初步篩選出最適合日本醫(yī)蛭細胞原代培養(yǎng)的培養(yǎng)體系。
如圖1所示，本發(fā)明實施例提供的日本醫(yī)蛭唾液腺細胞的原代培養(yǎng)方法包括以下步驟：
s101：用水去除日本醫(yī)蛭身體表面的粘稠狀分泌物。清除干凈之后，先放于0.3％高錳酸鉀溶液中浸泡10min，再放入10％酒精溶液中浸泡10min，對日本醫(yī)蛭進行消毒處理；
s102：在超凈工作臺內(nèi)，將經(jīng)過體表滅菌的日本醫(yī)蛭轉移到裝有pbs緩沖液的一次性無菌培養(yǎng)皿中，pbs緩沖液浸沒日本醫(yī)蛭，用經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的手術剪刀和鑷子取下日本醫(yī)蛭的前端頭部；
s103：將頭部轉移到另一個裝有pbs緩沖液的一次性無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，pbs緩沖液將其浸沒，將日本醫(yī)蛭的前端頭部沿著口咽中部剪開，去除咽壁內(nèi)表皮和外部皮膚，并用pbs漂洗；
s104：將唾液腺置于75％酒精溶液中浸泡5-7s后，迅速將其轉移至三個各裝有1mlpbs緩沖液(含800u/ml的青霉素/鏈霉素/兩性霉素混合溶液)的器皿中各浸泡5min，并在第三個裝有pbs緩沖液(含800u/ml的青霉素/鏈霉素/兩性霉素混合溶液)的培養(yǎng)皿中，將其剪成0.5mm3-1mm3大小左右的組織塊；
s105：將剪碎后的組織塊接種于25cm2的細胞封閉培養(yǎng)瓶中，加入sfx-inscet昆蟲細胞培養(yǎng)液，置于生化培養(yǎng)箱中29℃靜止培養(yǎng)。
下面結合試驗對本發(fā)明的應用效果作詳細的描述。
試驗具體的步驟如下：
步驟一，用水去除日本醫(yī)蛭身體表面的粘稠狀分泌物。清除干凈之后，先放于0.3％高錳酸鉀溶液中浸泡10min，再放入10％酒精溶液中浸泡10min，對日本醫(yī)蛭進行消毒處理；
步驟二，在超凈工作臺內(nèi)，將經(jīng)過體表滅菌的日本醫(yī)蛭轉移到裝有pbs緩沖液的一次性無菌培養(yǎng)皿中，pbs緩沖液浸沒日本醫(yī)蛭，用經(jīng)過高溫高壓滅菌處理的手術剪刀和鑷子取下日本醫(yī)蛭的前端頭部；
步驟三，將頭部轉移到另一個裝有pbs緩沖液的一次性無菌培養(yǎng)皿內(nèi)，pbs緩沖液將其浸沒，將日本醫(yī)蛭的前端頭部沿著口咽中部剪開，去除咽壁內(nèi)表皮和外部皮膚，并用pbs漂洗；
步驟四，將唾液腺置于75％酒精溶液中浸泡5-7s后，迅速將其轉移至三個各裝有1mlpbs緩沖液(含800u/ml的青霉素/鏈霉素/兩性霉素混合溶液)的器皿中各浸泡5min，并在第三個裝有pbs緩沖液(含800u/ml的青霉素/鏈霉素/兩性霉素混合溶液)的培養(yǎng)皿中，將其剪成0.5mm3-1mm3大小左右的組織塊；
步驟五，原代培養(yǎng)培養(yǎng)基種類的篩選：將剪碎后的組織塊接種于25cm2的細胞封閉培養(yǎng)瓶中，分三組，分別加入不同種類的培養(yǎng)基(培養(yǎng)基體積5ml)，置于生化培養(yǎng)箱中29℃靜止培養(yǎng)，7d后更換一半的培養(yǎng)液，并添加20％的滅活標準胎牛血清；結果在rpmi1640培養(yǎng)基中進行的原代細胞培養(yǎng)，接種培養(yǎng)第2天，肉眼觀察到組織塊多貼附于壁底，在顯微鏡下可以看到剪碎的組織塊大小不一，形態(tài)多樣，邊緣呈現(xiàn)為較為明亮的亮帶，培養(yǎng)液澄清沒有雜質；接種培養(yǎng)第3-4天，肉眼觀察到組織塊貼附于壁底，培養(yǎng)液澄清，顯微鏡下觀察到培養(yǎng)液中有少量黑色雜質；接種培養(yǎng)第5天，肉眼觀察培養(yǎng)液渾濁，白色透明培養(yǎng)基略微變黃，污染物呈點狀分布，倒置顯微鏡下觀察到大量黑色細沙狀雜質污染，細胞無生長跡象。在m199培養(yǎng)基中進行的原代細胞培養(yǎng)，接種培養(yǎng)第2-3天，肉眼觀察組織塊一半未貼壁，培養(yǎng)液澄清，倒置顯微鏡下觀察到組織大小不一，形態(tài)多樣，邊緣呈現(xiàn)為較為明亮的亮帶，培養(yǎng)液沒有雜質；接種培養(yǎng)4-5天，大半組織塊仍未貼壁，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)液澄清，細胞無生長跡象；接種培養(yǎng)第6-7天左右，培養(yǎng)基顏色變淡渾濁，肉眼觀察到培養(yǎng)液中浮起一層白色的網(wǎng)紗狀的污染物。在sfx-inscet昆蟲細胞培養(yǎng)基中進行原代細胞培養(yǎng)，接種培養(yǎng)第2-3天，肉眼觀察到組織塊多貼附于壁底，倒置顯微鏡下觀察到組織大小不一，形態(tài)多樣，邊緣呈現(xiàn)為較為明亮的亮帶，接種培養(yǎng)第3-4天，倒置顯微鏡下觀察培養(yǎng)液依舊澄清，細胞暫無生長跡象；接種培養(yǎng)第5-6天，從組織塊周緣游離出少量細胞，細胞形態(tài)為圓形，透明。
步驟六，原代培養(yǎng)抗生素種類的篩選：將剪碎后的組織塊接種于25cm2的細胞封閉培養(yǎng)瓶中，加入步驟s105中最優(yōu)的培養(yǎng)基后，分成六組，分別加入不同種類相同濃度(200u/ml)的抗生素/pbs緩沖液的混合溶液，置于生化培養(yǎng)箱中29℃靜止培養(yǎng)；結果比較在同一種培養(yǎng)基(即sfx-inscet昆蟲細胞培養(yǎng)基)中經(jīng)過同一濃度200u/ml不同抗生素種類的處理后的原代細胞生長存活及污染狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過青霉素/鏈霉素/兩性霉素b混合溶液浸泡處理過后的組織塊原代培養(yǎng)時存活時間最長，保持培養(yǎng)液不被污染的時間也最長。
步驟七，原代培養(yǎng)抗生素濃度的篩選：將剪碎后的組織塊接種于25cm2的細胞封閉培養(yǎng)瓶中，加入步驟s105中最優(yōu)的培養(yǎng)基后，分成六組，分別加入不用濃度、步驟s106中最優(yōu)的抗生素，置于生化培養(yǎng)箱中29℃靜止培養(yǎng)；結果比較在同一種培養(yǎng)基中經(jīng)過同一種抗生素溶液(即“三抗”溶液)浸泡處理但是抗生素濃度不同的原代細胞生長存活及污染狀態(tài)，發(fā)現(xiàn)在經(jīng)過抗生素濃度為800u/ml(即抗生素：pbs緩沖液＝800u：1ml)的濃度下，細胞污染狀態(tài)最小，細胞存活時間最長，并觀察到有新細胞生長的情況。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例而已，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)所作的任何修改、等同替換和改進等，均應包含在本發(fā)明的保護范圍之內(nèi)。