本發(fā)明涉及分子生物學(xué)及生物檢測技術(shù)領(lǐng)域，涉及一種用于檢測德爾卑沙門氏菌的靶基因、特異性引物對(duì)及檢測方法和試劑盒。

背景技術(shù)：

德爾卑沙門氏菌(salmonelladerby)是引起人類感染的主要沙門氏菌血清型之一，此血清型菌株的主要宿主為人類。德爾卑沙門氏菌可存活在畜禽體內(nèi)，一旦畜禽的糞便或攜帶此病菌的生肉污染了食品及加工場所，在溫度適宜的環(huán)境下，此菌就會(huì)迅速的生長繁殖，當(dāng)菌數(shù)在食品中達(dá)到一定數(shù)量，被食用后就會(huì)造成食物中毒，危害人的身心健康，嚴(yán)重者甚至危及生命。鄭華英、周敦金等在2003年《一起德爾卑沙門氏菌污染水源引起的腸道傳染病暴發(fā)流行的調(diào)查》中顯示，武漢市一個(gè)村莊因?yàn)轱嬘昧宋唇?jīng)消毒的井水后，陸續(xù)出現(xiàn)了上吐下瀉、腹痛發(fā)熱等癥狀，隨后檢驗(yàn)人員進(jìn)行了取樣檢驗(yàn)分析，發(fā)現(xiàn)該次事故是由于德爾卑沙門氏菌感染而引起。謝春平等在2013年《合肥地區(qū)五類食品沙門氏菌污染情況調(diào)查分析》中發(fā)現(xiàn)，合肥地區(qū)常見五類食品(生肉、水產(chǎn)品、鹵菜、乳制品、發(fā)酵豆制品)的沙門氏菌污染調(diào)查表明，在以上食品中共檢測出沙門氏菌22株，其中德爾卑沙門菌占到45.6％。國家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局的2002年第25和26號(hào)令中明確規(guī)定沙門氏菌為必檢項(xiàng)目。目前，隨著分子生物學(xué)的不斷發(fā)展尤其是聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)的發(fā)展，通過分子技術(shù)檢測鑒定沙門氏菌血清型變得更加可靠。

現(xiàn)有技術(shù)中，德爾卑沙門氏菌檢測主要使用傳統(tǒng)的培養(yǎng)方法，整個(gè)檢測過程步驟較多，時(shí)間較長，一般需要4-6個(gè)工作日，而且干擾的因素較多，檢測結(jié)果的判定較復(fù)雜，給食品檢測帶來非常不利的影響。而且用于德爾卑沙門氏菌的pcr檢測的靶基因研究較少且主要是由于沒有合適的檢測靶點(diǎn)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)不足，本發(fā)明提供一種用于檢測德爾卑沙門氏菌的靶基因、特異性引物對(duì)及檢測方法和試劑盒，解決了現(xiàn)有技術(shù)中德爾卑沙門氏菌檢測結(jié)果判定復(fù)雜、檢測周期長的技術(shù)問題。

為實(shí)現(xiàn)以上目的，本發(fā)明通過以下技術(shù)方案予以實(shí)現(xiàn)：

一種用于檢測德爾卑沙門氏菌的靶基因，ru61_00441、ru61_00445、ru61_00447、ru61_rs09205、ru61_rs06985，ru61_00441具有如seqidno.1所示的核苷酸序列或其特異性片段，ru61_00445具有如seqidno.2所示的核苷酸序列或其特異性片段，ru61_00447具有如seqidno.3所示的核苷酸序列或其特異性片段，ru61_rs09205具有如seqidno.4所示的核苷酸序列或其特異性片段，ru61_rs06985具有如seqidno.5所示的核苷酸序列或其特異性片段。

用于擴(kuò)增所述靶基因的特異性引物對(duì)，所述特異性引物對(duì)分別為：sd1、sd2、sd3、sd11和sd12，其中，

sd1-f：核苷酸序列如seqidno.6所示、sd1-r：核苷酸序列如seqidno.7所示；

sd2-f：核苷酸序列如seqidno.8所示、sd2-r：核苷酸序列如seqidno.9所示；

sd3-f：核苷酸序列如seqidno.10所示、sd3-r：核苷酸序列如seqidno.11所示；

sd11-f：核苷酸序列如seqidno.12所示、sd3-11：核苷酸序列如seqidno.13所示；

sd12-f：核苷酸序列如seqidno.14所示、sd12-r：核苷酸序列如seqidno.15所示。

一種檢測德爾卑沙門氏菌的方法，包括以下步驟：

s1、提取樣品dna，pcr擴(kuò)增；

s2、凝膠電泳檢測擴(kuò)增產(chǎn)物；

s3、比較電泳后條帶，若在171bp、164bp、512bp、608bp和296bp位置有條帶，則樣品中含有德爾卑沙門氏菌。

優(yōu)選的，所述凝膠電泳后171bp位置分離出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.1所示；164bp位置分離出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.2所示；512bp位置分離出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.3所示；608bp位置分離出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.4所示；296bp位置分離出的dna片段，其核苷酸序列如seqidno.5所示。

優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增過程中，25μl包含有2×master12.5μl，10μm引物對(duì)1μl，模板取1-5μl，補(bǔ)ddh2o至25μl。

優(yōu)選的，所述pcr擴(kuò)增過程的反應(yīng)程序?yàn)椋?4℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，35個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

優(yōu)選的，所述凝膠電泳采用瓊脂糖凝膠電泳。

優(yōu)選的，以25μlpcr反應(yīng)體系計(jì)量，對(duì)于權(quán)利要求2所述的sd1、sd2、sd3、sd11和sd12引物，需要德爾卑沙門氏菌總dna濃度≥2.685ng/μl。

一種用于檢測德爾卑沙門氏菌的試劑盒，所述試劑盒包括所述的特異性引物對(duì)。

一種所述的靶基因或所述的特異性引物對(duì)或所述的試劑盒在檢測德爾卑沙門氏菌中的應(yīng)用。

本發(fā)明提供一種用于檢測德爾卑沙門氏菌的靶基因、特異性引物對(duì)及檢測方法和試劑盒，與現(xiàn)有技術(shù)相比優(yōu)點(diǎn)在于：

本發(fā)明通過基因組比較分析獲得德爾卑沙門氏菌的特異性檢測靶基因，從而通過特異性引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增、電泳檢測該目的基因，本發(fā)明檢測結(jié)果準(zhǔn)確，檢測過程簡單，檢測周期短，實(shí)現(xiàn)了德爾卑沙門氏菌高特異性快速檢測的目的；

本發(fā)明提供檢測德爾卑沙門氏菌的5個(gè)特異性靶基因、相應(yīng)的pcr引物對(duì)、利用以上引物對(duì)和靶基因進(jìn)行檢測，特異性引物對(duì)是根據(jù)5個(gè)德爾卑沙門氏菌特異性檢測靶點(diǎn)設(shè)計(jì)而成，該特異性檢測靶點(diǎn)穩(wěn)定高、特異性強(qiáng)，通過合理優(yōu)化pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系，凝膠電泳檢測手段，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定出德爾卑沙門氏菌；

采用本發(fā)明的檢測方法可直接鑒定德爾卑沙門氏菌，不需要血清型實(shí)驗(yàn)，檢測時(shí)間縮短在12h以內(nèi)，并且，由于檢測過程無需采用傳統(tǒng)檢測方法中必須使用的抗血清，可降低檢測成本，本發(fā)明通過pcr檢測特異性dna片段，具有單一性強(qiáng)，檢測結(jié)果可靠，結(jié)果判定簡單的特點(diǎn)，能夠廣泛應(yīng)用于食品衛(wèi)生領(lǐng)域。

附圖說明

圖1為本發(fā)明特異性引物對(duì)sd1、sd2、sd3、sd11和sd12對(duì)不同菌種特異性評(píng)價(jià)凝膠電泳結(jié)果圖；

圖2為本發(fā)明特異性引物對(duì)sd1、sd2、sd3、sd11和sd12對(duì)不同模板濃度靈敏度評(píng)價(jià)凝膠電泳結(jié)果圖。

圖中1號(hào)引物為sd1特異性引物對(duì)；2號(hào)引物為sd2特異性引物對(duì)；3號(hào)引物為sd3特異性引物對(duì)；11號(hào)引物為sd11特異性引物對(duì)；12號(hào)引物為sd12特異性引物對(duì)；

1、ddh2o；2、德爾卑沙門氏菌；3、豬霍亂沙門氏菌；4、乙型副傷寒沙門氏菌；5、丙型副傷寒沙門氏菌；6、湯普遜沙門氏菌；7、亞利桑那沙門氏菌；8、都柏林沙門氏菌；9、鴨沙門氏菌；10、波斯坦沙門氏菌；11、阿伯丁沙門氏菌；12、s.病牛沙門氏菌；13、山夫頓堡沙門氏菌；14、火雞沙門氏菌；15、甲型副傷寒沙門氏菌；16、倫敦沙門氏菌；17、鼠傷寒沙門氏菌；18、腸炎沙門氏菌；19、布雷德沙門氏菌；20、達(dá)喀爾沙門氏菌；21、伊斯特本沙門氏菌；22、邁阿密沙門氏菌；23、阿貢納沙門氏菌；24、巴森海德沙門氏菌；25、蒙特維的亞沙門氏菌；26、耶路撒冷沙門氏菌；27、波恩沙門氏菌；28、布倫登魯普沙門氏菌；29、圣保羅沙門氏菌；30、海德爾堡沙門氏菌；31、肯塔基沙門氏菌；32、布洛克利沙門氏菌；33、博納恩沙門氏菌；34、旺茲沃斯沙門氏菌；35、阿德萊德沙門氏菌。

具體實(shí)施方式

為使本發(fā)明實(shí)施例的目的、技術(shù)方案和優(yōu)點(diǎn)更加清楚，下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明實(shí)施例中的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。

實(shí)施例1：

pcr檢測方法對(duì)不同菌種特異性評(píng)價(jià)

1、德爾卑沙門氏菌血清型特異性基因的篩選

在ncbi數(shù)據(jù)庫中獲得了德爾卑沙門氏菌cvm40386菌株(nz_jyym01000031)的全基因組序列，根據(jù)比較基因組的方法將該菌基因組的每個(gè)基因利用ncba網(wǎng)站的blast程序進(jìn)行比對(duì)，選擇與該血清型同源性較高(e值＝0,qμerycover＝0％)同時(shí)與其它微生物的同源性很低(qμerycover＜10％)的基因作為德爾卑沙門氏菌的準(zhǔn)特異性基因。通過該方法共獲得12個(gè)德爾卑沙門氏菌的準(zhǔn)特異性基因，再針對(duì)每一個(gè)基因設(shè)計(jì)多對(duì)引物，利用實(shí)驗(yàn)室保存的沙門氏菌其它血清型進(jìn)行特異性驗(yàn)證。根據(jù)pcr結(jié)果，確定ru61_00441、ru61_00445、ru61_00447、ru61_rs09205、ru61_rs06985基因作為德爾卑沙門氏菌血清型特異性的檢測靶點(diǎn)，基因序列分別如seqidno.1、seqidno.2、seqidno.3、seqidno.4和seqidno.5所示。

2、引物設(shè)計(jì)

通過primer5.0軟件設(shè)計(jì)引物，設(shè)置gc％范圍在40-60％，產(chǎn)物大小范圍為100-1000bp，從備選引物對(duì)中選擇出引物，5對(duì)特異性引物對(duì)：sd1、sd2、sd3、sd11和sd12，核苷酸序列分別為sd1-f：seqidno.6、sd1-r：seqidno.7；sd2-f：seqidno.8、sd2-r：seqidno.9；sd3-f：seqidno.10、sd3-r：seqidno.11；sd11-f：seqidno.12、sd11-r：seqidno.13；sd12-f：seqidno.14、sd12-r：seqidno.15；委托上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司合成。

3、dna模板的制備

將包括德爾卑沙門氏菌(salmonelladerby)等46株沙門氏菌標(biāo)準(zhǔn)菌株和18株非沙門氏菌(如表1)(編號(hào)為cicc的菌株購自于中國工業(yè)微生物菌種保藏中心，編號(hào)為cmcc的菌株購自于中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心，無編號(hào)的為實(shí)驗(yàn)室自己保藏的菌株，如果其他同行出于研究需要，本試驗(yàn)室愿意提供該菌株)的各個(gè)血清型分別接種到30ml的lb液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)8h。分別取1ml各菌菌懸液于1.5ml離心管中，12000r/min，離心1min，棄上清。用500μl滅菌的純水洗滌菌體沉淀兩次，再用100μl滅菌純水溶解沉淀。在沸水浴中煮沸10min，12000r/min，離心1min，取上清液作為pcr模板。

4、pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立

建立pcr檢測體系：25μl反應(yīng)體系包含：2×master12.5μl，10μm引物對(duì)1μl，模板取1μl，補(bǔ)ddh2o至25μl。

設(shè)定pcr的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。于pcr儀中按照既定的反應(yīng)體系和反應(yīng)程序分別以上述步驟中提取的各菌菌株dna為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，以做凝膠電泳進(jìn)行檢測。

5、凝膠電泳檢測

將上述進(jìn)行pcr擴(kuò)增后的產(chǎn)物和作為marker的ds2000dna、ddh2o按照既定的順序分別取6μl加到1％的瓊脂糖凝膠中，用150v電壓跑40min后，goldview染色后觀察結(jié)果。

pcr凝膠檢測結(jié)果如圖1、表1和表2，以包括德爾卑沙門氏菌(salmonelladerby)在內(nèi)的37株沙門氏菌dna作為模板，pcr擴(kuò)增后僅有德爾卑沙門氏菌在171bp、164bp、512bp、608bp和296bp出現(xiàn)特異性電泳條帶；為更好說明本發(fā)明的特異性，以不同來源的沙門氏菌共46株和18株非沙門氏菌(表1和表2中，其中“*”代表分離株，其它為標(biāo)準(zhǔn)菌株)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，凝膠電泳得到結(jié)果如表1所述。電泳結(jié)果在171bp、164bp、512bp、608bp和296bp位置出現(xiàn)擴(kuò)增條帶時(shí)，證明為陽性結(jié)果，以“+”表示；當(dāng)該位置沒有擴(kuò)增條帶，證明為陰性結(jié)果，以“—”表示；從表1也可以看出，經(jīng)過該方法pcr擴(kuò)增，僅德爾卑沙門氏菌(salmonelladerby)出現(xiàn)陽性反應(yīng)。結(jié)果很好地說明了本發(fā)明提供的方法穩(wěn)定性高，特異性強(qiáng)，適用范圍廣，檢測結(jié)果準(zhǔn)確。

實(shí)施例2：

pcr檢測方法對(duì)不同模板濃度靈敏度評(píng)價(jià)

德爾卑沙門氏菌血清型特異性基因的篩選、引物設(shè)計(jì)步驟如實(shí)施例1。

dna模板的制備：挑取德爾卑沙門氏菌單菌落轉(zhuǎn)接到30ml的lb液體培養(yǎng)基中，37℃過夜培養(yǎng)。以上海生工生物工程技術(shù)服務(wù)有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌基因組dna小量提取試劑盒，提取德爾卑沙門氏菌總dna，經(jīng)測定，濃度為265.8ng/μl。用無菌水作10倍梯度稀釋，共稀釋7個(gè)梯度，作為pcr模板。

pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系的建立：建立pcr檢測體系：25μl反應(yīng)體系包含：2×master12.5μl，10μm引物對(duì)1μl，模板取5μl，補(bǔ)ddh2o至25μl。設(shè)計(jì)pcr的反應(yīng)程序：94℃預(yù)變性10min，94℃變性30s，60℃退火30s，72℃延伸45s，30個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。

取上述步驟中6個(gè)梯度dna模板各取1μl加入pcr反應(yīng)體系，于pcr儀上進(jìn)行反應(yīng)擴(kuò)增。取6μlpcr擴(kuò)增產(chǎn)物到1％的瓊脂糖凝膠中，用150v電壓跑40min后，goldview染色后觀察結(jié)果。

針對(duì)于sd1、sd2、sd3、sd11和sd12引物對(duì)從第1到第3泳道

171bp、164bp、512bp、608bp和296bp處均有條帶顯示，第3泳道相

應(yīng)的濃度為2.658ng/μl，電泳結(jié)果如圖2(圖2中m為dnaladderi；

模板濃度2-10為265.85ng/μl、26.59ng/μl、2.69ng/μl、268.59pg/μl、

26.86pg/μl、2.69pg/μl、268.59fg/μl、26.86fg/μl和2.69fg/μl)所示。因

此，判定對(duì)于171bp、164bp、512bp、608bp和296bp引物的pcr檢

測靈敏度為2.658ng/μl。

表1特異性評(píng)價(jià)所用的菌株及檢測結(jié)果

表2特異性評(píng)價(jià)所用的菌株及檢測結(jié)果

綜上所述，本發(fā)明通過基因組比較分析獲得德爾卑沙門氏菌的特異性檢測靶基因，從而通過特異性引物對(duì)進(jìn)行pcr擴(kuò)增、電泳檢測該目的基因，本發(fā)明檢測結(jié)果準(zhǔn)確，檢測過程簡單，檢測周期短，實(shí)現(xiàn)了德爾卑沙門氏菌高特異性快速檢測的目的；

本發(fā)明提供檢測德爾卑沙門氏菌的5個(gè)特異性靶基因、相應(yīng)的pcr引物對(duì)、利用以上引物對(duì)和靶基因進(jìn)行檢測，特異性引物對(duì)是根據(jù)5個(gè)德爾卑沙門氏菌特異性檢測靶點(diǎn)設(shè)計(jì)而成，該特異性檢測靶點(diǎn)穩(wěn)定高、特異性強(qiáng)，通過合理優(yōu)化pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系，凝膠電泳檢測手段，可以快速、準(zhǔn)確地鑒定出德爾卑沙門氏菌；

采用本發(fā)明的檢測方法可直接鑒定德爾卑沙門氏菌，不需要血清型實(shí)驗(yàn)，檢測時(shí)間縮短在12h以內(nèi)，并且，由于檢測過程無需采用傳統(tǒng)檢測方法中必須使用的抗血清，可降低檢測成本，本發(fā)明通過pcr檢測特異性dna片段，具有單一性強(qiáng)，檢測結(jié)果可靠，結(jié)果判定簡單的特點(diǎn)。

以上實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的精神和范圍。