本發(fā)明屬于動(dòng)物遺傳育種技術(shù)領(lǐng)域。更具體地，涉及一種雞卷羽性狀主效基因的區(qū)間位點(diǎn)方法及應(yīng)用。

背景技術(shù)：

卷羽雞，又稱麒麟雞、翻毛雞，是產(chǎn)于粵西一帶的特色雞種，據(jù)宋代學(xué)者周去非所著《嶺外代答》一書記載，至今已有840多年歷史。該雞種部分皮膚裸露，散熱性能良好，是一個(gè)適合熱帶高溫環(huán)境飼養(yǎng)的特色肉雞品種。羽毛作為禽類一個(gè)重要的外貌特征，其獨(dú)特的卷羽性狀與片羽（正常羽）具有顯著差異，因此有必要對(duì)卷羽性狀進(jìn)行基因定位及其分子機(jī)制研究。

國(guó)外學(xué)者認(rèn)為，對(duì)卷羽性狀是α-keratin（krt75）基因的保守區(qū)域在dna序列的缺失導(dǎo)致羽毛的羽軸不能夠形成，本發(fā)明人課題組通過克隆卷羽麒麟雞krt75基因序列與pcr擴(kuò)增直接測(cè)序法測(cè)序krt75缺失處外顯子5和6區(qū)間都發(fā)現(xiàn)不存在缺失，說明麒麟雞的卷羽性狀可能與krt75基因的變異無關(guān)，因此有必要對(duì)卷羽性狀主效基因進(jìn)行定位研究。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是克服上述現(xiàn)有技術(shù)的缺陷和不足，提供一種雞卷羽性狀主效基因的區(qū)間位點(diǎn)方法及應(yīng)用。

本發(fā)明的目的是提供一種決定麒麟雞卷羽性狀的基因位點(diǎn)及其應(yīng)用。

本發(fā)明另一目的是提供雞卷羽性狀主效基因的區(qū)間位點(diǎn)方法及應(yīng)用。

本發(fā)明的上述目的是通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)的：

一種決定麒麟雞卷羽性狀的基因位點(diǎn)，所述卷羽性狀主效基因位于chr33:1.19～1.52mb區(qū)間。

優(yōu)選地，所述卷羽性狀主效基因位于chr33:1.19～1.39mb區(qū)間。

更優(yōu)選地，所述卷羽性狀主效基因位于chr:33:1295046～1295060區(qū)間。

卷羽是家禽羽型中重要的一種類型，有利于雞體表的散熱，適合熱帶或我國(guó)南方地區(qū)飼養(yǎng)，對(duì)于抗熱應(yīng)激雞種的培育有著重要的作用，可利用卷羽性狀主效基因通過基因工程技術(shù)培育卷羽雞新品種。因此，上述基因位點(diǎn)在禽類遺傳育種中的應(yīng)用亦在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

優(yōu)選地，所述應(yīng)用為在培育卷羽雞新品種中的應(yīng)用。

一種雞卷羽主效基因的區(qū)間定位方法，包括如下步驟：

s1.以純系的卷羽雞和片羽雞為親本，正反交得f1代；f1代間避免全同胞和半同胞的交配方式得到f2代資源群體；

s2.對(duì)f2代資源群體不用羽型的數(shù)量檢驗(yàn)分析，得到卷羽遺傳特性；

s3.根據(jù)資源群體特點(diǎn)選取測(cè)序樣本，使用簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)，將獲得的序列比對(duì)到雞基因組上，得到高質(zhì)量的snps；

s4.將snps結(jié)合樣本個(gè)體的羽毛性狀表型和遺傳關(guān)系進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，得到卷羽性狀目標(biāo)染色體區(qū)間。

優(yōu)選地，步驟s1所述平羽雞為懷鄉(xiāng)雞。

優(yōu)選地，步驟s1所述親本中公母比例為1：8～10。

優(yōu)選地，步驟s2所述遺傳特性為統(tǒng)計(jì)資源群體不同羽型數(shù)量，卡方適合性檢驗(yàn)f2代不同羽型的數(shù)量比例。

優(yōu)選地，步驟s3簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)獲得的序列數(shù)據(jù)需經(jīng)過過濾和質(zhì)控。

優(yōu)選地，步驟s4中所述關(guān)聯(lián)分析是通過病例對(duì)照研究（case-control_study）進(jìn)行的。

具體地，步驟s4所述關(guān)聯(lián)分析的標(biāo)準(zhǔn)為：分析比較雞f2代中卷羽和片羽樣本中檢測(cè)到的snps頻率差異，尋找關(guān)聯(lián)分析中極顯著和顯著的snps，達(dá)到全基因組顯著水平的snps所在染色體區(qū)間即為卷羽性狀目標(biāo)染色體區(qū)間。

具體地，作為一種可參考的分析案例，當(dāng)所述分析對(duì)象為實(shí)施例所述的麒麟雞和懷鄉(xiāng)雞時(shí)，步驟s4所述關(guān)聯(lián)分析的標(biāo)準(zhǔn)為：

分析在卷羽和片羽樣本中檢測(cè)到snp頻率的差異結(jié)果和曼哈頓圖；當(dāng)p值小于6.193e-18的snp位點(diǎn)達(dá)到全基因組顯著水平，小于3.75e-21的snp位點(diǎn)達(dá)到全基因組極顯著水平；33個(gè)snp達(dá)到全基因組顯著水平，卷羽性狀目標(biāo)染色體區(qū)間定位于chr33:1.19～1.52mb區(qū)間

目前已存在的參照基因組序列把雞作為一種重要的模式生物去理解基因組進(jìn)化、群體遺傳、表型特征的遺傳基礎(chǔ)，由于鳥綱之間聯(lián)系緊密，對(duì)雞表型變化的分子和遺傳基礎(chǔ)的闡明對(duì)應(yīng)用于其他野生鳥類有著重要意義，因而，對(duì)雞的遺傳和基因組研究可以為鳥類的發(fā)展和進(jìn)化提供信息。本發(fā)明為揭示禽類卷羽性狀的基因定位和分子機(jī)制提供了參考，為禽類卷羽新品種的培育提供了基礎(chǔ)。

因此上述卷羽性狀主效基因區(qū)間定位的方法在禽類遺傳育種中的應(yīng)用也在本發(fā)明保護(hù)范圍內(nèi)。

優(yōu)選地，所述應(yīng)用為在培育卷羽雞新品種中應(yīng)用。

本發(fā)明具有以下有益效果：

（1）本發(fā)明有效地利用了小樣本資源群體樣本進(jìn)行g(shù)bs測(cè)序，大大節(jié)省了成本，同時(shí)達(dá)到了預(yù)期實(shí)驗(yàn)?zāi)康模?yàn)證了卷羽性狀遺傳特性，定位了卷羽性狀主效基因染色體區(qū)間。

（2）本發(fā)明為培育卷羽雞特色新品種提供了理論依據(jù)，對(duì)進(jìn)一步研究卷羽形成的分子機(jī)制具有重要意義，同時(shí)為國(guó)內(nèi)卷羽雞卷羽性狀主效基因的定位奠定了基礎(chǔ)。

附圖說明

圖1為f2代資源群里構(gòu)建圖。

圖2為本發(fā)明gbs測(cè)序技術(shù)流程圖。

圖3為本發(fā)明卷羽和片羽樣本檢測(cè)到snp頻率的差異結(jié)果和曼哈頓圖。

圖4為本發(fā)明卷羽性狀主效基因的缺失位點(diǎn)圖；k為麒麟雞，h為懷鄉(xiāng)雞，g為貴妃雞，b2-k為前期研究測(cè)序卷羽雞基因缺失位點(diǎn)所用的混合樣本。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合說明書附圖和具體實(shí)施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明，但實(shí)施例并不對(duì)本發(fā)明做任何形式的限定。除非特別說明，本發(fā)明采用的試劑、方法和設(shè)備為本技術(shù)領(lǐng)域常規(guī)試劑、方法和設(shè)備。

除非特別說明，以下實(shí)施例所用試劑和材料均為市購。

實(shí)施例1麒麟雞卷羽性狀的主效基因-候選角蛋白基因的區(qū)間定位

1、分別選用純系的麒麟雞和懷鄉(xiāng)雞公雞各2只，母雞各16只，麒麟雞(k)♂×懷鄉(xiāng)雞(h)♀（kh)為正交組，懷鄉(xiāng)雞♂×麒麟雞♀（hk）為反交組，按照1：8公母交配比例，得到f1代，f1代間正交組與正交組間，反交組與反交組間避免全同胞和半同胞的交配方式建立f2代資源群體，公母按照1：8～10交配比例，得到f2代（其構(gòu)建圖如圖1所示）。

2、f1代由2個(gè)正交組家系和2個(gè)反交組家系組成，正交群體127只，反交群體139只，均為半卷羽性狀，無公母差異和外顯率不同，f2代卷羽、半卷羽和片羽雞數(shù)量為：113、241和132，此f2代三種雞比例經(jīng)x2檢驗(yàn)符合孟德爾單基因分離遺傳定律，驗(yàn)證了卷羽性狀基因f是一個(gè)質(zhì)量性狀基因。

3、從本資源群體中選取f2代數(shù)量多的家系，對(duì)選取的家系采集全部f2代卷羽和片羽雞，及其父母本f1代血液，選取家系數(shù)量為f1代：父本5只、母本13只，f2代：全卷28只，片羽29只，共計(jì)75個(gè)樣進(jìn)行g(shù)bs測(cè)序，其測(cè)序流程如圖2所示。

將基于75個(gè)樣品gbs簡(jiǎn)化基因組建庫的illuminahiseq測(cè)序平臺(tái)雙末端測(cè)序，共獲得約1463.8mreads原始序列數(shù)據(jù)，q20（原始數(shù)據(jù)的堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99%以上的堿基所占百分比）和q30（原始數(shù)據(jù)的堿基識(shí)別準(zhǔn)確率在99.9%以上的堿基所占百分比）平均分別達(dá)到98.05%和95.14%，個(gè)別樣品可能由于樣本dna差異reads數(shù)較少，接著數(shù)據(jù)過濾質(zhì)控可消除此不準(zhǔn)確性，過濾后高質(zhì)量序列平均reads為18,518,1966，高質(zhì)量reads占下機(jī)reads的百分比達(dá)到94.8%，此下機(jī)測(cè)序數(shù)據(jù)質(zhì)量還是較高的，沒有出現(xiàn)特別大的差異性。各樣本高質(zhì)量的reads與參考基因組（gallus_gallus-5.0）相比，mapped比例基本在95%以上，進(jìn)一步驗(yàn)證了質(zhì)控后測(cè)序數(shù)據(jù)的可用性，采用stacks軟件包中的pstacks，對(duì)比對(duì)至參考基因組同一位置的reads進(jìn)行聚類，聚類后，同一個(gè)stack代表一個(gè)酶切位點(diǎn)，稱之為一個(gè)loci或標(biāo)簽，標(biāo)簽的平均測(cè)序深度為25，每個(gè)樣本至少被1條reads覆蓋的堿基數(shù)量占基因組總堿基數(shù)量的比例至少為4.5%，保證了snpcalling的準(zhǔn)確性和可靠性。

4、在卷羽和片羽樣本中檢測(cè)到snp頻率的差異結(jié)果和曼哈頓圖，其結(jié)果如圖3所示：p值小于6.193e-18的snp位點(diǎn)達(dá)到全基因組顯著水平，小于3.75e-21的snp位點(diǎn)達(dá)到全基因組極顯著水平，33個(gè)snp達(dá)到全基因組顯著水平，卷羽性狀目標(biāo)染色體區(qū)間定位于chr33:1.19～1.52mb區(qū)間，此區(qū)間包括了14個(gè)角蛋白基因，這14個(gè)角蛋白基因?qū)⒋藚^(qū)間縮減到chr33:1.19～1.39mb范圍。

5、驗(yàn)證gbs測(cè)序結(jié)果

以ensemble數(shù)據(jù)庫中收錄的krt75、krt75l2、krt75l4、krt6a、krt5基因序列設(shè)計(jì)引物，一代直接測(cè)序法測(cè)序。

一代測(cè)序結(jié)果驗(yàn)證了gbs測(cè)序結(jié)果的可靠性，15個(gè)snps位點(diǎn)與簡(jiǎn)化基因組測(cè)序獲得的snp一致。結(jié)果如圖4所示，krt75l4基因有15bp(chr:33:1295046-1295060)缺失，且僅在卷羽中檢測(cè)到有15bp缺失，在片羽懷鄉(xiāng)雞和貴妃雞中均未出現(xiàn)缺失。此15bp缺失位于編碼區(qū)，編碼了纈氨酸-亮氨酸-脯氨酸-丙氨酸-絲氨酸5個(gè)氨基酸，認(rèn)為可能與卷羽形成有關(guān)，成為最可能候選因素。

本測(cè)序技術(shù)的開發(fā)，所建資源群體成為具有良好的研究材料。

本測(cè)序技術(shù)的開發(fā)，為簡(jiǎn)化基因組測(cè)序技術(shù)在家禽基因組測(cè)序上的首次應(yīng)用，為以后其他性狀的定位具有重要參考價(jià)值。

上述實(shí)施方式僅為本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施方式，不能以此來限定本發(fā)明保護(hù)的范圍，本領(lǐng)域的技術(shù)人員在本發(fā)明的基礎(chǔ)上所做的任何非實(shí)質(zhì)性的變化及替換均屬于本發(fā)明所要求保護(hù)的范圍。