本發(fā)明屬于微生物發(fā)酵領域，具體涉及一種增加γ-聚谷氨酸發(fā)酵液溶氧的方法。
背景技術：
：γ-聚谷氨酸是由l-谷氨酸或者d-谷氨酸通過γ-酰胺基結合形成的一種水溶性的生物高分子聚合物。具有很強的吸水性，可降解性，水解性等眾多特性，因此被廣泛用于食品、農業(yè)、醫(yī)藥、綠化以及水處理等多個領域，具有極大的開發(fā)價值和應用前景。γ-聚谷氨酸的制備方法有化學合成、生物提取和微生物發(fā)酵三種方法。微生物發(fā)酵法比前兩種方法的生產成本低，生產過程對環(huán)境的污染小，所以現在主要采用微生物發(fā)酵法生產γ-聚谷氨酸，主要生產菌是芽孢桿菌屬的菌株，包括各種(納豆)枯草芽孢桿菌、地衣芽孢桿菌、炭疽芽孢桿菌、解淀粉芽孢桿菌等。微生物發(fā)酵生產γ-聚谷氨酸分為固態(tài)發(fā)酵和液態(tài)發(fā)酵，目前γ-聚谷氨酸發(fā)酵以液體發(fā)酵為主。液體發(fā)酵過程中隨著發(fā)酵時間的延長，發(fā)酵液粘度逐漸增加，氧氣的傳質系數及氧氣的利用率逐漸降低，溶氧不足進而影響發(fā)酵的進行，氧限制已成為影響γ-聚谷氨酸液體發(fā)酵的一個重要因素，嚴重制約了γ-聚谷氨酸發(fā)酵產量的提高。鄒水洋等(公開號cn102533885a)采用向發(fā)酵培養(yǎng)基中補加nacl，通過降低發(fā)酵液粘度進而增加發(fā)酵液中的溶氧，在添加3％～6％的nacl后γ-聚谷氨酸產量較對照提高10％～40％，最高產量達到29.76g/l。但該專利方法只適用于高鹽耐受菌株，對絕大部分鹽度耐受度不高的菌株不具有適用性。李海軍等(公開號cn103881954a)在枯草芽孢菌株frd518染色體上重組整合了透明顫菌的血紅蛋白基因(vgb)，并成功高效表達透明顫菌血紅蛋白vhb，顯著提高了重組枯草芽孢桿菌低溶氧條件下對氧的利用率，重組后菌株γ-聚谷氨酸產量達到65g/l較原始菌株提高了147％，但基因工程菌株的遺傳不穩(wěn)定性以及基因工程菌株安全問題等因素也限制了基因工程菌株在發(fā)酵制備γ-聚谷氨酸上的應用。因此，亟需開發(fā)一種能針對所有γ-聚谷氨酸發(fā)酵增加發(fā)酵液溶解氧的普適方法。技術實現要素：本發(fā)明的目的是提供一株生產γ-聚谷氨酸的菌株。為實現上述發(fā)明目的，本發(fā)明所采用的技術方案是：一株解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)jx-6，保藏編號為：cgmccno.13715；該菌株保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)；保藏單位地址：北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號，中國科學院微生物研究所，郵編：100101；保藏日期為：2017年03月01日。本發(fā)明從大醬樣品中篩選得到，該菌性狀特征如下：1)、形態(tài)特征：該菌在lb培養(yǎng)基中的營養(yǎng)細胞為桿狀，革蘭氏陽性，長2～3μm、寬0.7～0.9μm；在37℃培養(yǎng)3～5天形成芽孢，芽孢大小0.4～0.6×0.8～1.5μm，為長圓形或圓柱形。2)、培養(yǎng)性質：該菌在牛肉膏蛋白胨瓊脂培養(yǎng)基平板培養(yǎng)：30～40℃培養(yǎng)1天可大量生長，菌落表面凸起，光滑無褶皺，菌落透明，邊緣呈規(guī)則圓形，菌落粘性大，挑起有絲狀。該菌在e型發(fā)酵培養(yǎng)基瓊脂平板培養(yǎng)：30～40℃培養(yǎng)1d可大量生長，菌落表面凸起、中心凹陷，表面不光滑有褶皺，菌落白色半透明，邊緣不規(guī)則，菌落表面有液滴，菌落粘性大，挑起有拉絲狀。3)、分子生物學鑒定：提取菌株全基因組dna，pcr擴增16srdna片段，測序，測序結果在ncbi中進行比對，比對結果顯示該菌株為解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)。4)、生理生化性質：如下表所示：表一.jx-6菌部分生理生化特性注：“+”表示反應為陽性；“-”表示反應為陰性。本發(fā)明的另一個目的是提供一種具有普適性的增加γ-聚谷氨酸發(fā)酵液溶氧的方法。一種增加γ-聚谷氨酸發(fā)酵液溶氧的方法，包括如下步驟：將解淀粉芽孢桿菌jx-6接種于已滅菌的斜面活化培養(yǎng)基，經活化培養(yǎng)得到活化菌種；將所述活化菌種接種于已滅菌冷卻的種子培養(yǎng)基中，經種子液培養(yǎng)得到種子液；將所述種子液接種在發(fā)酵培養(yǎng)基中，發(fā)酵過程中添加固態(tài)氧，發(fā)酵完成后得到發(fā)酵液；對所述發(fā)酵液進行提取、純化、透析除鹽、冷凍干燥制得含γ-聚谷氨酸的成品。優(yōu)選的：所述的斜面活化培養(yǎng)基由蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，nacl5g/l和水組成，ph7.0～7.4；所述的活化培養(yǎng)為30～37℃培養(yǎng)24～48h。優(yōu)選的：所述的種子培養(yǎng)基由蛋白胨10g/l，牛肉膏5g/l，nacl5g/l和水組成，ph7.0～7.4；所述的種子液培養(yǎng)為30～37℃搖瓶培養(yǎng)24～48h。優(yōu)選的：所述的發(fā)酵培養(yǎng)基為e型培養(yǎng)基：由檸檬酸10g/l，谷氨酸20g/l，硫酸銨10g/l，甘油80g/l，k2hpo41g/l，mgso4·7h2o0.5g/l，fecl3·6h2o0.02g/l，mnso4·h2o0.1g/l，cacl20.2g/l和水組成，ph7.0。優(yōu)選的：所述的發(fā)酵培養(yǎng)中，將所述種子液按體積分數2％～10％接種量接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中，在30～37℃搖瓶培養(yǎng)24～48h；然后將固態(tài)氧以溶液狀態(tài)加入培養(yǎng)基中，添加至固態(tài)氧在發(fā)酵液中的濃度為50～500μmol/l，繼續(xù)搖瓶培養(yǎng)至96h，終止發(fā)酵。優(yōu)選的：所述的發(fā)酵培養(yǎng)中添加的固態(tài)氧為na2co4和cao2中的一種或兩者的混合物。優(yōu)選的：所述的固態(tài)氧在發(fā)酵液中的濃度為200～400μmol/l。優(yōu)選的：所述的提取是用硫酸調節(jié)發(fā)酵液ph至3.0，于4800r/min下離心30min去除菌體；所述的純化是向提取的上清液中加入3倍體積的預冷無水乙醇，4℃靜置過夜，離心得γ-聚谷氨酸粗品沉淀；所述的透析除鹽是用適量的去離子水溶解粗品，調節(jié)ph值為3～4，用透析袋進行脫鹽；所述的冷凍干燥是對透析液進行真空冷凍干燥。本發(fā)明具有以下有益效果：普適性強，操作簡單、成本低廉、無二次污染、對菌株無耐受性要求、便于大規(guī)模應用于生產，具有良好的應用前景。具體來說，本發(fā)明通過在發(fā)酵液中菌體生長進入穩(wěn)定期后加入固態(tài)氧，增加了發(fā)酵液的溶氧量，這樣在發(fā)酵液變粘后加入既保證了發(fā)酵液中有足夠量的菌體，又通過固態(tài)氧分解釋放出氧氣解除了氧限制，為后續(xù)γ-聚谷氨酸的合成提供了有利環(huán)境，使γ-聚谷氨酸產量提高。相較于未添加固態(tài)氧的方法，本發(fā)明可以將γ-聚谷氨酸產量提高近60％。本發(fā)明采用的解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)jx-6于2017年03月01日保藏在中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心(cgmcc)，保藏編號為：cgmccno.13715。具體實施方式下面具體提供優(yōu)選的實施例，以使本領域技術人員更加清楚本發(fā)明的技術方案和效果，但本發(fā)明的實施方式不限于此。實施例一1.制備培養(yǎng)基：a.活化培養(yǎng)基組分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，瓊脂20g，補水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃滅菌30min。b.種子培養(yǎng)基組分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，補水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃滅菌30min。c.發(fā)酵培養(yǎng)基組分：檸檬酸10g，谷氨酸20g，硫酸銨10g，甘油80g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，fecl3·6h2o0.02g，mnso4·h2o0.1g，cacl20.2g，ph7.0，補水至1000ml，121℃滅菌30min。2.活化菌株、制備種子液：將低溫凍存的解淀粉芽孢桿菌jx-6接種于斜面活化培養(yǎng)基進行活化，37℃培養(yǎng)24h。將活化好的解淀粉芽孢桿菌jx-6接種于種子培養(yǎng)基中，于37℃轉速150r/min搖床培養(yǎng)24h，即得解淀粉芽孢桿菌jx-6的種子培養(yǎng)液。3.發(fā)酵：將上步獲得的種子液分別接入七個搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量8％(v/v)，搖瓶裝液量100ml/500ml，搖床轉速200r/min，在30℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)24h后分別向七個搖瓶中加入已滅菌的10mmol/l的過碳酸鈉(na2co4)溶液0ml、0.5ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，使發(fā)酵液中na2co4濃度分別為0、50、100、200、300、400、500umol/l，繼續(xù)培養(yǎng)至96h，結束發(fā)酵。4.制備成品：a.提取：分別用硫酸調節(jié)七組發(fā)酵液ph至3.0，于4800r/min下離心30min去除菌體。b.純化：在提取得到的七組上清液中分別加入3倍體積的預冷無水乙醇，4℃靜置過夜，離心得七組γ-聚谷氨酸粗品沉淀。c.透析除鹽：分別用適量的去離子水溶解七組粗品，調節(jié)ph值為3～4，用透析袋進行脫鹽。d.冷凍干燥：對七組透析液分別進行真空冷凍干燥，得七組γ-聚谷氨酸成品。5.產品檢測：檢測方法：高效液相色譜法色譜條件：島津lc-20a高效液相色譜，ods-c18柱，紫外檢測器(200nm)，流動相a為乙腈-水1:1(v/v)；流動相b為濃度0.02mol/l的乙酸鈉水溶液,流動相泵比例：30％a，70％b；流速1.0ml/min、柱溫30℃；進樣量：10μl。供試品制備：分別將七組γ-聚谷氨酸成品溶于等量去離子水中，各取2.0ml溶解液放入水解管，再加入3.0ml6mol/l的hcl，110℃真空水解24h，獲得七組γ-pga水解產物作為供試品。用谷氨酸標準品作為對照，對上述供試品進行衍生化hplc分析，檢測γ-聚谷氨酸產量，檢測結果如下表所示：表二不同na2co4添加量下γ-聚谷氨酸產量na2co4添加濃度umol/lγ-聚谷氨酸產量g/l提高率％018.91/5020.9610.8410022.6319.6720024.9531.9430028.6051.2440025.7536.1750024.6230.19由表二可知，添加na2co4后，可有效提高γ-聚谷氨酸的產量，其中在添加至濃度為300umol/l時，γ-聚谷氨酸的最高產量達到28.60g/l，與未添加cao2相比，γ-聚谷氨酸產量提高51.24％。實施例二1.制備培養(yǎng)基：a.活化培養(yǎng)基組分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，瓊脂20g，補水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃滅菌30min。b.種子培養(yǎng)基組分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，補水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃滅菌30min。c.發(fā)酵培養(yǎng)基組分：檸檬酸10g，谷氨酸20g，硫酸銨10g，甘油80g，k2hpo41g，mgso4·7h2o0.5g，fecl3·6h2o0.02g，mnso4·h2o0.1g，cacl20.2g，ph7.0，補水至1000ml，121℃滅菌30min。2.活化菌株、制備種子液：將低溫凍存的解淀粉芽孢桿菌jx-6接種于斜面活化培養(yǎng)基進行活化，35℃培養(yǎng)36h。將活化好的解淀粉芽孢桿菌jx-6接種于種子培養(yǎng)基中，于35℃轉速200r/min搖床培養(yǎng)36h，即得解淀粉芽孢桿菌jx-6的種子培養(yǎng)液。3.發(fā)酵：將上步獲得的種子液分別接入六個搖瓶發(fā)酵培養(yǎng)基中，接種量5％(v/v)，搖瓶裝液量50ml/250ml，搖床轉速200r/min，在35℃下培養(yǎng)。培養(yǎng)36h后分別向六個搖瓶中加入已滅菌的10mmol/l的過氧化鈣(cao2)懸濁液0ml、1.0ml、2.0ml、3.0ml、4.0ml、5.0ml，使發(fā)酵液中cao2濃度分別為0、100、200、300、400、500umol/l，繼續(xù)培養(yǎng)至96h，結束發(fā)酵。4.制備成品：a.提?。悍謩e用硫酸調節(jié)六組發(fā)酵液ph至3.0，于4800r/min下離心30min去除菌體。b.純化：在提取得到的六組上清液中分別加入3倍體積的預冷無水乙醇，4℃靜置過夜，離心得六組γ-聚谷氨酸粗品沉淀。c.透析除鹽：分別用適量的去離子水溶解六組粗品，調節(jié)ph值為3～4，用透析袋進行脫鹽。d.冷凍干燥：對六組透析液分別進行真空冷凍干燥，得六組γ-聚谷氨酸成品。5.產品檢測：檢測方法、色譜條件和供試品制備均與實施例一相同，用谷氨酸標準品作為對照，對上述供試品進行衍生化hplc分析，檢測γ-聚谷氨酸產量，檢測結果如下表所示：表三不同cao2添加量下γ-聚谷氨酸產量cao2添加濃度umol/lγ-聚谷氨酸產量g/l提高率％020.69/10023.0511.4120025.9425.3730029.6543.3140027.6333.5450025.4322.91由表三可知，添加cao2后，可有效提高γ-聚谷氨酸的產量，其中在添加至濃度為300umol/l時，γ-聚谷氨酸的最高產量達到30.14g/l，與未添加cao2相比，γ-聚谷氨酸產量提高43.31％。實施例三1.制備培養(yǎng)基：a.活化培養(yǎng)基組分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，瓊脂20g，補水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃滅菌30min。b.種子培養(yǎng)基組分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，補水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃滅菌30min。c.發(fā)酵培養(yǎng)基組分：檸檬酸50g，谷氨酸100g，硫酸銨50g，甘油400g，k2hpo45g，mgso4·7h2o2.5g，fecl3·6h2o0.1g，mnso4·h2o0.5g，cacl21g，ph7.0，補水至5l，121℃滅菌30min。2.活化菌株、制備種子液：將低溫凍存的解淀粉芽孢桿菌jx-6接種于斜面活化培養(yǎng)基進行活化，37℃培養(yǎng)24h。將活化好的解淀粉芽孢桿菌jx-6接種于種子培養(yǎng)基中，于37℃轉速150r/min搖床培養(yǎng)24h，即得解淀粉芽孢桿菌jx-6的種子培養(yǎng)液。3.發(fā)酵：在10l微生物發(fā)酵罐中加入5l發(fā)酵培養(yǎng)基，將上步獲得的種子液按5％(v/v)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在37℃下培養(yǎng)，通氣量為1(vvm)，攪拌速率400r/min。培養(yǎng)48h后加入na2co4濃縮液，使發(fā)酵液中na2co4濃度為300umol/l，繼續(xù)培養(yǎng)至96h，結束發(fā)酵。4.制備成品：a.提?。河昧蛩嵴{節(jié)發(fā)酵液ph至3.0，于4800r/min下離心30min去除菌體。b.純化：在提取得到的上清液中加入3倍體積的預冷無水乙醇，4℃靜置過夜，離心得γ-聚谷氨酸粗品沉淀。c.透析除鹽：用適量的去離子水溶解粗品，調節(jié)ph值為3～4，用透析袋進行脫鹽。d.冷凍干燥：對透析液進行真空冷凍干燥，得六組γ-聚谷氨酸成品。5.產品檢測：檢測方法、色譜條件和供試品制備均與實施例一相同，用谷氨酸標準品作為對照，對上述供試品進行衍生化hplc分析，檢測γ-聚谷氨酸產量。γ-聚谷氨酸的產量達到38.14g/l，與未添加na2co4相比，γ-聚谷氨酸產量提高56.28％。實施例四1.制備培養(yǎng)基：a.活化培養(yǎng)基組分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，瓊脂18～20g，補水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃滅菌30min。b.種子培養(yǎng)基組分：牛肉膏5g，蛋白胨10g，nacl5g，補水至1000ml，ph7.0～7.4，121℃滅菌30min。c.發(fā)酵培養(yǎng)基組分：檸檬酸300g，谷氨酸600g，硫酸銨300g，甘油2400g，k2hpo430g，mgso4·7h2o15g，fecl3·6h2o0.6g，mnso4·h2o3g，cacl26g，ph7.0，補水至30l，121℃滅菌30min。2.活化菌株、制備種子液：將低溫凍存的解淀粉芽孢桿菌jx-6接種于斜面活化培養(yǎng)基進行活化，37℃培養(yǎng)24h。將活化好的解淀粉芽孢桿菌jx-6接種于種子培養(yǎng)基中，于37℃轉速150r/min搖床培養(yǎng)24h，即得解淀粉芽孢桿菌jx-6的種子培養(yǎng)液。3.發(fā)酵：在50l微生物發(fā)酵罐中加入30l發(fā)酵培養(yǎng)基，將上步獲得的種子液按10％(v/v)的接種量接入發(fā)酵培養(yǎng)基中，在35℃下培養(yǎng)，通氣量為0.8(vvm)，攪拌速率400r/min。培養(yǎng)36h后加入na2co4和cao2的濃縮液，使發(fā)酵液中na2co4濃度為200umol/l、cao2濃度為100umol/l，繼續(xù)培養(yǎng)至96h，結束發(fā)酵。4.制備成品：a.提?。河昧蛩嵴{節(jié)發(fā)酵液ph至3.0，于4800r/min下離心30min去除菌體。b.純化：在提取得到的上清液中加入3倍體積的預冷無水乙醇，4℃靜置過夜，離心得γ-聚谷氨酸粗品沉淀。c.透析除鹽：用適量的去離子水溶解粗品，調節(jié)ph值為3～4，用透析袋進行脫鹽。d.冷凍干燥：對透析液進行真空冷凍干燥，得六組γ-聚谷氨酸成品。5.產品檢測：檢測方法、色譜條件和供試品制備均與實施例一相同，用谷氨酸標準品作為對照，對上述供試品進行衍生化hplc分析，檢測γ-聚谷氨酸產量。γ-聚谷氨酸的產量達到46.62g/l，與未添加cao2和na2co4相比，γ-聚谷氨酸產量提高58.21％。核苷酸或氨基酸序列表sequencelisting<110>中國科學院成都生物研究所<120>一種增加γ-聚谷氨酸發(fā)酵液溶氧的方法<160>1<210>1<211>1491<212>dna<213>解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)<400>1tggctcaggacgaacgctggcggcgtgcctaatacatgcaagtcgagcggacagatggga60gcttgctccctgatgttagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcctgtaag120actgggataactccgggaaaccggggctaataccggatggttgtttgaaccgcatggttc180agacataaaaggtggcttcggctaccacttacagatggacccgcggcgcattagctagtt240ggtgaggtaacggctcaccaaggcaacgatgcgtagccgacctgagagggtgatcggcca300cactgggactgagacacggcccagactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccgca360atggacgaaagtctgacggagcaacgccgcgtgagtgatgaaggttttcggatcgtaaag420ctctgttgttagggaagaacaagtgccgttcaaatagggcggcaccttgacggtacctaa480ccagaaagccacggctaactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgtt540gtccggaattattgggcgtaaagggctcgcaggcggtttcttaagtctgatgtgaaagcc600cccggctcaaccggggagggtcattggaaactggggaacttgagtgcagaagaggagagt660ggaattccacgtgtagcggtgaaatgcgtagagatgtggaggaacaccagtggcgaaggc720gactctctggtctgtaactgacgctgaggagcgaaagcgtggggagcgaacaggattaga780taccctggtagtccacgccgtaaacgatgagtgctaagtgttagggggtttccgcccctt840agtgctgcagctaacgcattaagcactccgcctggggagtacggtcgcaagactgaaact900caaaggaattgacgggggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacg960cgaagaaccttaccaggtcttgacatcctctgacaatcctagagataggacgtccccttc1020gggggcagagtgacaggtggtgcatggttgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggtt1080aagtcccgcaacgagcgcaacccttgatcttagttgccagcattcagttgggcactctaa1140ggtgactgccggtgacaaaccggaggaaggtggggatgacgtcaaatcatcatgcccctt1200atgacctgggctacacacgtgctacaatggacagaacaaagggcagcgaaaccgcgaggt1260taagccaatcccacaaatctgttctcagttcggatcgcagtctgcaactcgactgcgtga1320agctggaatcgctagtaatcgcggatcagcatgccgcggtgaatacgttcccgggccttg1380tacacaccgcccgtcacaccacgagagtttgtaacacccgaagtcggtgaggtaaccttt1440taggagccagccgccgaaggtgggacagatgattggggtgaagtcgtaaca1491當前第1頁12