本發(fā)明涉及一種基于talens基因編輯花生育種方法，屬于農(nóng)業(yè)生物工程
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：花生又名落花生，屬一年生草本植物，是我國重要的油料和經(jīng)濟(jì)作物。我國的花生種植面積和生產(chǎn)總量均居世界前列在國際上具有很強(qiáng)的競爭力。油酸是花生油脂中的主要脂肪酸，因?yàn)橛退峋哂休^好的氧化穩(wěn)定性，從而減少脂質(zhì)氧化，從而解決花生制品在生產(chǎn)和儲(chǔ)存期間由于脂質(zhì)氧化而產(chǎn)生的不良的氣味、口味及貨架期縮短等問題。油酸還是一種單不飽和脂肪酸能降低身體低密度脂蛋白(ldl)水平，維持高密度脂蛋白(hdl)水平。所以高油酸花生不僅可以有效延長花生制品的保質(zhì)期和貨架期，同時(shí)也有益于人們的身體健康。選育高油酸花生新品種是花生育種的重要目標(biāo)之一。目前已知fad2(δ12脂肪酸脫氫酶)是脂肪酸生物合成途徑中催化油酸在第12碳位脫氫，形成雙鍵向亞油酸基轉(zhuǎn)變的關(guān)鍵酶。傳統(tǒng)育種思路是通過自然突變體(如美國篩選出來的f435)或者通過誘變篩選出來的高油酸突變體進(jìn)行雜變，回交改良，這些育種方法都存大育種效率低，時(shí)間較長等缺點(diǎn)?；ㄉ钱愒此谋扼w植物，高油酸花生中fad2a基因起始密碼子后448bp處g:c→a：t的替換使得d150n氨基酸的變異，fad2b基因起始密碼子后442bp處a插入，使得終止密碼子提前出現(xiàn)，從而使得fad2基因的表達(dá)降低或功能喪失。傳統(tǒng)的雜交育種方法需要很難做到精準(zhǔn)突變，并且費(fèi)時(shí)費(fèi)力。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：為了克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，本發(fā)明的目的在于提供一種提高花生油酸的基于talens基因編輯花生育種方法。實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的可以通過采取如下技術(shù)方案達(dá)到：一種基于talens基因編輯花生育種方法，包括以下步驟：1)talens左右臂序列的設(shè)計(jì)：分析花生品種的fad2基因的序列，并設(shè)計(jì)左右臂序列；2)組裝至表達(dá)載體：將步驟1)得到的左右臂序列組裝至植物表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染農(nóng)桿菌，得到含有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌；3)遺傳轉(zhuǎn)化：將步驟2)得到的含有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌遺傳轉(zhuǎn)化至花生種子；4)選育：根據(jù)目標(biāo)性狀選育。作為優(yōu)選，步驟1)中，所述左右臂序列中左臂序列為seqidno.1，右臂序列為seqidno.2。作為優(yōu)選，步驟1)中，所述左右臂序列中左臂序列為seqidno.3，右臂序列為seqidno.4。作為優(yōu)選，步驟2)中，所述表達(dá)載體為pcambia3301或pcambia1301。作為優(yōu)選，步驟3)中，遺傳轉(zhuǎn)化的具體操作為：a)用花生種子制作外植體；b)將含有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種至yep培養(yǎng)基培養(yǎng)，收集菌體，將菌體重懸于含有乙酰丁香酮的液體ms培養(yǎng)基中，得到侵染液；c)將外植體浸浮于侵染液，共培養(yǎng)，得到共培養(yǎng)后外植體。作為優(yōu)選，步驟c)中，共培養(yǎng)前，向侵染液加入0.1wt％的silweetl-77。作為優(yōu)選，步驟4)中，所述目標(biāo)性狀為油酸含量大于60％。本發(fā)明的配方設(shè)計(jì)原理如下：本發(fā)明將已經(jīng)發(fā)布花生的fad2基因序列在ncbi數(shù)據(jù)庫和花生野生種基因庫進(jìn)行比較，為了使得fad2基因失去功能，同時(shí)避開fad2a和fad2b的snp位點(diǎn)，在fad2基因序列的起始密碼子附近，共設(shè)計(jì)以下幾條左右兩臂的識(shí)別序列，通過兩兩組合的方式找到最佳的基因編輯。其中，其中l(wèi)1r1的間隔距離為13bp,l1r2的間隔距離為14bp，l2r1的間隔距離為16bp,l2r2的間隔距離為17bp,l3r1的間隔距離為14bp,l3r2的間隔距離為15bp。本發(fā)明將已經(jīng)發(fā)布花生的fad2基因序列在ncbi數(shù)據(jù)庫和花生野生種基因庫進(jìn)行比較，為了使得fad2基因失去功能，同時(shí)避開fad2a和fad2b的snp位點(diǎn)，在fad2基因序列的起始密碼子附近，共設(shè)計(jì)以下幾條左右兩臂的識(shí)別序列，通過兩兩組合的方式找到最佳的基因編輯。相比現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的有益效果在于：本發(fā)明提供一種能有效提高花生油酸含量的基因編輯方法，該高油酸含量的性狀可穩(wěn)定地遺傳至子代。附圖說明圖1為l1r1為載體編輯粵油7號(hào)的t0代種子油酸含量。圖2為l2r2為載體編輯粵油7號(hào)的t0代種子油酸含量。具體實(shí)施方式下面，結(jié)合附圖以及具體實(shí)施方式，對(duì)本發(fā)明做進(jìn)一步描述：實(shí)施例1：talens左右臂基因的設(shè)計(jì)本發(fā)明將已經(jīng)發(fā)布花生的fad2基因序列在ncbi數(shù)據(jù)庫和花生野生種基因庫進(jìn)行比較，為了使得fad2基因失去功能，同時(shí)避開fad2a和fad2b的snp位點(diǎn)，在fad2基因序列的起始密碼子附近，共設(shè)計(jì)以下三條左臂基因和兩條右臂的識(shí)別序列，如seqidno.1所示的l1、如seqidno.3所示的l2、如seqidno.5所示的l3，如seqidno.2所示的r1和如seqidno.4所示的r2。l1：caaaagaagcctctttl2：gaagctcaaaagaagcctcl3：caaaagaagcctcttr1：ttcaaaccctccattcr2：tcaaaccctccattc再通過兩兩組合的方式找到最佳的基因編輯。其l1和r1組合成l1r1的間隔距離為13bp，l1和r2組合成l1r2的間隔距離為14bp，l2和r1組合成l2r1的間隔距離為16bp，l2和r2組合成l2r2的間隔距離為17bp，l3和r1的組合的成l3r1的間隔距離為14bp，l3和r2組合成l3r2的間隔距離為15bp。實(shí)施例2：克隆至表達(dá)載體通過斯丹賽公司的talenkit試劑盒，將實(shí)施例1得到的talens左右臂序列l(wèi)1r1、l1r2、l2r1、l3r1和l3r2分別進(jìn)行組裝，再分別亞克隆至植物表達(dá)載體，并轉(zhuǎn)染農(nóng)桿菌，挑選陽性菌種，得到含有轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌。實(shí)施例3：遺傳轉(zhuǎn)化a)用花生種子制作外植體：取粵油7號(hào)花生種子，對(duì)花生種子進(jìn)行編號(hào)，設(shè)置對(duì)照組編號(hào)為wt，將花生種子去殼，用蒸餾水沖洗，再在蒸餾水中浸泡30-60分鐘；然后消毒，去種皮，沿子葉間縫隙切開種子，取含胚的半粒種子，再沿胚的子葉節(jié)點(diǎn)切去胚芽，得到待轉(zhuǎn)化的外植體；b)將實(shí)施例2)得到的含有待轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌接種至yep液體培養(yǎng)液中，28℃振蕩培養(yǎng)過夜；將yep液體培養(yǎng)液離心收集農(nóng)桿菌菌體，并將農(nóng)桿菌菌體重懸于含有乙酰丁香酮的液體ms培養(yǎng)基中，得到侵染液；c)將步驟a)得到的待轉(zhuǎn)化的外植體浸浮于步驟b)得到的侵染液中，加入0.1wt％的silweetl-77，侵染10-20分鐘，然后將外植體和侵染液在真空條件下靜置10-20分鐘；取出外植體，濾干菌液后平鋪于共培養(yǎng)培養(yǎng)基中，黑暗培養(yǎng)2-3天；再在光照16h/d的條件下培養(yǎng)7-10天，得到共培養(yǎng)后的外植體；共培養(yǎng)后的外植體的識(shí)別區(qū)的序列的變化情況下表所示，表1l1r1編輯種子識(shí)別區(qū)的序列變化情況表2l2r2編輯種子識(shí)別區(qū)的序列變化情況d)將共培養(yǎng)后的外植體移至滅菌砂土中，培養(yǎng)馴化后，移入溫室中繁殖。實(shí)施例4：油酸檢測收獲實(shí)施例3外植體的t0代種子，檢測實(shí)施例3得到的外植體種子的油酸含量，大于60％的視為陽性株。各talens左右臂的轉(zhuǎn)化株數(shù)、陽性株數(shù)和頻率統(tǒng)計(jì)如下表所示：表3選育結(jié)果統(tǒng)計(jì)利用非破損型紅外檢測儀對(duì)t0代種子進(jìn)行油酸含量檢測，結(jié)果圖1和2所示，通過l1r1和l2r2進(jìn)行編輯fad2基因均可得到高油酸的花生，其中，l2r2的轉(zhuǎn)化率較l1r1要高，這可能與左右臂的間隔距離有關(guān)，在花生中，左右臂間隔距離在14-16bp的距離是不利于剪切酶形成二聚體結(jié)構(gòu)，從而無法編輯花生的fad2基因，而間隔距離為17bp的l2r2的效果比間隔距離為13bp的l1r1要好，其中，314號(hào)油酸含量高達(dá)90％。實(shí)施例5：選育將實(shí)施例4檢測到的油酸含量高于60％的t0代種子進(jìn)行種植，得到t1代種子，利用非破損型的近紅外檢測儀進(jìn)行油酸含量的檢測分析結(jié)果如下：表4t1代種子油酸含量由上表的結(jié)果可知，t1代種子的油酸含量與t0代相比，并未降低，甚至還要高于t0代種子，說明，經(jīng)過本發(fā)明提供的方法進(jìn)行的育種，其高油酸含量的性狀可穩(wěn)定地遺傳。實(shí)施例6：驗(yàn)證將實(shí)施例2得到的含有l(wèi)1r1左右臂序列的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒的農(nóng)桿菌以及含有l(wèi)2r2左右臂序列的轉(zhuǎn)化質(zhì)粒。對(duì)粵油13號(hào)花生種子進(jìn)行基因編輯操作，其t0代種子油酸含量下表所示：表5粵油13號(hào)t0代種子油酸含量樣品號(hào)左右臂序列對(duì)油酸[％]wt無30.941l1r162.785l1r163.318l1r172.9112l1r161.0811l1r169.1913l1r167.2821l2r271.9899l2r262.31將t0代種子進(jìn)行遺傳育種，得到t1代種子，其油酸含量如下表所示：表6粵油13t1代種子油酸含量樣品號(hào)油酸[％]樣品號(hào)油酸[％]樣品號(hào)油酸[％]樣品號(hào)油酸[％]1－163.218－172.2111－270.3213－366.831－262.328－272.3311－369.3221－169.781－363.248－372.3511－468.8921－268.981－462.8712－160.9211－571.2399－164.225－163.1112－261.3211－669.2299－263.785－263.4212－362.2113－166.2399－363.235－363.2311－170.1213－267.3499－462.43將t1代種子編號(hào)8的株系進(jìn)行進(jìn)一步的跟蹤檢測，其t2代種子進(jìn)行近紅外光譜儀的檢測結(jié)果如下表所示：表7粵油13t2代種子油酸含量樣品號(hào)油酸[％]樣品號(hào)油酸[％]樣品號(hào)油酸[％]樣品號(hào)油酸[％]8－1－172.238－1－771.768－2－670.828－3－371.208－1－271.988－1－871.898－2－771.108－3－471.108－1－372.328－2－172.138－2－873.198－3－570.988－1－472.428－2－372.338－2－972.318－3－671.348－1－573.118－2－472.118－3－172.248－3－769.688－1－672.458－2－572.148－3－272.438－3－870.88由以上驗(yàn)證試驗(yàn)可知，l1r1或l2r2作為talens左右臂序列，其能使花生種子的油酸含量大幅增高，且該高油酸性狀具有較好的遺傳穩(wěn)定性。對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來說，可根據(jù)以上描述的技術(shù)方案以及構(gòu)思，做出其它各種相應(yīng)的改變以及變形，而所有的這些改變以及變形都應(yīng)該屬于本發(fā)明權(quán)利要求的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院作物研究所<120>一種基于talens基因編輯花生育種方法<130>一種基于talens基因編輯花生育種方法<160>5<170>patentinversion3.3<210>1<211>16<212>dna<213>人工序列<400>1caaaagaagcctcttt16<210>2<211>16<212>dna<213>人工序列<400>2ttcaaaccctccattc16<210>3<211>19<212>dna<213>人工序列<400>3gaagctcaaaagaagcctc19<210>4<211>15<212>dna<213>人工序列<400>4tcaaaccctccattc15<210>5<211>15<212>dna<213>人工序列<400>5caaaagaagcctctt15當(dāng)前第1頁12