本發(fā)明涉及一株具有抑菌作用的格式乳桿菌及其在治療婦科炎癥中的應(yīng)用，特別是涉及該格式乳桿菌在制備治療陰道炎的藥物中的應(yīng)用，屬于生物醫(yī)藥
技術(shù)領(lǐng)域：
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背景技術(shù)：
：婦科炎癥是婦科門(mén)診常見(jiàn)的疾病，各個(gè)年齡段皆有發(fā)生，世界衛(wèi)生組織(who)發(fā)布的數(shù)據(jù)表明，發(fā)展中國(guó)家90％以上的婦女患有婦科炎癥，中國(guó)女性有70％患有不同程度的生殖道感染，由于醫(yī)療資源、經(jīng)濟(jì)條件、文化知識(shí)的不平衡，使得農(nóng)村已婚婦女?huà)D科炎癥發(fā)病率更高達(dá)95％以上；85％以上的婦女至少患有兩種以上的生殖道疾病。據(jù)統(tǒng)計(jì)，2004年全國(guó)14家，2005年全國(guó)62家，2006年全國(guó)81家醫(yī)院婦科和計(jì)劃生育門(mén)診5萬(wàn)多人的流調(diào)資料顯示，女性所有疾病中婦科感染疾病(陰道炎、盆腔炎、宮頸炎)占到百分之五十五，由此產(chǎn)生的醫(yī)療費(fèi)用每年高達(dá)200多億元。據(jù)此估算，中國(guó)每年至少有2億女性患生殖道感染及相關(guān)疾病，全球數(shù)以萬(wàn)計(jì)的婦女一直被這種陰道病困擾著。生殖道感染具有發(fā)病率高、復(fù)發(fā)率高、流行范圍廣的特點(diǎn)，嚴(yán)重影響女性的身心健康，表現(xiàn)出白帶異常黃綠色，異味(魚(yú)腥味、惡臭味)、瘙癢、灼燒感、下腹部疼痛、性交痛，如果得不到及時(shí)正確的治療，會(huì)上行感染，引起宮頸炎、子宮內(nèi)膜炎、盆腔炎等，導(dǎo)致不孕不育、異位妊娠，孕婦導(dǎo)致流產(chǎn)、死胎、死產(chǎn)、先天感染及新生兒感染等，可使艾滋病(aids)和宮頸癌的發(fā)生風(fēng)險(xiǎn)增加，嚴(yán)重影響女性的身心健康，影響家庭的幸福以及社會(huì)的安定。目前，治療陰道感染的措施主要是運(yùn)用抗生素，抗生素是某些微生物通過(guò)酶促反應(yīng)將初級(jí)代謝產(chǎn)物轉(zhuǎn)變?yōu)榻Y(jié)構(gòu)性的次級(jí)代謝產(chǎn)物?？股夭缓侠淼拇罅渴褂谩E用，加上缺乏嚴(yán)格的監(jiān)管，導(dǎo)致死亡、耐藥微生物及超級(jí)耐藥菌株的產(chǎn)生，抗生素的誤用也置病人于不必要的抗藥性風(fēng)險(xiǎn)中；北京大學(xué)第一醫(yī)院婦產(chǎn)科廖秦平教授在中國(guó)女性陰道微生態(tài)研究進(jìn)展一文中說(shuō)，陰道內(nèi)正常菌群是陰道微生態(tài)研究的核心內(nèi)容，早在1892年，dederlein首次發(fā)表了關(guān)于人類(lèi)陰道微生態(tài)菌群的研究，dederlein認(rèn)為陰道微生物僅有革蘭氏染色陽(yáng)性桿菌構(gòu)成，即乳桿菌。隨著對(duì)陰道菌群研究的不斷深入，發(fā)現(xiàn)正常狀態(tài)下陰道內(nèi)存在著多種微生物，其中，最重要、數(shù)量最多的是乳桿菌，在健康女性的陰道分泌物中分離率高達(dá)50％-80％，現(xiàn)在已確定定植于正常陰道內(nèi)的微生物主要由細(xì)菌、真菌、原蟲(chóng)、病毒、支原體等，這些菌群的存在維持著生態(tài)的平衡并不發(fā)病。在維持陰道生態(tài)平衡中，以產(chǎn)生過(guò)氧化氫(h2o2)的乳桿菌為優(yōu)勢(shì)菌，它能夠產(chǎn)生多種抑菌物質(zhì)，如乳酸、硬脂酸、過(guò)氧化氫等酸化陰道環(huán)境，降低陰道ph、通過(guò)粘附占位保護(hù)、刺激免疫系統(tǒng)等方式抑制病原菌的大量繁殖，在維持陰道的生態(tài)平衡中起著非常重要的作用。陰道生態(tài)平衡一旦被打破或外源病原體侵入，即可導(dǎo)致炎癥發(fā)生。在傳統(tǒng)的抗生素治療過(guò)程中，抗生素在殺死致病菌的同時(shí)也會(huì)把陰道中的優(yōu)勢(shì)菌殺死，使陰道處于少菌或無(wú)菌狀態(tài)，又加上抗生素的使用導(dǎo)致體免疫力下降，一旦遇到病原菌很容易引起感染，二重感染?，F(xiàn)在，抗生素的副作用已被醫(yī)、藥界科學(xué)工作者認(rèn)可，國(guó)家也已逐步限制使用。治療陰道感染除了口服抗生素全身用藥外，還有中醫(yī)中藥的辯證施治，中醫(yī)通過(guò)補(bǔ)氣養(yǎng)血、疏肝理氣、消毒逐瘀、祛濕熱、通經(jīng)絡(luò)等來(lái)全身用藥，但是效果緩慢，難以忍受的瘙癢使人坐臥不寧，很難堅(jiān)持服用中藥來(lái)止癢。目前市面上的外用藥也琳瑯滿目，栓劑、膠囊、酸化洗劑、凝膠劑、中藥熏洗、泡騰片等，據(jù)調(diào)查很多藥物效果不佳，主要是用于抗菌藥物的輔助治療，不能根治，容易反復(fù)，特別是外陰陰道假絲酵母菌病(vvc)、復(fù)發(fā)性念珠陰道病(recurrentvulvovaginalcandidiasis，rvvc)，治療療程長(zhǎng)極易反復(fù)。綜上，抗生素、中醫(yī)中藥及各種外用藥治療陰道感染的效果均不理想，其根源在于沒(méi)有恢復(fù)陰道微生態(tài)的平衡，但由于陰道菌群是一個(gè)大的生態(tài)系統(tǒng)，若盲目的采用外源微生態(tài)制劑進(jìn)行調(diào)節(jié)，很容易引起新發(fā)菌群的失調(diào)。因此，如何通過(guò)調(diào)節(jié)陰道菌群平衡來(lái)治療陰道感染仍是目前的難點(diǎn)所在。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：針對(duì)上述現(xiàn)有技術(shù)，本發(fā)明的目的是提供一株具有抑菌作用的格式乳桿菌及其在婦科炎癥中的應(yīng)用。本發(fā)明以微生態(tài)療法作為指導(dǎo)，從正常健康女性陰道中分離、純化得到一株格式乳桿菌，并與另一株植物乳桿菌一起進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)發(fā)酵，利用其代謝產(chǎn)物與優(yōu)選的中草藥提取物進(jìn)行復(fù)配，從而開(kāi)發(fā)得到無(wú)毒、無(wú)副作用、安全高效的治療婦科炎癥的產(chǎn)品。為實(shí)現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：本發(fā)明的第一方面，提供一株具有抑菌作用的格式乳桿菌，其為格式乳桿菌(lactobacillusgasseri)dfnxc2-0121，已于2017年3月31日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱cctcc)，地址為：中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為cctccno:m2017162。該菌株是從正常健康女性陰道中分離得到的，菌株的生理生化特征為：菌落形態(tài)為乳白色、圓形、片形；革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)芽孢，硝酸鹽還原反應(yīng)、h2o2酶試驗(yàn)陰性，不液化明膠，不產(chǎn)吲哚。本發(fā)明的第二方面，提供一種菌劑，其活性成分為上述格式乳桿菌的發(fā)酵產(chǎn)物。本發(fā)明還提供上述菌劑的制備方法，包括如下步驟：發(fā)酵上述的格式乳桿菌，得到發(fā)酵產(chǎn)物。上述制備方法中，發(fā)酵采用的發(fā)酵培養(yǎng)基為：mrs培養(yǎng)基。上述制備方法中，發(fā)酵的條件為：37℃，靜置培養(yǎng)18-24h。本發(fā)明的第三方面，提供上述格式乳桿菌和/或菌劑在制備治療婦科炎癥的產(chǎn)品中的應(yīng)用。本發(fā)明的第四方面，提供一種益生菌代謝物組合物，所述的益生菌代謝物組合物包含：上述的格式乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物和保藏編號(hào)為cctccno:m2010150的植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物。所述格式乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物中的活菌數(shù)為1.0×108-10.0×108cfu/ml；所述保藏編號(hào)為cctccno:m2010150的植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物中的活菌數(shù)為8.0×108-20.0×108cfu/ml。所述格式乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物和所述保藏編號(hào)為cctccno:m2010150的植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物可以以任意比混合；作為優(yōu)選的方案，所述格式乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物和所述保藏編號(hào)為cctccno:m2010150的植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物以體積比1：1進(jìn)行混合。進(jìn)一步的，上述益生菌代謝物組合物中還可以包含：卡波姆、甘油和薄荷油等組分，并以常規(guī)方法制成凝膠劑等各種藥物劑型。上述益生菌代謝物組合物在制備治療婦科炎癥的產(chǎn)品中的應(yīng)用也是本發(fā)明的保護(hù)范圍。經(jīng)試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，本發(fā)明的益生菌代謝物組合物對(duì)于引起陰道炎的致病菌具有明顯的抑制作用，特別是對(duì)于引起陰道炎的金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和大腸桿菌的抑菌效果更為顯著。上述應(yīng)用中，所述產(chǎn)品包括：功能性食品、保健品、消毒劑和藥品等多種產(chǎn)品形式。本發(fā)明的第五方面，提供一種治療婦科炎癥的中藥益生菌組合物。本發(fā)明的治療婦科炎癥的中藥益生菌組合物，由以下重量份的組分制成：益生菌代謝物組合物30-40份、中藥提取物40-55份；所述中藥提取物是由以下重量份的原料藥制成：黃芩32-40份、苦參25-30份、黃柏6-10份、地膚子4-10份、桑葉4-10份。本發(fā)明的第六方面，提供上述中藥益生菌組合物的制備方法，步驟如下：(1)益生菌代謝物組合物的制備：分別將本發(fā)明的格式乳桿菌和保藏編號(hào)為cctccno:m2010150的植物乳桿菌進(jìn)行活化，將活化后的菌株接種于發(fā)酵培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，至格式乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物的菌體濃度達(dá)到1.0×108-10.0×108cfu/ml，保藏編號(hào)為cctccno:m2010150的植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物的菌體濃度達(dá)到8.0×108-20.0×108cfu/ml，將格式乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物和保藏編號(hào)為cctccm2010150的植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物混合，備用；(2)中藥提取物的制備：將黃芩、苦參、黃柏、地膚子和桑葉混合，加水煎煮，煎煮液濃縮至密度為1.10-1.20g/ml，離心，取上清液，備用；(3)將益生菌代謝組合物和中藥提取物混合均勻，即制備得到中藥益生菌組合物。步驟(1)中，所述發(fā)酵培養(yǎng)基為：mrs培養(yǎng)基；培養(yǎng)條件為：37℃，靜置培養(yǎng)。步驟(2)中，加水煎煮的具體方法為：將黃芩、苦參、黃柏、地膚子和桑葉混合，置于10倍水中浸泡40-60min，煎煮，水開(kāi)后繼續(xù)煎煮50-60min，過(guò)濾得到第一濾液；藥渣用8倍水進(jìn)行二次煎煮，水開(kāi)后繼續(xù)煎煮30-40min，過(guò)濾得到第二濾液與第一濾液混合均勻，通過(guò)真空減壓濃縮中藥液，至藥液的密度為1.10-1.20g/ml，3000轉(zhuǎn)/min離心10min，取上清備用。進(jìn)一步的，本發(fā)明的中藥益生菌組合物還可以結(jié)合藥學(xué)上接受的輔料制備成各種類(lèi)型的產(chǎn)品，包括：功能性食品、保健品、消毒劑和藥品(如：洗劑、凝膠劑和栓劑等)。本發(fā)明的有益效果：(1)本發(fā)明首次從健康女性的陰道中分離、純化得到一株格式乳桿菌，該菌株具有產(chǎn)酸高，產(chǎn)抑菌活性物質(zhì)、抑菌能力強(qiáng)的特點(diǎn)。菌株發(fā)酵后能夠產(chǎn)生酸性物質(zhì)如乳酸、甲酸及硬脂酸等，這些酸性物質(zhì)能夠降低生殖道的ph值，抑制病原菌的生長(zhǎng)；還能產(chǎn)生過(guò)氧化氫，進(jìn)一步的抑制其他菌和致病微生物的生長(zhǎng)。(2)本發(fā)明的益生菌代謝物組合物是由本發(fā)明的格式乳桿菌和保藏編號(hào)為cctccm2010150的植物乳桿菌的發(fā)酵培養(yǎng)物復(fù)配而成，其中，保藏編號(hào)為cctccm2010150的植物乳桿菌記載在專利“一株可用于生物防腐保鮮的乳酸菌及其應(yīng)用”(cn101914475a)中，該乳酸菌原有的作用是防治果皮褐變，降低果實(shí)發(fā)病率。本發(fā)明將該乳酸菌與格式乳桿菌聯(lián)合，發(fā)現(xiàn)這兩株菌配合使用具有顯著的協(xié)同增效作用，對(duì)于引起陰道炎的致病菌具有明顯的抑制作用，特別是對(duì)于引起陰道炎的金黃色葡萄球菌、白色念珠菌和大腸桿菌的抑菌效果更為顯著。(3)本發(fā)明的中藥益生菌制劑是由益生菌代謝物組合物和中藥提取物經(jīng)科學(xué)配伍而成，實(shí)現(xiàn)了益生菌和中藥提取物的完美結(jié)合，經(jīng)過(guò)體外抑菌實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，本發(fā)明的中藥益生菌制劑安全有效，較目前市場(chǎng)現(xiàn)有的產(chǎn)品單純的益生菌產(chǎn)品或單純的中藥產(chǎn)品具有抑菌譜廣、止癢排毒效果更加明顯。其中：中藥提取物具有明顯的抑制金黃色葡萄球菌、白色念珠菌作用，及清熱燥濕、消腫止癢的作用；益生菌能夠抑制大腸桿菌、金黃色葡萄球菌的作用，并能夠酸化陰道的ph，有利于乳桿菌的增值和陰道黏膜修復(fù)，中藥和益生菌的結(jié)合，即具有中藥的治療作用又具有益生菌的調(diào)節(jié)陰道微生態(tài)平衡的作用，并擴(kuò)大了抑菌譜，二者具有協(xié)同作用。經(jīng)試驗(yàn)驗(yàn)證，效果優(yōu)于任何一種單一的原料。附圖說(shuō)明圖1：氨基脫羧酶活性檢測(cè)結(jié)果；其中，圖1a為組氨酸脫羧酶活性檢測(cè)結(jié)果，圖1b為酪氨酸脫羧酶活性檢測(cè)結(jié)果，圖1c為鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性檢測(cè)結(jié)果，圖1d為賴氨酸脫羧酶活性檢測(cè)結(jié)果。圖2：優(yōu)勢(shì)乳桿菌的篩選結(jié)果。圖3：菌株c2-0121的系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。圖4：菌株c2-0121發(fā)酵生長(zhǎng)曲線。圖5：試驗(yàn)組陰道組織圖片及he染色切片圖；其中，圖5a為陰性對(duì)照組，圖5b為染毒組，圖5c為陽(yáng)性對(duì)照組。圖6：造模期間家兔陰道分泌物菌群變化。圖7：陰道分泌物鏡檢圖片；其中，圖7a為正常組陰道分泌物鏡檢圖片，圖7b為灌注抗生素后陰道分泌物鏡檢圖片，圖7c為攻毒之后的鏡檢圖片。圖8：治療7天后家兔的飲食變化趨勢(shì)。圖9：治療期間家兔陰道分泌物菌群變化。圖10：家兔各試驗(yàn)組陰道分泌物鏡檢涂片；其中，圖10a為自然恢復(fù)組，圖10b為混合治療組，圖10c為陽(yáng)性對(duì)照組，圖10d為中藥組，圖10e為益生菌組。圖11：造模期間陰道組織切片；其中，圖11a為正常對(duì)照組，圖11b為模型組，圖11c為混合治療組，圖11d為中藥組，圖11e為益生菌組，圖11f為陽(yáng)性對(duì)照組。具體實(shí)施方式應(yīng)該指出，以下詳細(xì)說(shuō)明都是例示性的，旨在對(duì)本申請(qǐng)?zhí)峁┻M(jìn)一步的說(shuō)明。除非另有指明，本文使用的所有技術(shù)和科學(xué)術(shù)語(yǔ)具有與本申請(qǐng)所屬
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員通常理解的相同含義。正如
背景技術(shù)：
所介紹的，如何通過(guò)調(diào)節(jié)陰道菌群平衡來(lái)治療陰道感染仍是目前的難點(diǎn)所在，基于此，本申請(qǐng)?zhí)岢隽艘恢昃哂幸志饔玫母袷饺闂U菌及其在治療陰道感染中的應(yīng)用。為了使得本領(lǐng)域技術(shù)人員能夠更加清楚地了解本申請(qǐng)的技術(shù)方案，以下將結(jié)合具體的實(shí)施例與對(duì)比例詳細(xì)說(shuō)明本申請(qǐng)的技術(shù)方案。實(shí)施例1：菌株的篩選與鑒定1.試驗(yàn)材料1.1分離源：健康婦女陰道分泌物1.2培養(yǎng)基：改良mrs培養(yǎng)基(菌株分離時(shí)mrs培養(yǎng)基中添加1％的碳酸鈣)，明膠液化培養(yǎng)基(常規(guī)的市售產(chǎn)品)。h2o2鑒定mrs培養(yǎng)基：mrs瓊脂培養(yǎng)基中包含0.25mg/ml的四甲基聯(lián)苯胺、0.lmg/ml的辣根過(guò)氧化物酶。乳桿菌鑒定試驗(yàn)的培養(yǎng)基：杭州天和微生物試劑有限公司生產(chǎn)的細(xì)菌微量生化反應(yīng)管。1.3實(shí)驗(yàn)菌株：金黃色葡萄球菌atcc6538、大腸桿菌8099購(gòu)于中國(guó)醫(yī)學(xué)細(xì)菌包藏管理中心，變形桿菌及沙門(mén)氏菌購(gòu)于中國(guó)農(nóng)業(yè)大學(xué)。1.4其他細(xì)菌基因組提取試劑盒，藥敏紙片，16srrna引物。2.試驗(yàn)方法2.1陰道分泌物的采集：泰安市88醫(yī)院婦科體檢處醫(yī)生協(xié)助取樣，用無(wú)菌棉拭于陰道后1/3處一次性順時(shí)針刮抹，須避免接觸到外陰部和陰道口以防污染。取出后立即放至mrs液體培養(yǎng)基中，并編號(hào)記錄。2.2菌株的分離純化及鑒定將各分離源置于無(wú)菌水(帶玻璃珠)中震蕩，將樣品充分打散混勻，取振蕩液依次稀釋至10-2，10-3，10-4，10-5，各稀釋度取0.1ml涂平板(mrs+caco3)，2個(gè)重復(fù)，于37℃培養(yǎng)箱培養(yǎng)。挑取培養(yǎng)基上具有明顯鈣溶圈的菌落于斜面，革蘭氏染色、鏡檢，直至確定為純菌，將純化后的乳桿菌菌株接種到mrs培養(yǎng)基培養(yǎng)后，置4℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?.2.1產(chǎn)酸性能的測(cè)定及傳代穩(wěn)定性將分離的菌種以2％接種量接種于改良的mrs培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，測(cè)定發(fā)酵液的ph值。菌株連續(xù)轉(zhuǎn)接10天看其穩(wěn)定性及發(fā)酵液的ph值。2.2.2乳桿菌的初步鑒定凡是革蘭氏染色陽(yáng)性，h2o2酶試驗(yàn)陰性的菌株可初步確定為乳桿菌。2.2.3乳桿菌屬的鑒定通過(guò)生長(zhǎng)溫度試驗(yàn)(15℃，45℃)、運(yùn)動(dòng)性試驗(yàn)、硝酸鹽還原試驗(yàn)、明膠液化試驗(yàn)、吲哚試驗(yàn)、硫化氫試驗(yàn)對(duì)疑似菌株進(jìn)行屬的鑒定。2.2.4乳桿菌種的鑒定通過(guò)碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)進(jìn)行種的鑒定。各種碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)的培養(yǎng)基均采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管。2.3菌株的生物學(xué)性能研究及優(yōu)勢(shì)乳桿菌篩選2.3.1耐酸試驗(yàn)鹽酸調(diào)節(jié)mrs培養(yǎng)基使其ph值分別為1.5、2.5、3.5，分別接種培養(yǎng)好的發(fā)酵液，1％的接種量，37℃培養(yǎng)。取培養(yǎng)0h及4h的菌液平板計(jì)數(shù)。計(jì)算存活率(％)。2.3.2耐膽鹽試驗(yàn)在mrs培養(yǎng)基中加入豬膽酸鹽，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1％、0.2％、0.3％，菌液按2％的接種量接種，37℃培養(yǎng)。取培養(yǎng)0h及4h的菌液平板計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率(％)。2.3.3體外抑菌試驗(yàn)牛津杯法2.3.4抗生素的敏感試驗(yàn)紙片擴(kuò)散法2.3.5氨基脫羧酶活性檢測(cè)將供試菌種活化后，接種于液體脫羧酶培養(yǎng)基中檢測(cè)，空白培養(yǎng)基對(duì)照試驗(yàn)。37℃，培養(yǎng)4d后，觀察顏色變化。2.3.6優(yōu)勢(shì)乳桿菌的篩選應(yīng)用h2o2鑒定mrs培養(yǎng)基篩選產(chǎn)h2o2的乳桿菌。接種后厭氧37℃，培養(yǎng)72h，之后將培養(yǎng)基暴露于空氣中，產(chǎn)過(guò)氧化氫的菌落會(huì)于20min內(nèi)變?yōu)樗{(lán)色。2.416srdna分子鑒定pcr擴(kuò)增引物：1492r5’-ggttaccttgttacgactt-3’；27f5’-agagttgatcctggctcag-3’。菌落pcr反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性5min，94℃變性1min，52℃退火1min，72℃延伸2min，25個(gè)循環(huán)，72℃延伸10min。pcr產(chǎn)物經(jīng)salt-free純化后，pcr產(chǎn)物測(cè)序由博尚生物技術(shù)有限公司完成，要求雙向測(cè)通。將拼接后的序列結(jié)果輸入www.ncbi.nlm.nih.gov/blast，與genbank數(shù)據(jù)庫(kù)中的序列進(jìn)行同源性比對(duì)。2.5生長(zhǎng)曲線的測(cè)定以2％接種量將菌株接種于改良的mrs培養(yǎng)基中，37℃靜置培養(yǎng)，于0h、4h、6h、8h、10h、12h、14h、16h、20h、24h、28h、30h、32h、34h、36h、40h、44h、48h、50h取樣測(cè)定od值及ph值，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的od值與ph值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線，找出最佳培養(yǎng)時(shí)間。3.結(jié)果與分析3.1分離純化各菌株的形態(tài)學(xué)特征將多次挑取單菌落、分離純化的菌株進(jìn)行革蘭氏染色，各株菌的菌落形態(tài)皆為乳白色、圓形、片形，通過(guò)革蘭氏染色挑選革蘭氏陽(yáng)性的、菌體形態(tài)均為桿狀的菌株，分別標(biāo)記為，e-1、g5-7、c2-0109、c2-0121、l-7-3、g5-5、g5-3、h5-2、g5-4、g5-3、h5-3。3.2產(chǎn)酸性能、傳代穩(wěn)定性及發(fā)酵液ph值(10代)表1產(chǎn)酸性能的測(cè)定結(jié)果(測(cè)定20h發(fā)酵液的ph值)由表1看出：c2-0109及c2-0121與其它菌株比較，其發(fā)酵液的ph較低，都小于4，說(shuō)明其產(chǎn)酸能力較其它菌株強(qiáng)。表2傳代穩(wěn)定性及發(fā)酵液ph值(10代)經(jīng)連續(xù)培養(yǎng)傳代和對(duì)比試驗(yàn)，該菌株的分類(lèi)學(xué)形狀、形態(tài)特征等理化形狀未發(fā)現(xiàn)可見(jiàn)變化，說(shuō)明該菌株的形狀穩(wěn)定遺傳，兩菌株的產(chǎn)酸能力比較穩(wěn)定。3.2乳桿菌屬的鑒定所分株菌均為革蘭氏染色陽(yáng)性，無(wú)芽孢，硝酸鹽還原反應(yīng)、h2o2酶試驗(yàn)陰性，不液化明膠，不產(chǎn)吲哚，其他見(jiàn)表3表3硫化氫實(shí)驗(yàn)結(jié)果由表3可以看出：各株菌都不產(chǎn)生硫化氫，綜合各個(gè)指標(biāo)，菌株c2-0121及其他菌株皆為乳桿菌屬。3.3氨基脫羧酶活性檢測(cè)在氨基脫羧酶檢測(cè)試驗(yàn)中使用的四種氨基酸為酪氨酸、組氨酸、鳥(niǎo)氨酸和賴氨酸。經(jīng)脫氨后分別形成酪胺、組胺、腐胺和尸胺，均是引起中毒癥狀的主要生物胺類(lèi)物質(zhì)。根據(jù)氨基脫羧酶培養(yǎng)基初步檢測(cè)結(jié)果可知：所測(cè)菌株均不產(chǎn)生鳥(niǎo)氨酸、賴氨酸、組氨酸和酪氨酸脫羧酶活性，即不產(chǎn)生物胺。即不會(huì)引起中毒癥狀。組氨酸脫羧酶活性檢測(cè)結(jié)果如圖1a所示(圖1a中，從左到右分別為：空白、c2-0109、fng5-5、fng5-4、c2-0121、fng5-3、h5-2)，酪氨酸脫羧酶活性檢測(cè)結(jié)果如圖1b所示(圖1b中，從左到右：空白、fng5-3、fng5-5、c2-0121、c2-0109、h5-2、fng5-4)，鳥(niǎo)氨酸脫羧酶活性檢測(cè)結(jié)果如圖1c所示(圖1c中從左到右分別為空白、fng5-5、c2-0109、fng5-3、c2-0109/c2-0121、h5-2、fng5-4)，賴氨酸脫羧酶活性檢測(cè)結(jié)果如圖1d所示(圖1d中，從左到右分別為空白、c2-0109、c2-0121、fng5-4、fng5-5、c2-0109、fng5-3)。3.4菌株的生物學(xué)性能研究及優(yōu)勢(shì)乳桿菌的篩選3.4.1耐酸試驗(yàn)結(jié)果鹽酸調(diào)節(jié)mrs培養(yǎng)基使其ph值分別為1.5、2.5、3.5，分別接種培養(yǎng)好的發(fā)酵液，1％的接種量，37℃培養(yǎng)。取培養(yǎng)0h及4h的菌液平板計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率(％)見(jiàn)表4.表4在不同ph條件放置4h的存活率(％)菌株/ph度1.52.53.5c2-0109——108％c2-0121—2.1％93.5％c2-0071—1.0％90.5％g5-7—0.8％88.2％g5-5——91.2％g5-4——90.5％g5-3—1.05％90.5％h5-2—1.32％91.8％h5-3——88.6％l-3-2——78％由表4看出：各株菌在ph1.5環(huán)境中都不耐受，菌株c2-0121在ph3.5環(huán)境中耐受，存活率為93.5％，除了低于菌株c2-0109外，高于其他菌株。3.4.2耐膽鹽試驗(yàn)在mrs培養(yǎng)基中加入豬膽酸鹽，使其質(zhì)量分?jǐn)?shù)分別為0.1％、0.2％、0.3％，，菌液按2％的接種量接種，37℃培養(yǎng)0h及4h的菌液平板計(jì)數(shù)，計(jì)算存活率(％)，其結(jié)果見(jiàn)表5。表5在不同濃度膽鹽條件放置4h的存活率(％)由表5看出：菌株c2-0109、c2-0121、c2-0071fng-3在膽鹽濃度為0.1％的溶液中4h后能夠存活85％以上，其中c2-0109、c2-0121耐膽鹽的能力較強(qiáng)，在0.1％的膽鹽溶液中37℃培養(yǎng)4h其存活率大于95％，而其他各菌株存活率皆小于90％。3.4.3體外抑菌試驗(yàn)用牛津杯法分別對(duì)大腸桿菌8099、金黃色葡萄球菌atcc6538、沙門(mén)氏菌及變形桿菌的抑菌性能檢測(cè)，并且與實(shí)驗(yàn)室中保存的格式乳桿菌c2-0071抑菌比較好的菌株進(jìn)行比較，結(jié)果見(jiàn)表6。表6各株乳桿菌的抑菌性結(jié)果(單位：mm)由表6可以看出：各菌株對(duì)致病菌金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、變形桿菌都有一定的抑菌性，而菌株c2-0109、c2-0121、c2-0071對(duì)致病菌的抑菌性較好，其中以菌株c2-0121最好，比其他幾株菌的抑菌性都好，比實(shí)驗(yàn)室保存的格式乳桿菌c2-0071的抑菌圈都大，對(duì)金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、變形桿菌的抑菌性分別大14.3％、59.6％、21.7％、7.4％。在下面的實(shí)驗(yàn)中挑選性能較好的兩株菌c2-0109、c2-0121進(jìn)行經(jīng)一步的實(shí)驗(yàn)。3.4.4抗生素的敏感試驗(yàn)將性能較好的菌株c2-0109、c2-0121進(jìn)行抗生素的敏感實(shí)驗(yàn)，結(jié)果見(jiàn)表7.表7兩菌株對(duì)9種抗生素的敏感試驗(yàn)(抑菌圈直徑：mm)由表7可以看出：菌株c2-0121對(duì)頭孢曲松、頭孢氨芐及磺胺異惡咗不敏感，對(duì)其他多種抗生素敏感。3.4.5生化鑒定試驗(yàn)結(jié)果通過(guò)碳水化合物發(fā)酵產(chǎn)酸試驗(yàn)進(jìn)行種的鑒定。各種碳水化合物發(fā)酵試驗(yàn)的培養(yǎng)基均采用細(xì)菌微量生化反應(yīng)管，發(fā)酵結(jié)果見(jiàn)表8。表8糖發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果試驗(yàn)結(jié)果表明，c2-0121與格式乳桿菌的生化特性相一致，依據(jù)伯杰氏手冊(cè)，初步鑒定為格式乳桿菌。3.4.6優(yōu)勢(shì)乳桿菌的篩選通過(guò)優(yōu)勢(shì)乳桿菌的篩選，其中c2-0121菌落變?yōu)樗{(lán)色，結(jié)果見(jiàn)圖2，說(shuō)明能夠產(chǎn)過(guò)氧化氫。在正常陰道菌群中，乳桿菌占優(yōu)勢(shì)，乳桿菌對(duì)維持陰道內(nèi)的正常的菌群起著重要的作用，一方面，乳桿菌能夠利用糖原產(chǎn)生乳酸，降低生殖道的ph值，抑制病原菌的生長(zhǎng)；另外，乳桿菌還能夠產(chǎn)生過(guò)氧化氫，細(xì)菌素及類(lèi)細(xì)菌素和生物表面活性劑等抑制其他菌和致病微生物的生長(zhǎng)，從而維持陰道微生態(tài)的平衡；通過(guò)以上實(shí)驗(yàn)看出：菌株c2-0121產(chǎn)過(guò)氧化氫、產(chǎn)酸能力強(qiáng)而且抑菌性比其他菌株都好，因此，這株菌用于女性的生殖道的感染有非常好的作用，對(duì)維護(hù)陰道微生態(tài)平衡有促進(jìn)作用。3.5分子鑒定結(jié)果為確定c2-0121是乳酸菌的種類(lèi)，進(jìn)一步做了分子生物學(xué)鑒定，將菌株c2-0121進(jìn)行液體發(fā)酵，提取dna，pcr擴(kuò)增，16srdna的序列測(cè)定如seqidno.1所示，然后同源性比對(duì)，構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，見(jiàn)圖3。通過(guò)對(duì)菌株c2-0121的16srdna的序列測(cè)定和同源性比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它與lactobacillushominiscrbip24.179fr681902菌種的16srdna有高達(dá)99％的同源性，結(jié)合形態(tài)，將其鑒定為格式乳桿菌(lactobacillusgasseri)，命名為格式乳桿菌(lactobacillusgasseri)dfnxc2-0121，并于2017年3月31日保藏于中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心(簡(jiǎn)稱cctcc)，地址為：中國(guó)武漢，武漢大學(xué)，其保藏編號(hào)為cctccno:m2017162。3.6菌株發(fā)酵生長(zhǎng)曲線的繪制菌株接種后在不同時(shí)間段分別取樣，檢測(cè)在波長(zhǎng)600nm處測(cè)定其od值及ph，以培養(yǎng)時(shí)間為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的od值與ph值為縱坐標(biāo)，繪制生長(zhǎng)曲線見(jiàn)圖4。由圖4看出：菌株c2-0121在8h左右進(jìn)入對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期，此時(shí)菌株生長(zhǎng)最快，此時(shí)ph下降也最快由6.5下降到5.3，至16h時(shí)，od600達(dá)到最大，此時(shí)ph為3.99，通過(guò)平板計(jì)數(shù)得知此時(shí)活菌數(shù)達(dá)13.5×108cfu/ml，16h后進(jìn)入穩(wěn)定期。實(shí)施例2：益生菌代謝物組合物的制備(1)乳酸菌種子液的制備：取出菌種保藏管，用乳酸菌斜面固體培養(yǎng)基分別劃線進(jìn)行復(fù)蘇，37℃培養(yǎng)24-36h。挑取斜面培養(yǎng)基上的菌落結(jié)晶紫染色鏡檢，為短桿菌或長(zhǎng)桿菌。挑取菌落接種100ml乳酸菌培養(yǎng)基中，在37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h。種子采用2％-5％的接種量，接種至3l大三角瓶中，37℃培養(yǎng)24h-36h，檢測(cè)其菌液濃度，植物乳桿菌(保藏編號(hào)為cctccm2010150)的菌含量超過(guò)10億/毫升和菌株c2-0121的菌含量超過(guò)2億/毫升，即可作為乳桿菌液體菌種接種。(2)將活化后的菌株接種于mrs培養(yǎng)基中進(jìn)行培養(yǎng)，發(fā)酵培養(yǎng)至格式乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物的菌體濃度達(dá)到1.0×108-10.0×108cfu/ml，保藏編號(hào)為cctccm2010150的植物乳桿菌發(fā)酵培養(yǎng)物的菌體濃度達(dá)到8.0×108-20.0×108cfu/ml。所述的mrs培養(yǎng)基：葡萄糖2.0％、檸檬酸銨0.2％、乙酸鈉0.5％、磷酸氫二鉀0.5％、硫酸錳0.02％、硫酸鎂0.05％、蛋白胨1.0％、牛肉膏1.0％、酵母膏0.5％、吐溫800.1％，調(diào)節(jié)ph至6.0；固體培養(yǎng)基加1.5％瓊脂粉。培養(yǎng)基滅菌條件為：0.10-0.15mpa，121℃滅菌20min。(3)分別計(jì)數(shù)，將步驟(2)的發(fā)酵培養(yǎng)物用生理鹽水稀釋至其活菌數(shù)皆為1×107cfu/ml；取同體積的菌液混合備用。實(shí)施例3：中藥提取物的制備將黃芩35份、苦參30份、黃柏8份、地膚子6份、桑葉8份混合，將混合物置于10倍水中浸泡40-60min，煎煮，水開(kāi)后繼續(xù)煎煮50-60min，過(guò)濾得到第一濾液；藥渣用8倍水進(jìn)行二次煎煮，水開(kāi)后繼續(xù)煎煮30—40min，過(guò)濾得到第二濾液與第一濾液混合均勻，通過(guò)真空減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀濃縮中藥液，至中藥液的密度為1.1g/ml-1.2g/ml，靜止過(guò)夜，3000轉(zhuǎn)離心10min，收集上清液，備用。實(shí)施例4：中藥益生菌制劑的制備將實(shí)施例2制備的益生菌代謝物組合物40份和實(shí)施例3制備的中藥提取物45份混合均勻，即制備得到中藥益生菌制劑。實(shí)施例5：治療陰道炎的凝膠劑的制備稱取卡波姆9422.5g，量取實(shí)施例4制備的中藥益生菌制劑850ml，加入到盛有卡波姆的容器中，過(guò)夜，攪勻，直至細(xì)膩均勻無(wú)顆粒，用質(zhì)量濃度為10％的氫氧化鈉調(diào)節(jié)ph值至5.0，加入甘油5g及薄荷油0.2g，加水至1000g攪勻，即得。應(yīng)用例1：益生菌的體外抑菌實(shí)驗(yàn)1.試驗(yàn)材料：1.1供試菌株：植物乳桿菌blcc2-0001(保藏編號(hào)為cctccm2010150)、格式乳桿菌dfnxc2-0121(實(shí)施例1篩選得到)。1.2指示菌：白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、卷曲乳桿菌blcc2-0109，嗜酸乳桿菌1.2467、干酪乳桿菌1.0062，各指示菌均為市售產(chǎn)品。2.方法與結(jié)果：牛津杯法取菌株植物乳桿菌blcc2-0001、格式乳桿菌dfnxc2-0121的發(fā)酵液10000rpm離心10min，取上清液，進(jìn)行抑菌性試驗(yàn)；選取的指示菌分別為白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、卷曲乳桿菌blcc2-0109，嗜酸乳桿菌1.2467、干酪乳桿菌1.0062。試驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表9。表9菌株對(duì)各指示菌的抑菌圈的直徑(單位：mm)注：-表示沒(méi)有明顯的抑菌圈。試驗(yàn)結(jié)果表明：菌株blcc2-0001、dfnxc2-0121對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、沙門(mén)氏菌都有較強(qiáng)的抑菌性，對(duì)干酪乳桿菌1.0062、嗜酸乳桿菌、卷曲乳桿菌blcc2-0109無(wú)抑菌性。因此，此菌株是選擇性抑制致病菌大腸桿菌、沙門(mén)氏菌及金黃色葡萄球菌較強(qiáng)的菌株。應(yīng)用例2：中藥提取物的體外抑菌實(shí)驗(yàn)1.試驗(yàn)材料：1.1供試中藥：實(shí)施例3制備的中藥提取物1.2指示菌：白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、卷曲乳桿菌blcc2-0109，嗜酸乳桿菌1.2467、干酪乳桿菌1.0062，各指示菌均為市售產(chǎn)品。2.方法與結(jié)果2.1方法：牛津杯法2.2結(jié)果：中藥提取物對(duì)各指示菌的抑菌性結(jié)果，見(jiàn)表10.表10：中藥提取物對(duì)各指示菌的抑菌性結(jié)果由實(shí)驗(yàn)結(jié)果看出：中藥對(duì)金黃色葡萄球菌及白色念珠菌具有很強(qiáng)的抑菌性，而對(duì)大腸桿菌及沙門(mén)殺菌則無(wú)抑菌性，對(duì)乳酸菌同樣也沒(méi)有抑菌性。應(yīng)用例3：中藥益生菌制劑的體外抑菌實(shí)驗(yàn)1.試驗(yàn)材料：1.1供試中藥：實(shí)施例4制備的中藥益生菌制劑1.2指示菌：白色念珠菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、卷曲乳桿菌blcc2-0109，嗜酸乳桿菌1.2467、干酪乳桿菌1.0062，各指示菌均為市售產(chǎn)品。2.方法與結(jié)果2.1方法：牛津杯法2.2結(jié)果：中藥益生菌制劑對(duì)各指示菌的抑菌性結(jié)果，見(jiàn)表11.表11中藥益生菌制劑對(duì)各株菌的抑菌結(jié)果由表11可以看出：中藥和乳桿菌發(fā)酵液混合后對(duì)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌及白色念珠菌、沙門(mén)氏菌都有很強(qiáng)的抑菌性，但是對(duì)乳桿菌仍然沒(méi)有抑菌性，說(shuō)明混合后擴(kuò)大了抑菌譜，二者具有協(xié)同性，抑菌效果更加廣譜。應(yīng)用例4：家兔陰道刺激試驗(yàn)(依據(jù)2002消毒產(chǎn)品檢驗(yàn)技術(shù)規(guī)范-陰道黏膜刺激試驗(yàn))1.試驗(yàn)動(dòng)物：選用健康、初成年的非動(dòng)情期的雌性白色家兔，比利時(shí)兔，體重2.5kg。試驗(yàn)前檢查動(dòng)物陰道口有無(wú)分泌物、充血、水腫和其它損傷情況。如有炎癥或(和)損傷，應(yīng)棄用。2.試驗(yàn)分組：分為染毒組、陰性對(duì)照組和陽(yáng)性對(duì)照組，每組3只。其中，染毒組采用本發(fā)明實(shí)施例5制備的凝膠劑，陰性對(duì)照組灌入生理鹽水，陽(yáng)性對(duì)照組灌入市售產(chǎn)品吉林一正藥業(yè)集團(tuán)生物科技有限公司的抑菌凝膠3.試驗(yàn)操作方法3.1將長(zhǎng)度為8cm左右的鈍頭軟管與5ml的注射器連接。注射器和導(dǎo)管注滿受試液備用。每只動(dòng)物各準(zhǔn)備一套。3.2黏膜刺激試驗(yàn)的染毒方法：將動(dòng)物仰面固定，將導(dǎo)管用受試液或?qū)φ找簼駶?rùn)后輕柔地插入陰道(4cm-5cm)，并用注射器緩慢注入2ml受試液，抽出導(dǎo)管，完成染毒。陰性對(duì)照組動(dòng)物用生理鹽水作同樣處理。3.3多次陰道黏膜刺激試驗(yàn)的染毒方法：按上述3.2染毒方法，每隔24h重復(fù)染毒一次，連續(xù)5d。陰性對(duì)照組動(dòng)物用生理鹽水作同樣處理，陽(yáng)性對(duì)照用市售產(chǎn)品吉林一正藥業(yè)集團(tuán)生物科技有限公司的抑菌凝膠3.4受試液注入后可能有溢出，可用消毒棉或軟紙拭去。3.5末次染毒后24h，采用氣栓法處死動(dòng)物，剖腹取出完整的陰道，縱向切開(kāi)，肉眼觀察是否有充血、水腫等表現(xiàn)，供病理取材時(shí)參考。然后將陰道放入10％福爾馬林溶液中固定24h以上，選取陰道的兩端和中央3個(gè)部位的組織制片，he染色后，進(jìn)行組織病理學(xué)檢查。4結(jié)果評(píng)價(jià)組織病理學(xué)檢查結(jié)果，按表12定對(duì)陰道黏膜的刺激反應(yīng)進(jìn)行評(píng)分。將試驗(yàn)組3只動(dòng)物3個(gè)部位的刺激反應(yīng)積分相加后，再除以觀察總數(shù)(動(dòng)物數(shù)×3)，得出試驗(yàn)組陰道黏膜刺激反應(yīng)的平均積分，最大記分為16(見(jiàn)表12)。對(duì)照組評(píng)分方法同上。將試驗(yàn)組平均積分減去對(duì)照組平均積分得出刺激指數(shù)后，按表13進(jìn)行刺激強(qiáng)度分級(jí)。4.1陰道黏膜刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)見(jiàn)表12。表12陰道黏膜刺激反應(yīng)評(píng)分標(biāo)準(zhǔn)刺激反應(yīng)積分＝a+b+c+d.表13陰道黏膜刺激強(qiáng)度分級(jí)4.2各試驗(yàn)組陰道組織圖片及he染色切片圖陰性對(duì)照組陰道上皮完整，無(wú)細(xì)胞壞死、脫落及炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，染毒組及陽(yáng)性對(duì)照組也是同樣的，結(jié)果見(jiàn)圖5a-圖5c。4.3各試驗(yàn)組陰道黏膜刺激得分結(jié)果見(jiàn)表14。表14各試驗(yàn)組陰道黏膜刺激指數(shù)試驗(yàn)結(jié)果表明：試驗(yàn)干預(yù)組的陰道黏膜刺激指數(shù)＜1，根據(jù)陰道黏膜刺激強(qiáng)度分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)可知，試驗(yàn)組對(duì)家兔陰道黏膜無(wú)刺激性，由陰道組織圖片及he染色切片也可以看出，陰道無(wú)充血、水腫及炎性細(xì)胞，陰道黏膜完整、無(wú)細(xì)胞壞死、脫落現(xiàn)象。應(yīng)用例5：益生菌和中藥組合物對(duì)家兔陰道炎的抑制作用研究1.材料與方法1.1實(shí)驗(yàn)材料1.1.1試驗(yàn)動(dòng)物健康雌性家兔，體重為3.0kg，以生產(chǎn)2次以上，由道朗鎮(zhèn)魚(yú)池村龐性養(yǎng)殖戶提供，共30只。1.1.2藥物及試劑鹽酸林可霉素(購(gòu)于泰安市同仁堂大藥房)，白色念珠菌cmcc(f)98001(購(gòu)于中國(guó)藥品生物制品鑒定所)，一正抑菌凝膠(購(gòu)于泰安市萬(wàn)寧大藥房)武漢新生態(tài)生物工程有限公司生產(chǎn)1.1.3培養(yǎng)基選擇性培養(yǎng)基：emb，lbs，tsa，cq、mrs，均購(gòu)于青島海波生物技術(shù)有限公司。1.2實(shí)驗(yàn)方法將家兔先分為兩組，a組正常對(duì)照組5只，b組模型組25只，預(yù)飼3天后，隨機(jī)取陰道分泌物鏡檢并計(jì)數(shù)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、乳酸菌數(shù)。a組外陰部消毒后用18號(hào)大鼠灌胃器注入生理鹽水1ml，灌注11天后，氣拴法殺死家兔，取陰道組織10％甲醛固定制片，he染色后，進(jìn)行病理學(xué)檢查評(píng)分、分級(jí)。b組灌注鹽酸林可霉素注射液1ml，每天1次，灌注5天，恢復(fù)1天，然后用白色念珠菌活菌數(shù)1.5×107cfu/ml灌注0.5ml，每天1次，4天后，隨機(jī)取陰道分泌物鏡檢并計(jì)數(shù)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、白色念珠菌和乳酸菌數(shù)，確定造模成功后，模型組家兔氣拴法殺死家兔5只，取陰道組織10％甲醛固定制片，he染色后，進(jìn)行病理學(xué)檢查并參照表評(píng)分。然后家兔重新分組，分為5組，b1組為自然恢復(fù)組，b2組為混合(中藥和益生菌)治療組，b3組為中藥組，b4組為益生菌組、b5組陽(yáng)性對(duì)照組，每組5只，開(kāi)始治療。b1組灌注不含任何藥物的空白凝膠1.5g/只，b2組灌注實(shí)施例5的凝膠劑1.5g/只，b3組為實(shí)施例3的中藥液1.5ml，b4實(shí)施例2的益生菌液1.5ml，b5組一正抑菌凝膠1.5g/只，治療期間每天稱取飼料重量，治療6天后，全部取陰道分泌物鏡檢并計(jì)數(shù)大腸桿菌、金黃色葡萄球菌、腸球菌、白色念珠菌和乳酸菌數(shù)，7天后氣拴法殺死家兔，取陰道組織10％甲醛固定制片，he染色后，進(jìn)行病理學(xué)檢查并參照表4、表5評(píng)分、分級(jí)。2結(jié)果與分析2.1試驗(yàn)期間各試驗(yàn)組家兔的體征變化2.1.1造模期間家兔的體征變化預(yù)飼5天后，模型組家兔被毛潔白光滑，飲食正常，精神良好。用抗生素之后，精神沉郁，食量下降，匍匐狀，輕微拉稀，3只死亡，白色念珠菌攻毒后，精神沉郁，不思飲食，匍匐狀，拉稀，有1只死亡。2.1.2造模期間家兔陰道分泌物菌群變化結(jié)果見(jiàn)圖6。由圖6可以看出：家兔正常情況下，陰道中有大量的菌株，其中以乳酸桿菌為主要優(yōu)，數(shù)量較多；在使用抗生素之后，各種菌都大量減少，而攻毒之后，金黃色葡萄球菌、大腸桿菌及白色念珠菌等致病菌繁殖增多，為主要菌株，而乳酸桿菌相應(yīng)的減少，這說(shuō)明家兔陰道炎的模型的建立成功。圖7a為正常組陰道分泌物鏡檢圖片，可見(jiàn)有大量的桿菌，圖7b為灌注抗生素后陰道分泌物鏡檢圖片，菌群數(shù)量很少；圖7c為攻毒之后的鏡檢圖片，有大量的白色念珠菌、滴蟲(chóng)、球菌等致病菌，這也說(shuō)明模型建立成功。2.2治療后各項(xiàng)指標(biāo)2.2.1造模后治療期間各組家兔的體征變化：結(jié)果見(jiàn)表15。表15造模后治療期間各組家兔的體征變化2.2.2治療7天后家兔的飲食變化趨勢(shì)結(jié)果見(jiàn)圖8。試驗(yàn)結(jié)果表明：第一天治療組飲食量最多、自然恢復(fù)組最少，但是，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)自然恢復(fù)組飲食量是逐漸增多的，混合治療組、中藥組、益生菌組及對(duì)照組飲食量一直處于較高水平，混合治療組最高，說(shuō)明混合治療組對(duì)家兔的腸胃刺激最小。2.2.3治療期間家兔陰道分泌物菌群變化結(jié)果見(jiàn)圖9，由圖9看出：正常組的乳酸菌最高，為優(yōu)勢(shì)菌；混合治療組治療后乳酸菌大幅度的升高為優(yōu)勢(shì)菌，跟正常組的相比無(wú)顯著性差異，益生菌組、中藥組、陽(yáng)性對(duì)照組與自然恢復(fù)組比較其乳桿菌數(shù)量有所增多，但是與混合組比較都少于混合組的乳桿菌數(shù)量，而自然恢復(fù)組乳酸菌數(shù)量最少，仍處于弱勢(shì)，因此，炎癥未消失，由此看出，混合治療組(中藥與益生菌)治療后，乳酸菌數(shù)量大幅度的提高，處于優(yōu)勢(shì)地位，恢復(fù)至正常水平，說(shuō)明組合物對(duì)患有陰道炎的實(shí)驗(yàn)家兔具有非常顯著的治療作用。2.3家兔各試驗(yàn)組陰道分泌物鏡檢涂片結(jié)果見(jiàn)圖10a-圖10e。自然恢復(fù)組(圖10a)可見(jiàn)有極少量桿菌，而混合治療組(圖10b)有大量的桿菌，陽(yáng)性對(duì)照組(圖10c)有大量的桿菌但也有白色念珠菌，中藥組(圖10d)菌群數(shù)量較少，益生菌組(圖10e)雖有乳桿菌但是致病菌也較多，特別是白色念珠菌，各組比較，說(shuō)明實(shí)施例4制備的中藥益生菌制劑對(duì)混合感染引起陰道炎治療具有很好的抑制病原菌作用的。2.4造模期間陰道組織切片，見(jiàn)圖11a至圖11f。由圖11a可以看出，正常對(duì)照組陰道皺褶清晰完整，粘膜的上皮細(xì)胞無(wú)病變及壞死現(xiàn)象；模型組(圖11b)陰道皺褶淺，粘膜上層組織不完整，肌層潰爛，萎縮，細(xì)胞脫落、壞死；混合治療組(圖11c)陰道皺褶深而多，粘膜的上層黏膜細(xì)胞比較完整清晰，無(wú)脫落、壞死現(xiàn)象。中藥組(圖11d)、益生菌組(圖11e)、陽(yáng)性對(duì)照組(圖11f)都有清晰可見(jiàn)的陰道皺褶、黏膜上層完整，無(wú)潰瘍面、上皮脫落現(xiàn)象，說(shuō)明混合治療組、中藥組、益生菌組及陽(yáng)性對(duì)照組對(duì)陰道炎的實(shí)驗(yàn)家兔都有治療作用，而混合治療組與中藥組、益生菌組比較，陰道壁皺褶多而深，黏膜上層完整，說(shuō)明益生菌與中藥組合物比單一的中藥或者益生菌對(duì)陰道炎的實(shí)驗(yàn)家兔治療效果顯著?；旌现委熃M既包括中藥的清熱解毒、抑菌，對(duì)金黃色葡萄球菌及白色念珠菌的進(jìn)行抑制，添加益生菌，既能補(bǔ)充乳桿菌定值于陰道產(chǎn)生抑菌素、有機(jī)酸及過(guò)氧化氫等抑制病原菌的生長(zhǎng)，能夠促進(jìn)陰道微生態(tài)的平衡，快速修復(fù)陰道的黏膜，因此，中藥與益生菌組合物對(duì)陰道炎的實(shí)驗(yàn)家兔有很好的治療作用。3結(jié)論3.1用鹽酸林可霉素注射液1ml，每天灌注1次，共5天，恢復(fù)1天，然后用白色念珠菌活菌數(shù)1.5×107cfu/ml灌注0.5ml，每天1次，灌注4天，通過(guò)鏡檢陰道分泌物、陰道黏膜刺激指數(shù)可以看出模型成立。3.2用實(shí)施例4制備的中藥益生菌制劑灌注，1.5g/只，治療6天后，通過(guò)鏡檢陰道分泌物中的菌群、查看陰道病變情況、以及陰道組織切片都可以看出：模型組陰道嚴(yán)重充血，上皮細(xì)胞不完整，黏膜層出現(xiàn)病變、脫落等現(xiàn)象，而用實(shí)施例4制備的中藥益生菌制劑灌注的治療組、陽(yáng)性對(duì)照組與正常組的陰道上皮組織完整，黏膜光滑，無(wú)病變等現(xiàn)象；總結(jié)以上實(shí)驗(yàn)說(shuō)明：益生菌代謝物與中藥組合物安全無(wú)刺激，不影響其飲食；對(duì)引起陰道炎的致病菌有很好的抑制作用，促進(jìn)患有陰道炎的實(shí)驗(yàn)家兔陰道中的菌群恢復(fù)，并且能夠快速的修復(fù)受損的陰道黏膜。應(yīng)用例6：臨床實(shí)驗(yàn)(一)陰道炎及宮頸炎1材料1.1受試樣品：將實(shí)施例5制備的凝膠劑，為棕褐色或深褐色的凝膠。推薦用量3g/人、天，推注，6天為一個(gè)小療程。1.2受試人群受試者納入標(biāo)準(zhǔn)：陰道炎(細(xì)菌性陰道炎、霉菌性陰道炎及滴蟲(chóng)性陰道炎)160例，宮頸炎160例，年齡18歲～65歲，均有性生活史。非月經(jīng)期；臨床癥狀符合臨床上細(xì)菌性陰道炎的診斷標(biāo)準(zhǔn)，患者排除有重大精神疾病的患者，1w內(nèi)禁性生活；試驗(yàn)前1w內(nèi)未使用其藥及陰道清潔劑，或使用其他藥物無(wú)效。1.3治療方法對(duì)照組80例患者采取甲硝唑400mg，每天2次，口服7天，觀察組80例患者采用實(shí)施例的凝膠劑，每天1次，每次3g，患者清洗外陰后，每天晚上推入3g凝膠，兩組患者連續(xù)用藥1周后觀察臨床效果。1.4觀察指標(biāo)療效分為三個(gè)指標(biāo)，a治愈：患者的臨床癥狀消失，檢測(cè)結(jié)果為陰性；b有效：患者的臨床癥狀基本得到改善，檢測(cè)結(jié)果為陰性；c無(wú)效：患者的臨床癥狀沒(méi)有改善或者病情加重，在治療3個(gè)月后有復(fù)發(fā)的現(xiàn)象?？傆行剩?治愈+有效)/總病例×100％1.5統(tǒng)計(jì)學(xué)方法統(tǒng)計(jì)軟件用spss16.0處理數(shù)據(jù)，p<0.05說(shuō)明具有顯著性差異。2結(jié)果2.1兩組患者治療效果綜合比較觀察80例患者在治療后，治療總有效率明顯高于對(duì)照組，對(duì)比兩組患者的治療總有效率，具有顯著性差異，p<0.05有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，細(xì)菌性陰道炎詳見(jiàn)下表16，宮頸炎見(jiàn)表17表16陰道炎兩組患者藥物治療效果比較分析(％)兩組有效率(治愈+好轉(zhuǎn))經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)比較。p<0.05，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義表17宮頸炎兩組患者藥物治療效果比較分析(％)組別例數(shù)治愈有效無(wú)效總有效率觀察組8060(75％)14(17.5％)6(7.5％)92.5％對(duì)照組8052(65％)16(20％)12(15％)88％p--<0.05<0.052.2兩組患者的復(fù)發(fā)率比較觀察組80例患者經(jīng)過(guò)治療后，臨床復(fù)發(fā)率顯著低于對(duì)照組，兩組患者復(fù)發(fā)率差異顯著p<0.05，有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。表18兩組陰道炎患者復(fù)發(fā)率比較(％)組別例數(shù)復(fù)發(fā)人數(shù)復(fù)發(fā)率觀察組8022.5％對(duì)照組801215％p-<0.05<0.05表19兩組宮頸炎患者復(fù)發(fā)率比較(％)組別例數(shù)復(fù)發(fā)人數(shù)復(fù)發(fā)率觀察組8045％對(duì)照組801518.8％p-<0.05<0.05由表18、表19可以看出：益生菌與中藥組合物在治療不同病原菌引起的陰道炎及宮頸炎方面與甲硝唑比較，治愈率高，復(fù)發(fā)率低。(二)附件炎、盆腔炎及盆腔積液附件炎8例：小腹墜脹疼痛，左側(cè)按壓痛，伴有白帶增多異味、腰疼、月經(jīng)失調(diào)等癥狀。使用實(shí)施例5制成的凝膠一個(gè)療程后，排除很多的灰白色及膿性分泌物，疼痛減輕，異味消失；使用發(fā)明的產(chǎn)品2周后，排出帶有黑褐色血塊，疼痛消失。復(fù)檢6例痊愈。盆腔炎并帶有盆腔積液12例：醫(yī)院檢查患有盆腔炎并伴有盆腔積液，下腹部疼痛并發(fā)燒、腹部按壓痛，腰骶部酸痛，使用實(shí)施例5制成的凝膠2天后，開(kāi)始排出膿性分泌物及水樣物，6天后，分泌物增加，不再發(fā)燒，使用12天后，腰痛減輕，次月再次使用12天后，疼痛消失，確診痊愈9例。3.結(jié)論在本次實(shí)驗(yàn)中，用中藥來(lái)清熱排毒，消炎祛濕，止癢祛除異味等作用，而用益生菌在抑制致病菌的同時(shí)，并能夠定植于生殖道中繁殖生長(zhǎng)，其代謝產(chǎn)物乳酸和過(guò)氧化氫等物質(zhì)能保持生殖道正常酸性環(huán)境，抑制并消除致病菌的生長(zhǎng)。從而調(diào)節(jié)并恢復(fù)生殖道的微生態(tài)平衡。因此，對(duì)婦科炎癥方面的疾病有很好的治療效果，并且復(fù)發(fā)率低。以上所述僅為本申請(qǐng)的優(yōu)選實(shí)施例而已，并不用于限制本申請(qǐng)，對(duì)于本領(lǐng)域的技術(shù)人員來(lái)說(shuō)，本申請(qǐng)可以有各種更改和變化。凡在本申請(qǐng)的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本申請(qǐng)的保護(hù)范圍之內(nèi)。sequencelisting<110>泰安大凡神農(nóng)制藥有限公司<120>具有抑菌作用的格式乳桿菌與中藥復(fù)方及其在治療婦科炎癥中的應(yīng)用<130>2017<160>1<170>patentinversion3.5<210>1<211>1442<212>dna<213>菌株c2-0121<400>1gcaagtcgagcgagcttgcctagatgaatttggtgcttgcaccaaatgaaactagataca60agcgagcggcggacgggtgagtaacacgtgggtaacctgcccaagagactgggataacac120ctggaaacagatgctaataccggataacaacactagacgcatgtctagagtttaaaagat180ggttctgctatcactcttggatggacctgcggtgcattagctagttggtaaggtaacggc240ttaccaaggcaatgatgcatagccgagttgagagactgatcggccacattgggactgaga300cacggcccaaactcctacgggaggcagcagtagggaatcttccacaatggacgcaagtct360gatggagcaacgccgcgtgagtgaagaagggtttcggctcgtaaagctctgttggtagtg420aagaaagatagaggtagtaactggcctttatttgacggtaattacttagaaagtcacggc480taactacgtgccagcagccgcggtaatacgtaggtggcaagcgttgtccggatttattgg540gcgtaaagcgagtgcaggcggttcaataagtctgatgtgaaagccttcggctcaaccgga600gaattgcatcagaaactgttgaacttgagtgcagaagaggagagtggaactccatgtgta660gcggtggaatgcgtagatatatggaagaacaccagtggcgaaggcggctctctggtctgc720aactgacgctgaggctcgaaagcatgggtagcgaacaggattagataccctggtagtcca780tgccgtaaacgatgagtgctaagtgttgggaggtttccgcctctcagtgctgcagctaac840gcattaagcactccgcctggggagtacgaccgcaaggttgaaactcaaaggaattgacgg900gggcccgcacaagcggtggagcatgtggtttaattcgaagcaacgcgaagaaccttacca960ggtcttgacatccagtgcaaacctaagagattaggtgttcccttcggggacgctgagaca1020ggtggtgcatggctgtcgtcagctcgtgtcgtgagatgttgggttaagtcccgcaacgag1080cgcaacccttgtcattagttgccatcattaagttgggcactctaatgagactgccggtga1140caaaccggaggaaggtggggatgacgtcaagtcatcatgccccttatgacctgggctaca1200cacgtgctacaatggacggtacaacgagaagcgaacctgcgaaggcaagcggatctctga1260aagccgttctcagttcggactgtaggctgcaactcgcctacacgaagctggaatcgctag1320taatcgcggatcagcacgccgcggtgaatacgttcccgggccttgtacacaccgcccgtc1380acaccatgagagtctgtaacacccaaagccggtgggataacctttataggagtcagccgt1440ct1442當(dāng)前第1頁(yè)12