本發(fā)明屬于細(xì)胞間蛋白質(zhì)傳輸技術(shù)領(lǐng)域，特別涉及一種雙面空心納米針陣列裝置及其制備方法。

背景技術(shù)：

隨著生物醫(yī)學(xué)技術(shù)的發(fā)展，研究細(xì)胞間物質(zhì)傳輸?shù)姆椒ǘ喾N多樣。細(xì)胞內(nèi)的蛋白分子是生物電子和生物信息領(lǐng)域的主要研究對象之一，它在調(diào)節(jié)細(xì)胞活動，維持細(xì)胞或機(jī)體功能等方面起著關(guān)鍵作用，對細(xì)胞的行為例如細(xì)胞分化、細(xì)胞分裂、細(xì)胞病變和衰老等都是至關(guān)重要的，細(xì)胞內(nèi)任意一種蛋白分子的缺失都會對細(xì)胞的正常生命活動造成極大影響，因此研究將特定細(xì)胞向異常細(xì)胞內(nèi)輸送缺失蛋白，并保持供體細(xì)胞活性的方法對生物和醫(yī)療方面有極大的意義。

目前已有一系列成熟的技術(shù)用于補(bǔ)充所缺失的蛋白以修復(fù)細(xì)胞缺陷，例如細(xì)胞融合、dna轉(zhuǎn)染、直接蛋白轉(zhuǎn)移等方法。這些方法都需要兩種細(xì)胞參與，在最理想狀態(tài)下，為異常細(xì)胞輸送所缺失的蛋白需要滿足以下幾點：(1)能特異性地提取和輸送某種蛋白；(2)轉(zhuǎn)移中供體細(xì)胞和異常細(xì)胞的生命活性不受影響；(3)供體細(xì)胞可持續(xù)為異常細(xì)胞提供所需要的缺失蛋白；(4)能進(jìn)行大批量細(xì)胞之間的蛋白輸送；(5)能在提取供體細(xì)胞內(nèi)的蛋白同時將蛋白輸送到異常細(xì)胞內(nèi)。

目前細(xì)胞內(nèi)蛋白的提取和細(xì)胞間蛋白的輸送技術(shù)已經(jīng)取得重要發(fā)展，但尚缺失同時滿足以上要求的微創(chuàng)式細(xì)胞蛋白提取和輸送技術(shù)。細(xì)胞間蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移被應(yīng)用得最廣泛的方法是細(xì)胞融合法。該方法是在外力作用下，將供體細(xì)胞和異常細(xì)胞相互接觸，從而發(fā)生膜融合、胞質(zhì)融合和和融合并形成雜種細(xì)胞。在細(xì)胞融合中供體細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)直接進(jìn)入異常細(xì)胞，達(dá)到為異常細(xì)胞提供所需蛋白質(zhì)的目的。

另一種使異常細(xì)胞獲得所缺失蛋白的方法是dna轉(zhuǎn)染法。這種方法是將陽離子聚合物或脂質(zhì)體等通過靜電作用壓縮從供體細(xì)胞中提取出來的dna形成納米復(fù)合物，然后將復(fù)合物溶液加入到細(xì)胞培養(yǎng)基中，該納米復(fù)合物憑借重力作用沉降到貼壁細(xì)胞的表面，進(jìn)而通過胞吞作用進(jìn)入靶細(xì)胞；或者將dna復(fù)合物固定在細(xì)胞培養(yǎng)板的表面，然后再接種細(xì)胞，細(xì)胞貼壁生長于基因修飾的細(xì)胞培養(yǎng)板表面，進(jìn)而胞吞dna達(dá)到轉(zhuǎn)染目的。此方法可使異常細(xì)胞能夠自主生產(chǎn)缺失的蛋白質(zhì)，達(dá)到治療效果。

為了能夠特異性地為異常細(xì)胞輸送某種蛋白，可以將供體細(xì)胞的特定蛋白抽取出來，經(jīng)過特異性分離提純后輸送入異常細(xì)胞，從而滿足研究需求。

但上述方法均對應(yīng)存在以下缺點：

第一、細(xì)胞融合法后獲得的雜種細(xì)胞具有染色體異倍性，致使細(xì)胞株的遺傳性不穩(wěn)定，無法選擇性使受體細(xì)胞得到所需蛋白，而是將供體細(xì)胞許多其他蛋白一起吸收，融合過程中所需要的介質(zhì)有細(xì)胞毒性，對細(xì)胞損傷大，影響細(xì)胞的生命活動，并且融合后供體細(xì)胞無法再次提供蛋白。

第二、dna轉(zhuǎn)染法的缺點在于制備dna轉(zhuǎn)染質(zhì)粒的步驟繁瑣，需要先將細(xì)胞內(nèi)的dna轉(zhuǎn)染到細(xì)菌，讓細(xì)菌表達(dá)大量的dna轉(zhuǎn)染質(zhì)粒，再進(jìn)一步進(jìn)行提取和提純，得到dna質(zhì)粒。dna納米復(fù)合物粒徑不穩(wěn)定，并且為了獲得較高轉(zhuǎn)染效率往往需要較高的dna濃度，而較高載體/dna復(fù)合物濃度常常會引起一定的細(xì)胞毒性，影響細(xì)胞的正常生命活動。

第三、直接蛋白轉(zhuǎn)移法需要將供體細(xì)胞的蛋白通過細(xì)胞裂解或通過微針裝置提取出來后分離提純再輸送到異常細(xì)胞內(nèi)，耗時長過程繁瑣，且無法大批量提取和輸送，在分離提純的過程中可能會造成蛋白質(zhì)污染或變性，在沒有微創(chuàng)提取和輸送裝置的條件下還易對細(xì)胞造成較大損傷。

綜上所述，生物醫(yī)學(xué)和細(xì)胞治療的研究發(fā)展有賴于對細(xì)胞間物質(zhì)特異性傳輸?shù)难芯浚F(xiàn)有細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)傳輸和轉(zhuǎn)移面臨的巨大挑戰(zhàn)是難以在不破壞細(xì)胞活性的前提下對蛋白進(jìn)行同時提取和轉(zhuǎn)移。多種提取和轉(zhuǎn)移輸送技術(shù)正在被研發(fā)出來并取得樂觀進(jìn)展，但尚未能同時解決(1)—(5)存在的問題。目前尚缺乏一種有效技術(shù)可以非破壞性地同時將批量供體細(xì)胞的某種特定蛋白提取并輸送到受體細(xì)胞中。

因此，研發(fā)一種在不破壞細(xì)胞活性的前提下微創(chuàng)式將大量供體細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白提取出來并輸送到受體細(xì)胞中的雙面空心納米針陣列裝置迫在眉睫。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是克服現(xiàn)有技術(shù)的不足，公開一種雙面空心納米針陣列裝置，該陣列裝置可以在不破壞細(xì)胞活性的前提下微創(chuàng)式將大量供體細(xì)胞內(nèi)的特定蛋白提取出來，并輸送到受體細(xì)胞中，保持細(xì)胞的完整性和活性，避免干擾細(xì)胞正常功能；能持續(xù)為受體細(xì)胞提供蛋白質(zhì)達(dá)到細(xì)胞治療的目的。

為了達(dá)到上述技術(shù)目的，本發(fā)明是按以下技術(shù)方案實現(xiàn)的：

本發(fā)明所述的雙面空心納米針陣列裝置，包括上下兩層均安裝有若干空心納米針頭排布形成的空心納米針頭陣列，所述上空心納米針頭陣列的各空心納米針頭與下空心納米枕頭陣列中的各空心納米枕頭對應(yīng)，且所述上空心納米針頭陣列的各空心納米針頭上連通有微流管道，所述下空心納米針頭陣列的各空心納米針頭也與所述微流管道連通，所述微流管道的兩端部都設(shè)有小孔。

作為上述技術(shù)的進(jìn)一步改進(jìn)，所述空心納米針頭為氧化硅管狀空心納米針頭，其孔徑范圍值是在200-400nm，空心納米針頭的長度是2-4um。

作為上述技術(shù)的更進(jìn)一步改進(jìn)，所述微流管道長度為100-120um。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的雙面空心納米針陣列裝置的制備方法，其具體步驟是：

(1)制備上空心納米針頭陣列、下空心納米針頭陣列；

(2)將上空心納米針頭陣列及下空心納米枕頭陣列均與微流管道連通。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙面空心納米針陣列裝置的制作步驟，其特征在于：

上述步驟(1)所述的制備上空心納米針頭陣列或下空心納米針頭陣列的步驟如下：

使用具有均勻納米孔徑的聚碳酸酯襯底膜作為模板

a、首先使用原子層沉積技術(shù)，用氣相的三或二甲胺基或硅烷作為前驅(qū)體與水蒸汽脈沖交替地通入反應(yīng)器，在模板基體的所有表面包含內(nèi)孔壁沉積上均勻的氧化硅層；

b、然后利用等離子體刻蝕法，用sf6和cf4氣體將上表面的氧化硅刻蝕掉；

c、接著進(jìn)一步利用o2等離子體刻蝕將部分的襯底膜刻蝕掉，形成氧化硅管狀空心納米針頭結(jié)構(gòu)。

6.根據(jù)權(quán)利要求4所述的雙面空心納米針陣列裝置的制作步驟，其特征在于：

上述步驟(2)所述的空心納米針頭陣列與微流管道整合的步驟如下：

a、使用光刻技術(shù)在硅片上制作su-8光刻膠微流管道模具，并用此模具復(fù)制制作聚二甲基硅氧烷微流管道(pdms)模塊；

b、所述聚二甲基硅氧烷微流管道的兩末端各鉆小孔，用于連接導(dǎo)管輸送溶液，且pdms模塊使用未固化的pdms膠，將空心納米針頭陣列的襯底與pdms粘合，形成雙面空心納米針陣列。

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果是：

(1)本發(fā)明所述的雙面空心納米針陣列裝置，其充分利用納米針頭插破細(xì)胞膜，使細(xì)胞膜長時間處于被納米針頭插破狀態(tài)，但又不影響細(xì)胞的正常功能。在不破壞細(xì)胞活性的前提下微創(chuàng)式地將大量細(xì)胞的蛋白傳輸?shù)搅硗庖慌罅考?xì)胞中，保持雙方細(xì)胞的生命活性，達(dá)到治療異常細(xì)胞蛋白缺失的目的，便于進(jìn)行細(xì)胞研究。

(2)本發(fā)明所述的雙面空心納米針陣列裝置，由于納米針陣列具有大量數(shù)目的納米針，能夠同時間作用于大批量的細(xì)胞，通過對納米針尺寸以及電場條件的優(yōu)化，有望延長納米針插破細(xì)胞膜接觸細(xì)胞液的時間，使得細(xì)胞內(nèi)蛋白分子有足夠時間擴(kuò)散進(jìn)納米針的內(nèi)管道并流入下方細(xì)胞。

(3)現(xiàn)有的細(xì)胞內(nèi)蛋白提取的研究需要將細(xì)胞裂解，或使用操作復(fù)雜的儀器系統(tǒng)對單一細(xì)胞進(jìn)行提取。而本發(fā)明利用空心納米針頭陣列穿透細(xì)胞膜，提取供體細(xì)胞內(nèi)蛋白并送入異常細(xì)胞，為微創(chuàng)式細(xì)胞治療提供新思路，可無損或微創(chuàng)性地提取細(xì)胞內(nèi)蛋白并輸送到另一種細(xì)胞中，保持細(xì)胞的完整性和活性，避免干擾細(xì)胞正常功能；能持續(xù)為受體細(xì)胞提供蛋白質(zhì)達(dá)到細(xì)胞治療的目的。

附圖說明

下面結(jié)合附圖和具體實施例對本發(fā)明做詳細(xì)的說明：

圖1是本發(fā)明所述的雙面空心納米針陣列裝置結(jié)構(gòu)示意圖。

具體實施方式

如圖1所示，本發(fā)明所述的雙面空心納米針陣列裝置，包括上下兩層均安裝有若干空心納米針頭排布形成的空心納米針頭陣列，所述上空心納米針頭陣1列的各空心納米針頭11與下空心納米枕頭陣列3中的各空心納米枕頭31對應(yīng)，且所述上空心納米針頭陣列1的各空心納米針頭11上連通有微流管道2，所述下空心納米針頭陣列3的各空心納米針頭31也與所述微流管道2連通，所述微流管道2的兩端部都設(shè)有小孔。所述空心納米針頭11/41為氧化硅管狀空心納米針頭，其孔徑范圍值是在200-400nm，空心納米針頭11/41的長度是2-4um；所述微流管道2長度為100-120um。

本發(fā)明還公開了上述雙面空心納米針陣列裝置的制備方法，其具體步驟是：

(1)制備上空心納米針頭陣列1、下空心納米針頭陣列2；

(2)將上空心納米針頭陣列1及下空心納米枕頭陣列3均與微流管道連通2。

上述步驟(1)所述的制備上空心納米針頭陣列或下空心納米針頭陣列的步驟如下：

使用具有均勻納米孔徑的聚碳酸酯襯底膜作為模板

a、首先使用原子層沉積技術(shù)，用氣相的三或二甲胺基或硅烷作為前驅(qū)體與水蒸汽脈沖交替地通入反應(yīng)器，在模板基體的所有表面包含內(nèi)孔壁沉積上均勻的氧化硅層；

b、然后利用等離子體刻蝕法，用sf6和cf4氣體將上表面的氧化硅刻蝕掉；

c、接著進(jìn)一步利用o2等離子體刻蝕將部分的襯底膜刻蝕掉，形成氧化硅管狀空心納米針頭結(jié)構(gòu)。

上述步驟(2)所述的空心納米針頭陣列與微流管道整合的步驟如下：

a、使用光刻技術(shù)在硅片上制作su-8光刻膠微流管道模具，并用此模具復(fù)制制作聚二甲基硅氧烷微流管道(pdms)模塊；

b、所述聚二甲基硅氧烷微流管道的兩末端各鉆小孔，用于連接導(dǎo)管輸送溶液，且pdms模塊使用未固化的pdms膠，將空心納米針頭陣列的襯底與pdms粘合，形成雙面空心納米針陣列。

本發(fā)明所述的雙面空心納米針裝置使用時探索此系統(tǒng)對細(xì)胞的微創(chuàng)性，可以在提取蛋白之后隔兩天，檢查細(xì)胞的活性，以及檢查細(xì)胞在提取蛋白前以及提取蛋白后的rna表達(dá)情況，判定細(xì)胞功能被改變的情況。將蛋白提取液直接從微流管道里抽出來，用標(biāo)準(zhǔn)elisa試驗對多種蛋白組分進(jìn)行定量和分析。每隔12小時對同批細(xì)胞分別進(jìn)行蛋白提取，檢測此系統(tǒng)是否可持續(xù)將正常細(xì)胞的蛋白傳送入異常細(xì)胞。

以下具體對本發(fā)明所述的雙面空心納米針裝置進(jìn)行說明：

(1)首先，可利用外加電場協(xié)助納米針頭插破細(xì)胞膜，通過優(yōu)化電場條件，使細(xì)胞膜長時間處于被納米針頭插破狀態(tài)，但又不影響細(xì)胞的正常功能。

(2)在培養(yǎng)孔底部鋪放氧化銦錫導(dǎo)電玻璃(簡稱ito)作為負(fù)極，ito導(dǎo)電玻璃事先涂附多聚賴氨酸用于增加細(xì)胞粘附，并用導(dǎo)線連接外部電源及函數(shù)發(fā)生器，細(xì)胞使用細(xì)胞培養(yǎng)基培養(yǎng)于ito導(dǎo)電玻璃之上。培養(yǎng)24小時后，細(xì)胞貼壁鋪展生長，調(diào)整納米針頭及微留管道的高度，并利用光學(xué)顯微鏡在細(xì)胞培養(yǎng)孔的底部觀察納米針頭的位置，使其緊貼在細(xì)胞的上表面，通過函數(shù)發(fā)生器調(diào)整電脈沖參數(shù)(電壓，脈沖時長，脈沖間隔，脈沖數(shù))，施加電場在空心納米針下方的細(xì)胞膜，使得細(xì)胞膜局部破裂。驗證細(xì)胞膜被納米針插破的情況，可以通過納米針頭輸送自身難于透過細(xì)胞膜的熒光分子(例如碘化吡啶)進(jìn)入到細(xì)胞內(nèi)來判定。

(3)對于細(xì)胞的存活，可以通過活細(xì)胞/死細(xì)胞雙染試劑進(jìn)行判定；對于判定細(xì)胞膜的愈合情況，可以在施加電場后，等待間隔時間t分鐘，然后通過微流管道輸送碘化吡啶；如果能夠觀察到碘化吡啶進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)發(fā)出紅色熒光，則證明納米針下方和上方的細(xì)胞膜在施加電場后t分鐘里仍能保持破裂狀態(tài)。通過調(diào)節(jié)電脈沖的脈沖間隔，使得納米針下方的細(xì)胞膜在臨近愈合階段被電場重新?lián)羝?，從而保持長時間的破裂狀態(tài)，允許細(xì)胞內(nèi)蛋白有更多時間擴(kuò)散進(jìn)納米針的管道內(nèi)并進(jìn)入下方細(xì)胞?？招募{米針結(jié)合電場作用，在選取合適電場條件下，已被證明能夠有效打破細(xì)胞膜，同時能維持細(xì)胞的活性。納米針陣列具有大量數(shù)目的納米針，能夠同時間作用于大批量的細(xì)胞。

(4)電場條件的優(yōu)化：施加電場的強(qiáng)度、時間長短關(guān)系到細(xì)胞膜被納米針插穿的狀況，以及細(xì)胞存活性，通過優(yōu)化電場條件，使得細(xì)胞膜長時間處于被納米針頭插破狀態(tài),但又不影響細(xì)胞的正常功能。

本發(fā)明所述的雙面空心納米針裝置使用時探索此系統(tǒng)對細(xì)胞的微創(chuàng)性，可以在提取蛋白之后隔兩天，檢查細(xì)胞的活性，以及檢查細(xì)胞在提取蛋白前以及提取蛋白后的rna表達(dá)情況，判定細(xì)胞功能被改變的情況。將蛋白提取液直接從微流管道里抽出來，用標(biāo)準(zhǔn)elisa試驗對多種蛋白組分進(jìn)行定量和分析。每隔12小時對同批細(xì)胞分別進(jìn)行蛋白提取，檢測此系統(tǒng)是否可持續(xù)將正常細(xì)胞的蛋白傳送入異常細(xì)胞。

以下通過兩種實施例對本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的說明：

實施例一：

在hela細(xì)胞間傳輸綠色熒光蛋白：

將若干hela細(xì)胞置于雙面納米針陣列裝置的上層，下層放置帶有綠色熒光蛋白的變異型hela細(xì)胞，提供適宜細(xì)胞正常生活的環(huán)境，用上層空心納米針11插破hela細(xì)胞膜，使細(xì)胞液流入微流管道2內(nèi)，下層細(xì)胞20內(nèi)的綠色熒光蛋白30流入上層細(xì)胞10內(nèi)，每隔12小時分別對同批上方和下方的hela細(xì)胞內(nèi)的綠色熒光蛋白利用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察，可發(fā)現(xiàn)多次提取下大部分hela細(xì)胞仍正常生活，且上方原來不帶綠色熒光蛋白的hela細(xì)胞中檢測出綠色熒光蛋白，兩種細(xì)胞存活率高，證明該雙面空心納米針裝置可無損或微創(chuàng)性地提取細(xì)胞內(nèi)蛋白并輸送到另一種細(xì)胞中，保持細(xì)胞的完整性和活性，避免干擾細(xì)胞正常功能；能持續(xù)為受體細(xì)胞提供蛋白質(zhì)達(dá)到細(xì)胞治療的目的。

實施例二：

在hela細(xì)胞間傳輸綠色和紅色熒光蛋白：

將若干表達(dá)綠色熒光蛋白的hela細(xì)胞置于雙面納米針陣列裝置上層，下層放置帶有紅色熒光蛋白的變異型hela細(xì)胞，提供適宜細(xì)胞正常生活的環(huán)境，用上層空心納米針11插破hela細(xì)胞膜，使細(xì)胞液流入微流管道2內(nèi)，下層細(xì)胞20內(nèi)的紅色熒光蛋白30流入上層細(xì)胞10內(nèi)。每隔12小時分別對同批上方和下方的hela細(xì)胞內(nèi)的紅色和綠色熒光蛋白利用共聚焦熒光顯微鏡進(jìn)行觀察。可發(fā)現(xiàn)多次提取下大部分hela細(xì)胞仍正常生活，且上方和下方的hela細(xì)胞中同時檢測出紅色和綠色熒光蛋白，兩種細(xì)胞存活率高，證明該雙面空心納米針裝置可無損或微創(chuàng)性地提取細(xì)胞內(nèi)蛋白并輸送到另一種細(xì)胞中，保持細(xì)胞的完整性和活性，避免干擾細(xì)胞正常功能；能持續(xù)為受體細(xì)胞提供蛋白質(zhì)達(dá)到細(xì)胞治療的目的。

本發(fā)明并不局限于上述實施方式，凡是對本發(fā)明的各種改動或變型不脫離本發(fā)明的精神和范圍，倘若這些改動和變型屬于本發(fā)明的權(quán)利要求和等同技術(shù)范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意味著包含這些改動和變型。