本發(fā)明屬于藥物制劑新輔料和新劑型領(lǐng)域，涉及一種腸道上皮細(xì)胞頂側(cè)octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物l-肉毒堿的衍生物和相應(yīng)靶向納米粒的制備，及其作為口服藥物載體在藥物傳遞方面的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

納米技術(shù)在21世紀(jì)取得了迅速的發(fā)展，將納米技術(shù)應(yīng)用于藥物傳遞的前景十分廣闊。與常規(guī)的傳遞系統(tǒng)相比，納米藥物制劑具有獨(dú)特的小尺寸效應(yīng)、比表面積大、表面鏈接或載帶的功能基團(tuán)或活性中心多等優(yōu)點(diǎn)使得其在緩、控釋給藥，靶向給藥，黏膜和局部給藥以及蛋白質(zhì)和基因藥物傳遞等領(lǐng)域中表現(xiàn)出明顯的優(yōu)勢。然而普通納米粒(nanoparticles,nps)仍然有些缺陷：注射后易被網(wǎng)狀內(nèi)皮系統(tǒng)吞噬、靶向部位分布少、體內(nèi)滯留時(shí)間較短等。為了改善納米粒的功效，可以在納米粒表面連接特定的配體，即主動(dòng)靶向納米粒。它通過配體-受體相互作用使nps與靶部位表達(dá)的受體特異性結(jié)合，進(jìn)而提高靶組織、細(xì)胞或細(xì)胞器中藥物的蓄積。常用的配體包括受體介導(dǎo)類(葉酸，黃素單核苷酸，轉(zhuǎn)鐵蛋白等)、多肽類(rgd肽，k237肽等)、糖類(半乳糖、透明質(zhì)酸)以及抗體類(單鏈抗體片段，單克隆抗體)等。多年來的研究結(jié)果表明納米粒經(jīng)過修飾之后可顯著改善納米粒的靶向性和藥物療效，使得納米粒更加智能化。

目前隨著分子生物學(xué)突飛猛進(jìn)的發(fā)展，科學(xué)家們在機(jī)體內(nèi)各器官中揭示了許多與膜轉(zhuǎn)運(yùn)有關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體，這些轉(zhuǎn)運(yùn)體決定了藥物能否有效作用于機(jī)體，并在藥物體內(nèi)動(dòng)態(tài)和臨床療效個(gè)體差異等方面發(fā)揮重要作用。轉(zhuǎn)運(yùn)體廣泛分布于人體各個(gè)臟器組織，它們在協(xié)調(diào)各種物質(zhì)的攝取和外排的過程中扮演了重要的角色。隨著人們對于轉(zhuǎn)運(yùn)體在體內(nèi)藥物動(dòng)態(tài)處置中的重要性的認(rèn)識不斷加深，以轉(zhuǎn)運(yùn)體為靶點(diǎn)的主動(dòng)靶向前藥的研究正如火如荼的進(jìn)行著，而基于轉(zhuǎn)運(yùn)體介導(dǎo)的主動(dòng)靶向納米粒的研究也逐漸引起研究者們的注意，但總體來說目前仍處于探索初期，有待深入研究。相對于受體介導(dǎo)的靶向納米粒，轉(zhuǎn)運(yùn)體作為靶點(diǎn)具有明顯的優(yōu)勢，配體都是小分子，易于結(jié)構(gòu)修飾，穩(wěn)定性好，轉(zhuǎn)運(yùn)效率更高，且受機(jī)體內(nèi)內(nèi)源性成分干擾較少。此外，目前可供納米粒靶向的受體選擇種類較少，因此藥物轉(zhuǎn)運(yùn)體作為納米粒主動(dòng)靶向的靶點(diǎn)是一個(gè)非常有潛力的補(bǔ)充和擴(kuò)展。

目前，基于轉(zhuǎn)運(yùn)體的靶向納米粒主要集中于腦部腫瘤的特異性傳遞。對于口服靶向納米粒，主要選擇的靶點(diǎn)是膽酸轉(zhuǎn)運(yùn)體和維生素b12相關(guān)的轉(zhuǎn)運(yùn)體等。目前還未見基于octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體設(shè)計(jì)的主動(dòng)靶向納米粒的報(bào)道。我們將octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體的專屬性底物l-肉毒堿進(jìn)行化學(xué)修飾，制成其兩親性衍生物硬脂酰-l-肉毒堿，用來修飾plga納米粒，構(gòu)建全腸段吸收的口服高效納米藥物傳遞系統(tǒng)，提高所載藥物的口服生物利用度。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是針對目前抗腫瘤藥物不能口服的問題，提供一種新型的以腸道octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體為靶點(diǎn)的納米藥物遞送系統(tǒng)。

本發(fā)明提供了一種腸道上皮細(xì)胞頂側(cè)octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體的底物兩親性衍生物硬脂酰-l-肉毒堿及其制備方法。

本發(fā)明以l-肉毒堿為靶向配基，生物相容性好的可降解高分子材料為基礎(chǔ)高分子載體，包載抗腫瘤藥物，制成口服靶向納米藥物遞送系統(tǒng)。

本發(fā)明提供的靶向納米粒穩(wěn)定性好、靶向效率高、可有效提高所載藥物的口服生物利用度，并且可以應(yīng)用于其他胃腸道不穩(wěn)定、吸收差的藥物的口服遞送。本發(fā)明通過以下技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)上述目的：

本發(fā)明所述的硬脂酰-l肉毒堿由octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體底物l-肉毒堿和硬脂酸組成的兩親性化合物，是一種穩(wěn)定性好的用于構(gòu)建octn2靶向納米藥物傳遞系統(tǒng)的靶向配基。

所述的硬脂酸可以為十八酸、十六酸、十四酸等長鏈脂肪酸。

所述的兩親性化合物的結(jié)構(gòu)式如下：

一種腸道上皮細(xì)胞頂側(cè)octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體的兩親性底物衍生物硬脂酰-l-肉毒堿的制備方法，其具體采用如下步驟制備：

(a)l-肉毒堿的保護(hù)

將l-肉毒堿和溴化芐以摩爾比1：1～1.4的比例加入dmf中攪拌均勻，加熱至110～130℃，攪拌條件下反應(yīng)2～6小時(shí)，減壓蒸餾除去溶劑dmf及未反應(yīng)的溴化芐，即得l-肉毒堿芐酯。

(b)硬脂酰氯的合成

將硬脂酸、加入二氯甲烷中攪拌溶解，逐滴加入草酰氯(硬脂酸：草酰氯摩爾比為1：1～1.4)，攪拌條件下反應(yīng)0.5～2小時(shí)，減壓蒸餾除去溶劑二氯甲烷及未反應(yīng)的草酰氯，即得硬脂酰氯。

(c)硬脂酰-l-肉毒堿芐酯的合成

將上述所得到的l-肉毒堿芐酯和硬脂酰氯以摩爾比為1：0.8～1.2的比例加入乙腈中攪拌均勻，加熱至40～50℃，攪拌條件下反應(yīng)12～36小時(shí)，減壓除去乙腈，采用二氯甲烷：甲醇＝15～40：1的流動(dòng)相進(jìn)行柱分離，得到硬脂酰-l-肉毒堿芐酯。

(d)脫保護(hù)

將上述所得的硬脂酰-l-肉毒堿芐酯溶于甲醇中攪拌均勻，(加入10％鈀碳還原劑，硬脂酰-l-肉毒堿芐酯：10％鈀碳還原劑重量比為1：0.1～0.4)，加熱至25～35℃，在h2保護(hù)條件下反應(yīng)3～6小時(shí)，將反應(yīng)液過濾除去鈀碳，在減壓蒸餾條件下除去溶劑甲醇，即得硬脂酰-l-肉毒堿。

以十八酸為例，其反應(yīng)過程如下所示：

步驟(a)中使用溴芐將肉毒堿的羧基保護(hù)起來，避免后續(xù)產(chǎn)生不必要的副產(chǎn)物。

步驟(b)中使用草酰氯將硬脂酸活化為硬脂酰氯，目的為提高其反應(yīng)活性。

所述的腸道上皮細(xì)胞頂側(cè)octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體的兩親性底物衍生物硬脂酰-l-肉毒堿，可作為octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體靶向納米載體修飾物，用于提高難溶性藥物口服生物利用度。其中納米載體材料可為聚乳酸-羥基乙酸共聚物(poly(lactic-co-glycolicacid)，plga)、聚乳酸(polylactide，pla)、聚己內(nèi)酯(polycaprolactone，pcl)中任一種難溶性聚合物材料。其中抗腫瘤藥物可為紫衫烷類、喜樹堿類、蒽醌類或難溶性藥物二氫吡啶類、非甾體抗炎藥中的任一物質(zhì)或其衍生物。

所述的納米粒包含：藥物、靶向修飾材料、納米載體材料，三者的質(zhì)量比為1：0.1～8：20.

本發(fā)明以乳化溶劑揮發(fā)法制備octn2靶向納米粒，具體采用下述步驟：乳化溶劑揮發(fā)法是將上述的藥物、靶向修飾材料以及納米載體材料同時(shí)溶于與水不互溶的有機(jī)溶劑(如二氯甲烷、氯仿、乙酸乙酯等)，將其與一定比例(油水相比例為1：1～1：10)的水相(濃度為0.1～10％的表面活性劑溶液，如聚乙烯醇(polyvinylalcohol，pva)，tween80，普朗尼克f68，tpgs等)混合，以50～300w的功率探頭超聲3～10min(超聲3s，停止2s)，得到均勻的納米乳，揮去有機(jī)溶劑，離心，0.80μm濾膜過濾，得到載藥納米粒溶液；超速離心后，棄去上清液，加入去離子水分散，重復(fù)操作三次，洗去表面活性劑。

本發(fā)明具有以下突出優(yōu)點(diǎn)及特征：

利用腸道上皮細(xì)胞頂側(cè)的高親和性轉(zhuǎn)運(yùn)體octn2作為靶點(diǎn)，合成l-肉毒堿衍生物，采用物理鑲嵌的方法修飾納米粒使其攜帶l-肉毒堿配基，以生物相容性好的高分子材料為基礎(chǔ)載體，包載抗腫瘤藥物后制成口服octn2靶向藥物遞送系統(tǒng)，用于提高其口服生物利用度。

本發(fā)明制備過程簡單、易操作。所制備的靶向納米粒粒徑均一，包封率高，穩(wěn)定性好，可作為難溶性化療藥物的儲庫，可以達(dá)到緩釋效果。

本發(fā)明制備的靶向納米粒可直接用于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)。該靶向納米粒由于系統(tǒng)中l(wèi)-肉毒堿的作用，提高了其與腸道octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體的結(jié)合能力，使其更高效地進(jìn)入腸道上皮細(xì)胞、進(jìn)而跨膜轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，增加攝取轉(zhuǎn)運(yùn)的同時(shí)，避免了p-糖蛋白的外排作用，顯著提高所載藥物的口服生物利用度。

附圖說明

圖1為l-肉毒堿衍生物硬脂酰-l-肉毒堿的合成路線。

圖2為氫核磁共振表征l-肉毒堿衍生物硬脂酰-l-肉毒堿。

圖3為透射電鏡觀察納米給藥系統(tǒng)的外觀形態(tài)及粒徑(a,plganps；b,10％lc-plganps)。

圖4為動(dòng)態(tài)光散射法測定納米給藥系統(tǒng)的粒徑穩(wěn)定性。

圖5為包載有紫杉醇的納米粒的體外釋放曲線(n＝3)。

圖6為xps考察納米粒的表面化學(xué)特性(a,10％lc-plganps的全譜圖以及plganps和10％lc-plganps在n峰位置的比較；b,不同修飾比例的納米粒在n峰位置的比較)。

圖7為x射線衍射測定納米粒包載的紫杉醇藥物的存在狀態(tài)。

圖8為不同修飾比例的納米粒不同條件下(control:有鈉離子和氯離子存在；na⁺free:沒有鈉離子存在；cl^-free:沒有氯離子存在；withl-carnitine:有鈉離子和氯離子存在,并且有游離的l-肉毒堿存在)在caco-2細(xì)胞水平的攝取(n＝3)。(**,p<0.01,相對于未修飾的納米粒攝??；α,p<0.05,β,p<0.01,相對于在nacl存在條件下的攝取)

圖9為plganps和10％lc-plganps在不同水平抑制劑條件下的攝取(內(nèi)吞機(jī)制的研究)(n＝3)。(α,p<0.05,β,p<0.01,相對于對照條件下的攝取)

圖10為不同修飾比例的納米粒在caco-2細(xì)胞水平攝取的可視化共聚焦圖片。

圖11為小腸灌流實(shí)驗(yàn)中plganps和10％lc-plganps在不同腸段的滲透系數(shù)(n＝3)。

圖12為小腸灌流實(shí)驗(yàn)中不同修飾比例的納米粒在十二指腸的滲透系數(shù)和吸收常數(shù)(n＝3)。

圖13為plganps和10％lc-plganps在不同腸段的生物分布情況。

圖14為不同修飾比例的納米粒經(jīng)口服后的藥時(shí)曲線(n＝6)。

圖15為不同修飾比例的納米粒經(jīng)口服后的最大血藥濃度和生物利用度(n＝6)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1.

靶向修飾物l-肉毒堿衍生物的合成

將l-肉毒堿3mmol(約484mg)、溴化芐3.6mmol加入約25mldmf中攪拌均勻，加熱至125℃，攪拌條件下反應(yīng)4小時(shí)，減壓蒸餾除去溶劑dmf及未反應(yīng)的溴化芐，即得l-肉毒堿芐酯。將硬脂酸3mmol、加入約15ml二氯甲烷中攪拌溶解，逐滴加入草酰氯3.6mmol，攪拌條件下反應(yīng)0.5h，減壓蒸餾除去溶劑二氯甲烷及未反應(yīng)的草酰氯，即得硬脂酰氯。將上述所得到的l-肉毒堿芐酯和硬脂酰氯加入約25ml乙腈中攪拌均勻，加熱至45℃，攪拌條件下反應(yīng)24h，減壓除去乙腈，采用二氯甲烷：甲醇＝19：1的流動(dòng)相進(jìn)行柱分離，得到硬脂酰-l-肉毒堿芐酯。將上述所得的硬脂酰-l-肉毒堿芐酯溶于25ml甲醇中攪拌均勻，加入10％鈀碳還原劑0.2g，加熱至30℃，在h2保護(hù)條件下反應(yīng)5h，將反應(yīng)液過濾除去鈀碳，在減壓蒸餾條件下除去溶劑甲醇，即得硬脂酰-l-肉毒堿。

實(shí)施例1的反應(yīng)路線見圖1。反應(yīng)中的硬脂酸可以為十六酸、十四酸等其他長鏈脂肪酸，但并不局限于此。采用核磁共振¹hnmr氫譜來確定實(shí)施例1中產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)，選用的溶劑為氘代dmso，結(jié)果如圖2。硬脂酸特征峰主要分布在0.7ppm到2.4ppm，肉毒堿的季胺基團(tuán)的特征峰出現(xiàn)在3.3ppm，其他詳細(xì)峰歸屬見圖2。

實(shí)施例2.

普通plganps的制備

精密稱取紫杉醇(或香豆素6)0.50mg，plga10.0mg，溶解在1ml二氯甲烷中，將其與5ml1％的pva水溶液相混和，以200w的功率探頭超聲5min，室溫?cái)嚢?h，揮去有機(jī)溶劑，得到納米粒溶液，13000r/min離心30min后，棄去上清液，加入去離子水分散，重復(fù)操作三次，洗去表面活性劑，即得普通無修飾的plganps。

實(shí)施例3.

5％lc-plganps的制備

精密稱取紫杉醇(或香豆素6)0.50mg，合成的硬脂酰-l-肉毒堿0.50mg，plga10.0mg，溶解在1ml二氯甲烷中，將其與5ml1％的pva水溶液相混和，以200w的功率探頭超聲5min，室溫?cái)嚢?h，揮去有機(jī)溶劑，得到納米粒溶液，13000r/min離心30min后，棄去上清液，加入去離子水分散，重復(fù)操作三次，洗去表面活性劑，即得5％lc-plganps。

實(shí)施例4.

10％lc-plganps的制備

精密稱取紫杉醇(或香豆素6)0.50mg，合成的硬脂酰-l-肉毒堿1.00mg，plga10.0mg，溶解在1ml二氯甲烷中，將其與5ml1％的pva水溶液相混和，以200w的功率探頭超聲5min，室溫?cái)嚢?h，揮去有機(jī)溶劑，得到納米粒溶液，13000r/min離心30min后，棄去上清液，加入去離子水分散，重復(fù)操作三次，洗去表面活性劑，即得10％lc-plganps。

實(shí)施例5.

20％lc-plganps的制備

精密稱取紫杉醇(或香豆素6)0.50mg，合成的硬脂酰-l-肉毒堿2.00mg，plga10.0mg，溶解在1ml二氯甲烷中，將其與5ml1％的pva水溶液相混和，以200w的功率探頭超聲5min，室溫?cái)嚢?h，揮去有機(jī)溶劑，得到納米粒溶液，13000r/min離心30min后，棄去上清液，加入去離子水分散，重復(fù)操作三次，洗去表面活性劑，即得20％lc-plganps。

實(shí)施例6.

40％lc-plganps的制備

精密稱取紫杉醇(或香豆素6)0.50mg，合成的硬脂酰-l-肉毒堿4.00mg，plga10.0mg，溶解在1ml二氯甲烷中，將其與5ml1％的pva水溶液相混和，以200w的功率探頭超聲5min，室溫?cái)嚢?h，揮去有機(jī)溶劑，得到納米粒溶液，13000r/min離心30min后，棄去上清液，加入去離子水分散，重復(fù)操作三次，洗去表面活性劑，即得40％lc-plganps。

實(shí)施例7.

采用微柱離心法測定靶向納米粒的包封率和載藥量

用蒸餾水浸泡sephadexg-5048h，然后取適量平衡好的sephadexg-50裝入2.5ml注射器針筒中，制成sephadexg-50的微型柱。將制備好的sephadexg-50微型柱在1000r·min-1離心1min，除去其中的水，棄去；精密量取200μl紫杉醇plga納米粒溶液，1000r·min-1離心1min，收集洗脫液；精密量取200μl蒸餾水，1000r·min-1離心1min，收集洗脫液，共收集5管樣品。將所收集所有樣品轉(zhuǎn)移至10ml量瓶中，乙腈稀釋并定容，0.22μm濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣20μl，按含量測定項(xiàng)下方法測定藥物濃度，計(jì)算納米粒中包裹的藥物量m包。精密量取200μl紫杉醇納米粒溶液至10ml量瓶中，乙腈稀釋并定容，0.22μm濾膜過濾，取續(xù)濾液進(jìn)樣20μl，按含量測定項(xiàng)下方法測定藥物濃度，計(jì)算投入的總藥量m藥。另設(shè)納米粒總重量為m總。按公式：包封率(ee％)＝m包/m藥×100％計(jì)算載藥納米粒的包封率(dl％)和公式：載藥量(dl％)＝m包/m總×100％計(jì)算載藥納米粒的載藥量(ee％)。結(jié)果如下表所示，載藥納米粒的包封率在70％以上，載藥量在3％以上。

表1，所制備的納米粒的包封率和載藥量

實(shí)施例8.

透射電子顯微鏡觀察納米粒的形態(tài)

利用透射電子顯微鏡觀察所制備的對照納米粒及octn2靶向納米粒的粒子形態(tài)及大小。本發(fā)明采用復(fù)染法制備樣品，具體制備方法如下：將自制的納米粒溶液稀釋至適當(dāng)濃度，滴在表面覆有支持膜的銅網(wǎng)上，用2％磷鎢酸溶液染色，用濾紙吸走多余液體后，自然揮干，在透射電鏡下觀察其形態(tài)，并對其拍照。

結(jié)果見圖3，a為普通納米粒，b為肉毒堿修飾納米粒，而這均呈圓整的球形結(jié)構(gòu)，分散性好且粒徑分布均一。此外，透射電鏡照片顯示的納米粒粒徑相較動(dòng)態(tài)光散射測定的粒徑較小(圖4)，是因?yàn)橥干潆婄R樣品制備過程中，納米粒失水發(fā)生皺縮，粒徑變小，而動(dòng)態(tài)管散射測定的是水動(dòng)力學(xué)半徑，由于水化層的影響，粒徑相對較大。

實(shí)施例9.

動(dòng)態(tài)光散射技術(shù)測定納米粒粒徑及分布

采用動(dòng)態(tài)光散射法(dynamiclightscattering,dls)測定納米粒的粒徑及粒徑分布，它利用粒子被光束照射時(shí)向各個(gè)方向散射和衍射的強(qiáng)度與粒子大小有關(guān)的原理來測定粒子的大小和分布。具體操作為取一定量納米粒分散溶液，放入樣品池使液柱高為1cm，介質(zhì)為水，在25℃下進(jìn)行測定。此外，將所制備的納米粒溶液放置于4℃環(huán)境下貯存，分別于第1，2，3，4，5，6，7，8，9，10，11，12，13，15天，按照上述方法操作測定制劑的粒徑以觀察其穩(wěn)定性。結(jié)果見圖4，在4℃條件下，半個(gè)月內(nèi)，納米粒的粒徑均不發(fā)生明顯變化，由此可知，所制備的納米粒粒徑穩(wěn)定性良好。

實(shí)施例10.

體外釋放實(shí)驗(yàn)

采用透析袋法測定紫杉醇納米粒的體外釋放行為。透析袋的截留分子量為12000～14000da，以ph7.4的pbs(含2％cremophorel,w/v)在37℃為釋放介質(zhì)，該介質(zhì)對紫杉醇有較好的增溶作用，從而能較好的保證漏槽條件。具體操作如下：分別移取未修飾的plga納米粒、修飾比為10％的靶向納米粒和修飾比為20％的靶向納米粒各2ml置于透析袋中，兩端夾緊后，加入30ml的釋放介質(zhì)，于37℃空氣浴下振蕩，轉(zhuǎn)速100rpm。分別于給定時(shí)間內(nèi)取樣2ml，同時(shí)補(bǔ)充相同體積的新鮮介質(zhì)，用0.22μm濾膜過濾，棄去初濾液，取續(xù)濾液20μl按含量測定項(xiàng)下方法測定溶液中紫杉醇含量。計(jì)算累積釋放百分?jǐn)?shù)，并繪制釋放曲線。具體結(jié)果見圖5，相對于溶液劑，納米粒均能緩慢地將藥物釋放出來，且沒有明顯的突釋，隨著修飾比例的增大，納米粒釋放藥物的速度更快?？赡芘c上述的過多的硬脂酰-l-肉毒堿導(dǎo)致納米粒表面的由于修飾產(chǎn)生的孔洞增多，因此表現(xiàn)出修飾比例越大，納米粒釋放藥物越快的特征。

實(shí)施例11.

表面元素化學(xué)分析

采用x射線光電子能譜分析(x-rayphotoelectronspectroscopy,xps)對納米粒進(jìn)行表面元素化學(xué)分析。xps可以用于表面元素的定量分析，根據(jù)能譜中光電子譜線強(qiáng)度(光電子峰的面積)來確定表面元素的含量及組成，以此來確定l-肉毒堿修飾在納米粒表面。直接將制備的納米粒凍干樣品壓成片(10×10mm)，置于樣品臺上，在真空條件下測定。束縛能范圍從0至1000ev，通能為50ev。

具體結(jié)果見圖6，由于制備空白納米粒的材料中只有肉毒堿含有氮元素，圖a顯示修飾后的納米粒相對于未修飾的納米粒，表面的氮元素增加，說明修飾后的肉毒堿在納米粒表面，不影響被轉(zhuǎn)運(yùn)體識別；圖b顯示隨著修飾比例的增加，納米粒表面的氮元素逐漸增加，更多的肉毒堿被修飾在納米粒表面。

實(shí)施例12.

x射線粉末衍射

對于藥物在納米粒中的存在狀態(tài)，將納米粒凍干，采用x射線粉末衍射技術(shù)進(jìn)行測定，結(jié)果見圖7。從圖中可以看出，紫杉醇藥物本身具有明顯的結(jié)晶峰，與空白納米?；旌现?，結(jié)晶峰依然存在，而包載進(jìn)納米粒的紫杉醇基本不存在結(jié)晶峰，說明紫杉醇在納米粒中以無定形態(tài)存在。

實(shí)施例13.

細(xì)胞水平評價(jià)納米?；趏ctn2的攝取機(jī)制

將各載體用熒光探針香豆素-6標(biāo)記，用于評價(jià)納米粒在細(xì)胞水平的攝取能力以及基于octn2的攝取機(jī)制。將caco-2細(xì)胞以1.5×10⁵細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)在24孔板中，48h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的密度及形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90％左右且形態(tài)良好時(shí)，分別用不同的緩沖液(nacl緩沖液，無na⁺緩沖液，無cl^-緩沖液，含有10mml-肉毒堿的nacl緩沖液)洗兩遍后，分別加入用不同緩沖液稀釋的熒光標(biāo)記的各載體，濃度為5μg/ml，每孔200μl，37℃孵育1h后，用冷pbs洗三次，每孔加入細(xì)胞裂解液500μl，避光條件下震蕩1h，將孔內(nèi)液體全部轉(zhuǎn)移至潔凈小管，斡旋混勻，轉(zhuǎn)移200μl樣品至96孔板中，采用多功能酶標(biāo)儀測定細(xì)胞攝取量(λex＝466nm，λem＝504nm)，另采用bca試劑盒法測定蛋白濃度，結(jié)果用單位蛋白質(zhì)量的熒光標(biāo)記物(μg/mg)來表示。結(jié)果見圖8，在nacl緩沖液中，l-肉毒堿修飾后，納米?？梢园邢騩ctn2轉(zhuǎn)運(yùn)體，經(jīng)肉毒堿修飾后的納米粒的攝取顯著增加，且隨著修飾量的增大，攝取效率先增加后減小，可能是由于過多的修飾反倒不利于納米粒的黏附和攝??；對于octn2來說，其主要采用na⁺驅(qū)動(dòng)的方式來轉(zhuǎn)運(yùn)底物，在octn2介導(dǎo)的納米粒攝取中，na⁺的驅(qū)動(dòng)作用依然很明顯，在無na⁺緩沖液中，靶向納米粒的攝取顯著降低；l-肉毒堿作為octn2的底物，可以顯著降低靶向納米粒的攝取，說明靶向納米粒主要采用octn2介導(dǎo)的方式入胞。因此，修飾有l(wèi)-肉毒堿的納米?？梢园邢騩ctn2，提高吸收，并且該過程是na⁺驅(qū)動(dòng)的，可以被游離的l-肉毒堿所抑制。實(shí)施例14.

納米粒攝取機(jī)制研究

將未修飾納米粒和10％-lc-plganps用熒光探針香豆素-6標(biāo)記，用于考察納米粒在細(xì)胞水平的攝取機(jī)制。將caco-2細(xì)胞以1.5×10⁵細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)在24孔板中，48h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的密度及形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90％左右且形態(tài)良好時(shí)，分別加入不同的內(nèi)吞抑制劑(采用4℃進(jìn)行能量抑制，直接在4℃孵育1h后，進(jìn)行后續(xù)細(xì)胞裂解處理)，37℃處理30min后，用37℃的pbs清洗2次，再分別加入熒光標(biāo)記的載體，濃度為5μg/ml，每孔200μl，37℃孵育1h后，用冷pbs洗三次，每孔加入細(xì)胞裂解液500μl，避光條件下震蕩1h，將孔內(nèi)液體全部轉(zhuǎn)移至潔凈小管，斡旋混勻，轉(zhuǎn)移200μl樣品至96孔板中，采用多功能酶標(biāo)儀測定細(xì)胞攝取量(λex＝466nm，λem＝504nm)，另采用bca試劑盒法測定蛋白濃度，計(jì)算單位蛋白質(zhì)量的熒光標(biāo)記物(μg/mg)，與未經(jīng)抑制劑處理的組比較，最后結(jié)果用相對攝取率(％)表示。結(jié)果見圖9，未修飾納米粒和靶向納米粒均采用內(nèi)吞的方式入胞，未修飾的納米粒主要采用網(wǎng)格蛋白和小窩蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞方式，肉毒堿修飾后的納米粒主要采用網(wǎng)格蛋白、小屋蛋白介導(dǎo)的、以及巨胞飲的內(nèi)吞方式入胞，說明修飾后的肉毒堿對納米粒的入胞方式產(chǎn)生了影響。

實(shí)施例13.

共聚焦顯微鏡可視化觀察納米粒攝取

將各載體用熒光探針香豆素-6標(biāo)記，用于示蹤納米粒在細(xì)胞水平的攝取。將caco-2細(xì)胞以2×10⁵細(xì)胞/孔的密度培養(yǎng)在帶有蓋玻片的24孔板中，48h后，在顯微鏡下觀察細(xì)胞的密度及形態(tài)，當(dāng)細(xì)胞密度達(dá)到90％左右且形態(tài)良好時(shí)，分別加入熒光標(biāo)記的各載體，濃度為4μg/ml，每孔200μl，37℃孵育1h后，用冷pbs洗3次，將蓋玻片小心取出，用含有dapi的封片液封片，避光室溫保存12h后，用共聚焦顯微鏡觀察。結(jié)果見圖10，隨著修飾量的增加，納米粒的攝取效率會(huì)顯著增加，說明該靶向納米粒可以顯著提高攝??；但是，當(dāng)納米粒修飾量增加到一定程度后，過多的配基反倒限制了納米粒的攝取，說明存在一個(gè)最優(yōu)的配基密度，在這個(gè)密度條件下，該靶向納米粒的攝取可以達(dá)到最大效果。

實(shí)施例14.

大鼠腸灌流實(shí)驗(yàn)考察靶向納米粒的透膜性

大鼠實(shí)驗(yàn)前禁食12h(可自由飲水)，用20％(w/w)的烏拉坦腹腔注射麻醉(1.0g·kg-1)。將大鼠固定在恒溫手術(shù)臺上，沿腹中線剪開3.0～4.0cm的開口，打開腹腔后，分離出待考察腸段約10cm，兩端切口插管后結(jié)扎，用預(yù)熱至37℃的生理鹽水輕緩的將內(nèi)容物清洗干凈，再用空氣將生理鹽水排凈。實(shí)驗(yàn)前用供試液將管路飽和30min，直至出液口藥液濃度與進(jìn)液口供試液濃度相等，以消除實(shí)驗(yàn)過程中管路對藥物的吸附作用。將傷口用浸有生理鹽水的脫脂棉覆蓋保濕，用紅外燈維持體溫(37±0.5)℃。進(jìn)口處用已知重量的裝有供試液的小瓶進(jìn)行灌流，流速為0.2ml·min-1，每隔15min在出口處用一已知重量的小瓶收集一次(同時(shí)迅速更換下一個(gè)供試液小瓶和收集液小瓶)，稱量此時(shí)供試液小瓶和收集液小瓶的重量，計(jì)算灌入和收集的供試品質(zhì)量，實(shí)驗(yàn)持續(xù)時(shí)間為105min。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，將大鼠處死，剪下被灌流腸段，測量其長度(l)和內(nèi)徑(r)，計(jì)算小腸吸收的表面積。所收集的樣品過濾后用上述hplc法測定質(zhì)量濃度。將所測數(shù)據(jù)按公式計(jì)算吸收速率常數(shù)ka和表觀滲透系數(shù)papp。每組供試液在體腸吸收實(shí)驗(yàn)均按以上操作進(jìn)行，每組3只。結(jié)果見圖11、圖12，在四個(gè)不同的腸段，紫杉醇納米粒相對于紫杉醇溶液劑表現(xiàn)出了更好的滲透特性，納米?？赡艽嬖谔厥獾奈胀緩?胞吞、m細(xì)胞轉(zhuǎn)運(yùn)等)；而octn2靶向納米粒比普通納米粒的滲透性更好，說明靶向納米?？稍黾蛹{米粒的攝取，可能與octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體的相互作用有關(guān)；不同修飾比例的納米粒的吸收特性與細(xì)胞水平研究一致，在修飾比例達(dá)到10％時(shí)，吸收效率最高，當(dāng)加入過量的肉毒堿時(shí)，其攝取效率顯著降低，說明octn2轉(zhuǎn)運(yùn)體在靶向納米粒的攝取過程中具有重要作用。

實(shí)施例15.

納米粒的腸段生物分布

大鼠禁食(自由飲水)12h后，分別灌胃給予香豆素-6標(biāo)記的plganps和10％lc-plganps，給藥劑量為1mg/kg。45min后，處死大鼠，分別取出約1cm長的十二指腸、空腸、回腸和結(jié)腸，采用pbs清洗干凈后，用濾紙吸去腸斷表面的水分，置于包埋劑(otc)中并于-80℃冷凍。將凍實(shí)的腸斷切成10μm厚的薄片，置于陽離子樹脂載玻片上，用4％的多聚甲醛室溫固定10min。pbs清洗兩次后，用羅丹明鬼筆環(huán)肽于37℃孵育90min。pbs清洗兩次后，用dapi于室溫染色5min。pbs清洗2次后，滴加封片液，加置蓋玻片，采用共聚焦顯微鏡拍照。結(jié)果見圖13。由于octn2在全腸斷均有分布，因此在四個(gè)腸斷，10％lc-plganps的攝取顯著高于plganps的攝取，說明該靶向納米粒具有明顯的優(yōu)勢。

實(shí)施例16.

大鼠體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)實(shí)驗(yàn)

大鼠30只于實(shí)驗(yàn)前稱量體重，禁食12h不禁水。實(shí)驗(yàn)時(shí)隨機(jī)分為5組(plganps，5％-lc-plganps，10％-lc-plganps，20％-lc-plganps，40％-lc-plganps)，每組6只，口服灌胃方式給藥。每只大鼠注射紫杉醇的劑量為10mg·kg^-1。分別與給藥后0.5、1、2、3、4、6、8、12、24、36、48、72h眼眶取血0.3ml，置于已涂肝素的試管中，于10000rpm條件下離心10min，取出上層血漿，采用lc-ms-ms技術(shù)測定血漿藥物含量。結(jié)果見圖14、圖15，修飾后的納米?？诜诊@著增加，紫杉醇口服生物利用都顯著提高；且與細(xì)胞水平和組織水平結(jié)果相似的是，過多的肉毒堿修飾反而會(huì)抑制靶向納米粒的吸收。

本發(fā)明的載體同樣可以與其它抗腫瘤藥物，如多西他賽、羥基喜樹堿、喜樹堿、長春新堿、尼莫地平、絲裂霉素，包載形成octn2靶向含藥納米粒，從而提高抗腫瘤藥物的口服吸收，提高其口服生物利用度。