本發(fā)明屬于醫(yī)學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種特異性shrna篩選及其靶向ang-2基因抑制肺癌細(xì)胞的驗(yàn)證方法。

背景技術(shù)：

肺癌在當(dāng)今世界仍然是一種最常見的人類惡性腫瘤以及癌癥相關(guān)死亡的主要原因，肺癌5年生存率低，術(shù)后復(fù)發(fā)率高，預(yù)后差，即使手術(shù)后的i期肺癌患者10年生存率可達(dá)90%。治療方法以手術(shù)為主，放療化療為輔的綜合治療，但由于轉(zhuǎn)移和耐藥等原因，使多種化療藥物療效降低甚至無效。雖然已有多種靶向藥物能延長(zhǎng)肺癌患者的生存時(shí)間，但仍然不能降低肺癌死亡率，仍需探索新的分子標(biāo)記和分子靶點(diǎn)作為肺癌新的治療策略。肺癌的發(fā)生發(fā)展是一個(gè)多階段的復(fù)雜病理過程，涉及基因突變、表觀遺傳學(xué)改變及多種信號(hào)通路調(diào)節(jié)異常。對(duì)于腫瘤生物學(xué)的理解只強(qiáng)化了血管生成在腫瘤發(fā)展中的作用，它提供正常生理需求的氧氣和營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)。腫瘤微環(huán)境中，腫瘤動(dòng)態(tài)平衡利于促成持續(xù)促血管生成狀態(tài)；沒有足夠的血管支持，腫瘤的大小將被限制在直徑幾毫米。

隨著腫瘤體積增大，耗氧量增加，使組織缺氧誘導(dǎo)因子-1α(hif-1α)過表達(dá)，誘導(dǎo)血管生成相關(guān)蛋白血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子(vegf)與血管生成素-2(angiopoietin,ang-2)過表達(dá)從而影響放化療，并促使癌細(xì)胞更具侵襲性。肺癌組織和細(xì)胞中ang-2表達(dá)的生物學(xué)特征值得探討，有可能是影響肺癌患者預(yù)后的重要因素。而腫瘤新生血管是為腫瘤細(xì)胞輸送氧及營(yíng)養(yǎng)物質(zhì)的通道，也是實(shí)現(xiàn)腫瘤轉(zhuǎn)移的重要通道之一。ang-2通過競(jìng)爭(zhēng)性的抑制ang-1的生物功能，降低了血管的穩(wěn)定性，繼而導(dǎo)致血管的高度不穩(wěn)定性、不成熟性，在腫瘤的血管生成中起著至關(guān)重要的作用。ang-2介導(dǎo)血管生成和腫瘤進(jìn)展的詳細(xì)機(jī)制仍有爭(zhēng)議。

rna干擾（rnainterference,rnai）是目前日趨發(fā)展和逐漸成熟的一門新興的基因沉默技術(shù)。ang-2是調(diào)節(jié)腫瘤血管生成的關(guān)鍵因子，有研究表明，ang-2高表達(dá)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞之間的干擾被持續(xù)中斷。此外，內(nèi)皮細(xì)胞中高濃度ang-2通過激活磷脂酰肌醇3′激酶/akt信號(hào)通路阻斷細(xì)胞凋亡。在腫瘤轉(zhuǎn)移(如口腔鱗癌)的初始步驟是通過emt誘導(dǎo)的血管生成，這可通過血管生成的關(guān)鍵因子ang-2介導(dǎo)。因此可以推測(cè)ang-2過表達(dá)與目前肺癌的血管生成侵襲、遷移及轉(zhuǎn)移密切相關(guān)，干擾ang-2表達(dá)可能成為肺癌治療的突破點(diǎn)，因此ang-2作為預(yù)后相關(guān)的新靶點(diǎn)，具有開發(fā)與應(yīng)用前景。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于針對(duì)現(xiàn)有技術(shù)的不足，現(xiàn)提供一種具有開發(fā)與應(yīng)用前景的特異性shrna篩選及其靶向ang-2基因抑制肺癌細(xì)胞的驗(yàn)證方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用的技術(shù)方案為：特異性shrna篩選及其靶向ang-2基因抑制肺癌細(xì)胞的驗(yàn)證方法，其創(chuàng)新點(diǎn)在于：經(jīng)細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、干擾前后實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ang-2表達(dá)、干擾前后細(xì)胞中蛋白表達(dá)分析、cck-8方法檢測(cè)干擾ang-2基因前后的肺癌細(xì)胞增殖能力及干擾前后細(xì)胞侵襲、遷移能力改變的檢測(cè)的步驟完成對(duì)特異性shrna的篩選及其靶向ang-2基因抑制肺癌細(xì)胞的驗(yàn)證；

所述干擾前后實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ang-2表達(dá)的具體步驟包括totalrna提取、逆轉(zhuǎn)錄cdna和熒光定量rt-pcr。

進(jìn)一步的，所述細(xì)胞復(fù)蘇的具體步驟為：

從-80℃冰箱將細(xì)胞beas-2b、spca-1、nci-h1650、a549和nci-h1975的凍存管取出，立即放入37℃恒溫水浴鍋中快速震蕩解凍；

完全解凍情況下，用75%酒精消毒擦拭凍存管后置于超凈臺(tái)；

將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10mlrpmi-1640完全培養(yǎng)基中混勻后在1000rpm環(huán)境下離心5min；

棄上清液后加3mlrpmi-1640完全培養(yǎng)液輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，置37℃、5%co2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，酌情換液繼續(xù)培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，所述細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟為：

細(xì)胞密度>80%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化和傳代，棄去舊培養(yǎng)液后，使用pbs洗滌兩次，加入2ml含edta的0.25%胰蛋白酶消化液；

將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)變圓、胞質(zhì)回縮及細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸棄胰蛋白酶消化液，加入6-8mlrpmi-1640完全培養(yǎng)基吹打重懸細(xì)胞得到細(xì)胞懸液；

將細(xì)胞懸液按1:2或1:3分裝于兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，再加入rpmi-1640完全培養(yǎng)基使培養(yǎng)瓶中總量達(dá)3ml，將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

進(jìn)一步的，所述細(xì)胞轉(zhuǎn)染的具體步驟為：

將a549細(xì)胞接種于六孔板中，加入2mlrpmi-1640無抗培養(yǎng)基，接種數(shù)量為5×10⁵-8×10⁵；

當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至全孔60%后，在兩份170μlrpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2.5μgshrna和nc-shrna，柔和混勻，得到shrna稀釋液和nc-shrna稀釋液；

用50μlrpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋6μlengreen轉(zhuǎn)染試劑，輕輕捶打3-5次，室溫靜置5min，得到轉(zhuǎn)染試劑稀釋液；

混勻shrna稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液得到shrna混合液，室溫靜置15-20min；

分別在shrna混合液和nc-shrna稀釋液中轉(zhuǎn)入a549細(xì)胞形成shrna實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，并設(shè)置空白對(duì)照組，24h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

進(jìn)一步的，所述干擾前后實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ang-2表達(dá)的totalrna提取具體步驟：

收集細(xì)胞至1.5mlrna-free離心管中，離心管加入1mltrizol總rna提取液并充分混勻，室溫靜置5min；

在靜置后的離心管分別加入0.2ml三氯甲烷后劇烈震蕩15s，室溫靜置2min；

在4℃，12000r/min的環(huán)境下離心15min，吸取上清至新1.5ml離心管中；加入與上清液等量的異丙醇輕輕混勻，室溫靜置10min；

在4℃，12000r/min的環(huán)境下離心10min后棄上清，加入1ml預(yù)冷的75%乙醇，所述75%乙醇由depc水配置，輕輕洗滌沉淀，在4℃，7500r/min的環(huán)境下離心5min，棄上清并晾干；

加入20uldepc水，所述depc水為在65℃環(huán)境下促溶10-15min所得；使用紫外分光光度儀測(cè)定提取rna的濃度和純度，depc水調(diào)零。

進(jìn)一步的，所述干擾前后實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ang-2表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄cdna的具體步驟包括：

取oligodt18primer1μl，5xreactionbuffer4μl，ribolocktmribonucleaseinhibitor1μl，10mmdntpmix2μl，totalrna5μl，revertaidtmreversetranscriptase1μl，加入rnasefreedh2o至總體積為20μl，混勻后離心，42℃環(huán)境下孵育1h，在70℃環(huán)境下保持5min后終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄為cdna溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

進(jìn)一步的，所述干擾前后實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ang-2表達(dá)中熒光定量rt-pcr的具體步驟為：取sybrgreen/roxmastermix12.5μl，forwardprimer0.3μm，reverseprimer0.3μm，water10.5μl，cdna溶液1μl，總體積為25μl，經(jīng)appliedbiosystems7500realtimepcrsystem儀反應(yīng)；經(jīng)過95℃10min預(yù)變性后進(jìn)入pcr循環(huán)，95℃15s變性，60℃1min退火延伸，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。

進(jìn)一步的，所述干擾前后細(xì)胞中蛋白表達(dá)分析的具體步驟為：

a.蛋白抽提和濃度測(cè)定：pbs沖洗貼壁細(xì)胞兩遍后，加適量含1%的pmsf及磷酸酶抑制劑的裂解液，冰上裂解15min，用刮板收集細(xì)胞，在4℃12000r/min環(huán)境下離心20min，以bca法測(cè)定濃度，稀釋到最佳上樣量；按sds-page蛋白上樣緩沖液體積：蛋白體積=1：4的比例加入蛋白上樣緩沖液，并于100℃煮5min，使蛋白變性；所收集到的變性蛋白立即使用或-80℃保存待用；

b.westernblotting免疫印跡試驗(yàn)：

制備10%sds聚丙烯酰胺凝膠分離膠和5%濃縮膠，所述分離膠的配方為：ddh2o1.3ml，1mol/lph8.8tris-hcl1.9ml，30%arc-bis1.7ml，10%sds50μl，temed2μl及10%過硫酸銨50μl；所述濃縮膠的配方為：ddh2o1.4ml，1mol/lph6.8tris-hcl0.25ml，30%arc-bis0.33ml，10%sds20μl，temed2μl及10%過硫酸銨ap20μl；

向電泳槽內(nèi)加入足量電泳緩沖液，所述電泳緩沖液的配方為：sds1g，tris3.02g，甘氨酸14.4g，ddh2o1000ml；

調(diào)節(jié)所收集的變性蛋白濃度和每個(gè)孔上樣體積，使每孔上樣總量達(dá)200μg進(jìn)行電泳；電泳恒壓80v×40min，后100v×1h；

電泳結(jié)束后將切好的sds聚丙烯酰胺凝膠分離膠放入轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)，加入800ml轉(zhuǎn)膜緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒流300ma×2h；所述轉(zhuǎn)膜緩沖液的配方為tris3.02g，甘氨酸14.4g，ddh2o600ml，100%甲醇200ml；

待蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜后拿出，使用tbst緩沖液漂洗5min，共漂洗4次，所述tbst緩沖液的配方為：nacl8.0g，tris2.42g，tween-200.5ml，ddh2o1000ml；室溫下，封閉液脫色搖床封閉1h；

tbst緩沖液漂洗5min，共漂洗3次，加入1：1000的兔抗人ang-2、1：200倍的鼠抗人e-cadherin、1：2000倍的鼠抗人vim、1：500倍的鼠抗人snail、1：200倍的鼠抗人twist及1：2000倍的鼠抗人β-actin抗體作為內(nèi)參，4℃環(huán)境下過夜，tbst緩沖液漂洗5min，共漂洗4次，tbst緩沖液按1:1000稀釋辣根過氧化物酶hrp標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠igg二抗，37℃孵育60min，洗滌后ecl顯色并拍照。

進(jìn)一步的，所述cck-8方法檢測(cè)干擾ang-2基因前后的肺癌細(xì)胞增殖能力的具體步驟：

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組：shrna實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，在96孔板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期a549細(xì)胞，每孔約2000個(gè)，每孔100μl；

24小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6h為cck8實(shí)驗(yàn)0h，分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h、72h細(xì)胞增殖情況，每個(gè)時(shí)段設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；

每孔加入10μlcck8溶液繼續(xù)培養(yǎng)120min，用多功能酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度a450值，取其均值。

進(jìn)一步的，所述干擾前后細(xì)胞侵襲、遷移能力改變的檢測(cè)的具體步驟：

將rpmi-1640無血清培養(yǎng)基與matrigel基質(zhì)膠按照4:1比例對(duì)matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋形成基質(zhì)膠稀釋液；

取shrna轉(zhuǎn)染后的shrna實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組的細(xì)胞，用胰酶消化后離心，使用rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1x10⁵/ml；

將調(diào)整細(xì)胞密度后的shrna實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞接種于3個(gè)transwell小室，每個(gè)transwell小室分別加50μl基質(zhì)膠稀釋液，在37℃環(huán)境下孵育2h，待膠凝固作為侵襲組；

將調(diào)整細(xì)胞密度后的shrna實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞接種于3個(gè)transwell小室，作為遷移組；

每個(gè)小室加入200μl細(xì)胞懸液，24孔板加入600μlrpmi-1640完全培養(yǎng)基，將transwell小室放入24孔板并在37℃、5%co2培養(yǎng)箱中孵育，遷移組12h，侵襲組24h；

取出培養(yǎng)箱中的transwell小室，使用pbs清洗2遍，用棉簽輕輕拭去小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，pbs再洗2遍；

將小室濾膜用4%多聚甲醛固定20min，棄固定液，每孔加入600μl結(jié)晶紫染液染色15min，pbs清洗3遍后將小室取出，自然干燥；

正置于載玻片，放于熒光顯微鏡下拍照，并計(jì)數(shù)每個(gè)小室外側(cè)的中央部分及其周圍隨機(jī)3個(gè)視野。

本發(fā)明的有益效果如下：本發(fā)明實(shí)現(xiàn)篩選對(duì)ang-2基因轉(zhuǎn)錄干擾具有特異性ang-2-shrna1有效質(zhì)粒轉(zhuǎn)染肺癌細(xì)胞，同時(shí)能夠驗(yàn)證了特異性shrna靶向干擾ang-2能夠有效抑制癌細(xì)胞的增殖、侵襲、遷移等生物學(xué)能力，為治療肺癌提供一種新的治療方向，抑制ang-2彌補(bǔ)抗vegfr單一療法的局限性。

附圖說明

圖1a-圖1e分別為spca-1、nci-h1650、a549、nci-h1975、beas-2b中ang-2表達(dá)的鏡下觀察圖；

圖2為beas-2b、spca-1、nci-h1650、a549、nci-h1975中ang-2蛋白表達(dá)的westernblotting分析圖譜；

圖3為beas-2b、spca-1、nci-h1650、a549、nci-h1975細(xì)胞中ang-2蛋白與β-actin的相對(duì)比率(n=3)；

圖4為beas-2b、spca-1、nci-h1650、a549、nci-h1975細(xì)胞株中ang-2mrna表達(dá)水平(n=3)；

圖5a-圖5b分別為shrna成功轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞轉(zhuǎn)染平衡光圖和shrna成功轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光圖；

圖6為shrna實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組時(shí)a549細(xì)胞中ang-2蛋白表達(dá)的westernblotting分析圖譜；

圖7為shrna實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組時(shí)a549細(xì)胞中ang-2蛋白與β-actin的相對(duì)比率(n=3)；

圖8為shrna實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組時(shí)a549細(xì)胞中ang-2mrna表達(dá)水平(n=3)；

圖9為shrna實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組分別干擾ang-2后對(duì)a549細(xì)胞增殖能力影響的統(tǒng)計(jì)分析圖；

圖10中左邊附圖為shrna實(shí)驗(yàn)組的a549細(xì)胞侵襲結(jié)晶紫染色圖，中間附圖為陰性對(duì)照組的a549細(xì)胞侵襲結(jié)晶紫染色圖，右邊附圖為空白對(duì)照組的a549細(xì)胞侵襲結(jié)晶紫染色圖；

圖11為細(xì)胞遷移計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；

圖12為細(xì)胞侵襲計(jì)數(shù)統(tǒng)計(jì)圖；

圖13為干擾ang-2后蛋白e-cadherin,snail,twist和vimentin表達(dá)的westernblotting分析圖譜；

圖14為shrna實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中蛋白e-cadherin,snail,twist和vimentin與β-actin的相對(duì)比率(n=3)。

具體實(shí)施方式

以下由特定的具體實(shí)施例說明本發(fā)明的實(shí)施方式，熟悉此技術(shù)的人士可由本說明書所揭露的內(nèi)容輕易地了解本發(fā)明的其他優(yōu)點(diǎn)及功效。

特異性shrna篩選及其靶向ang-2基因抑制肺癌細(xì)胞的驗(yàn)證方法，經(jīng)細(xì)胞復(fù)蘇、細(xì)胞培養(yǎng)、細(xì)胞轉(zhuǎn)染、干擾前后實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ang-2表達(dá)、干擾前后細(xì)胞中蛋白表達(dá)分析、cck-8方法檢測(cè)干擾ang-2基因前后的肺癌細(xì)胞增殖能力及干擾前后細(xì)胞侵襲、遷移能力改變的檢測(cè)的步驟完成對(duì)特異性shrna的篩選及其靶向ang-2基因抑制肺癌細(xì)胞的驗(yàn)證；

實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ang-2表達(dá)的具體步驟包括totalrna提取、逆轉(zhuǎn)錄cdna和熒光定量rt-pcr。

其中，細(xì)胞復(fù)蘇的具體步驟為：

從-80℃冰箱將細(xì)胞beas-2b、spca-1、nci-h1650、a549和nci-h1975的凍存管取出，立即放入37℃恒溫水浴鍋中快速震蕩解凍；

完全解凍情況下，用75%酒精消毒擦拭凍存管后置于超凈臺(tái)；

將細(xì)胞轉(zhuǎn)移至10mlrpmi-1640完全培養(yǎng)基中混勻后在1000rpm環(huán)境下離心5min；

棄上清液后加3mlrpmi-1640完全培養(yǎng)液輕輕吹打混勻，將細(xì)胞懸液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)瓶，置37℃、5%co2及飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，次日觀察細(xì)胞生長(zhǎng)情況，酌情換液繼續(xù)培養(yǎng)。

其中，細(xì)胞培養(yǎng)的具體步驟為：

細(xì)胞密度>80%時(shí)對(duì)細(xì)胞進(jìn)行消化和傳代，棄去舊培養(yǎng)液后，使用pbs洗滌兩次，加入2ml含edta的0.25%胰蛋白酶消化液；

將培養(yǎng)瓶置于顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)變化，當(dāng)細(xì)胞形態(tài)變圓、胞質(zhì)回縮及細(xì)胞間隙增大時(shí)，吸棄胰蛋白酶消化液，加入8mlrpmi-1640完全培養(yǎng)基吹打重懸細(xì)胞得到細(xì)胞懸液；

將細(xì)胞懸液按1:2或1:3分裝于兩個(gè)新的培養(yǎng)瓶中，再加入rpmi-1640完全培養(yǎng)基使培養(yǎng)瓶中總量達(dá)3ml，將培養(yǎng)瓶置于培養(yǎng)箱中繼續(xù)培養(yǎng)。

其中，細(xì)胞轉(zhuǎn)染的具體步驟為：

將a549細(xì)胞接種于六孔板中，加入2mlrpmi-1640無抗培養(yǎng)基，接種數(shù)量為5×10⁵-8×10⁵；

當(dāng)細(xì)胞密度長(zhǎng)至全孔60%后，在兩份170μlrpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基中分別加入2.5μgshrna和nc-shrna，柔和混勻，得到shrna稀釋液和nc-shrna稀釋液；

用50μlrpmi1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基稀釋6μlengreen轉(zhuǎn)染試劑，輕輕捶打3-5次，室溫靜置5min，得到轉(zhuǎn)染試劑稀釋液；

混勻shrna稀釋液和轉(zhuǎn)染試劑稀釋液得到shrna混合液，室溫靜置15-20min；

分別在shrna混合液和nc-shrna稀釋液中轉(zhuǎn)入a549細(xì)胞形成shrna實(shí)驗(yàn)組和陰性對(duì)照組，并設(shè)置空白對(duì)照組，24h后熒光顯微鏡觀察轉(zhuǎn)染效率。

其中，干擾前后實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ang-2表達(dá)的totalrna提取具體步驟：

收集細(xì)胞至1.5mlrna-free離心管中，離心管加入1mltrizol總rna提取液并充分混勻，室溫靜置5min；

在靜置后的離心管分別加入0.2ml三氯甲烷后劇烈震蕩15s，室溫靜置2min；

在4℃，12000r/min的環(huán)境下離心15min，吸取上清至新1.5ml離心管中；加入與上清液等量的異丙醇輕輕混勻，室溫靜置10min；

在4℃，12000r/min的環(huán)境下離心10min后棄上清，加入1ml預(yù)冷的75%乙醇，所述75%乙醇由depc水配置，輕輕洗滌沉淀，在4℃，7500r/min的環(huán)境下離心5min，棄上清并晾干；

加入20uldepc水，所述depc水為在65℃環(huán)境下促溶10-15min所得；使用紫外分光光度儀測(cè)定提取rna的濃度和純度，depc水調(diào)零。

其中，干擾前后實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ang-2表達(dá)的逆轉(zhuǎn)錄cdna的具體步驟包括：

取oligodt18primer1μl，5xreactionbuffer4μl，ribolocktmribonucleaseinhibitor1μl，10mmdntpmix2μl，totalrna5μl，revertaidtmreversetranscriptase1μl，加入rnasefreedh2o至總體積為20μl，混勻后離心，42℃環(huán)境下孵育1h，在70℃環(huán)境下保持5min后終止反應(yīng)，轉(zhuǎn)錄為cdna溶液，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

其中，干擾前后實(shí)時(shí)熒光定量pcr檢測(cè)ang-2表達(dá)中熒光定量rt-pcr的具體步驟為：取sybrgreen/roxmastermix12.5μl，forwardprimer0.3μm，reverseprimer0.3μm，water10.5μl，cdna溶液1μl，總體積為25μl，經(jīng)appliedbiosystems7500realtimepcrsystem儀反應(yīng)；經(jīng)過95℃10min預(yù)變性后進(jìn)入pcr循環(huán)，95℃15s變性，60℃1min退火延伸，反應(yīng)40個(gè)循環(huán)。

其中，干擾前后細(xì)胞中蛋白表達(dá)分析的具體步驟為：

a.蛋白抽提和濃度測(cè)定：pbs沖洗貼壁細(xì)胞兩遍后，加適量含1%的pmsf及磷酸酶抑制劑的裂解液，冰上裂解15min，用刮板收集細(xì)胞，在4℃12000r/min環(huán)境下離心20min，以bca法測(cè)定濃度，稀釋到最佳上樣量；按sds-page蛋白上樣緩沖液體積：蛋白體積=1：4的比例加入蛋白上樣緩沖液，并于100℃煮5min，使蛋白變性；所收集到的變性蛋白立即使用或-80℃保存待用；

b.westernblotting免疫印跡試驗(yàn)：

制備10%sds聚丙烯酰胺凝膠分離膠和5%濃縮膠，所述分離膠的配方為：ddh2o1.3ml，1mol/lph8.8tris-hcl1.9ml，30%arc-bis1.7ml，10%sds50μl，temed2μl及10%過硫酸銨50μl；所述濃縮膠的配方為：ddh2o1.4ml，1mol/lph6.8tris-hcl0.25ml，30%arc-bis0.33ml，10%sds20μl，temed2μl及10%過硫酸銨ap20μl；

向電泳槽內(nèi)加入足量電泳緩沖液，所述電泳緩沖液的配方為：sds1g，tris3.02g，甘氨酸14.4g，ddh2o1000ml；

調(diào)節(jié)所收集的變性蛋白濃度和每個(gè)孔上樣體積，使每孔上樣總量達(dá)200μg進(jìn)行電泳；電泳恒壓80v×40min，后100v×1h；

電泳結(jié)束后將切好的sds聚丙烯酰胺凝膠分離膠放入轉(zhuǎn)膜槽內(nèi)，加入800ml轉(zhuǎn)膜緩沖液進(jìn)行轉(zhuǎn)膜，恒流300ma×2h；所述轉(zhuǎn)膜緩沖液的配方為tris3.02g，甘氨酸14.4g，ddh2o600ml，100%甲醇200ml；

待蛋白轉(zhuǎn)移至pvdf膜后拿出，使用tbst緩沖液漂洗5min，共漂洗4次，所述tbst緩沖液的配方為：nacl8.0g，tris2.42g，tween-200.5ml，ddh2o1000ml；室溫下，封閉液脫色搖床封閉1h；

tbst緩沖液漂洗5min，共漂洗3次，加入1：1000的兔抗人ang-2、1：200倍的鼠抗人e-cadherin、1：2000倍的鼠抗人vim、1：500倍的鼠抗人snail、1：200倍的鼠抗人twist及1：2000倍的鼠抗人β-actin抗體作為內(nèi)參，4℃環(huán)境下過夜，tbst緩沖液漂洗5min，共漂洗4次，tbst緩沖液按1:1000稀釋辣根過氧化物酶hrp標(biāo)記的羊抗兔或羊抗鼠igg二抗，37℃孵育60min，洗滌后ecl顯色并拍照。

其中，cck-8方法檢測(cè)干擾ang-2基因前后的肺癌細(xì)胞增殖能力的具體步驟：

設(shè)置實(shí)驗(yàn)組：shrna實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，shrna實(shí)驗(yàn)組包括shrna1、shrna2和shrna3，shrna1的序列為ttactcattgtatgaacat、shrna2的序列為ctaattctacagaagagat和shrna3的序列為cacggtgaataattcagtt；

在96孔板中接種對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期a549細(xì)胞，每孔約2000個(gè)，每孔100μl；

24小時(shí)后進(jìn)行細(xì)胞轉(zhuǎn)染，轉(zhuǎn)染后6h為cck8實(shí)驗(yàn)0h，分別檢測(cè)轉(zhuǎn)染后0h、24h、48h、72h細(xì)胞增殖情況，每個(gè)時(shí)段設(shè)置3個(gè)復(fù)孔；

每孔加入10μlcck8溶液繼續(xù)培養(yǎng)120min，用多功能酶標(biāo)儀在450nm波長(zhǎng)測(cè)量各孔的吸光度a450值，取其均值。

其中，干擾前后細(xì)胞侵襲、遷移能力改變的檢測(cè)的具體步驟：

將rpmi-1640無血清培養(yǎng)基與matrigel基質(zhì)膠按照4:1比例對(duì)matrigel基質(zhì)膠進(jìn)行稀釋形成基質(zhì)膠稀釋液；

取shrna轉(zhuǎn)染后的shrna實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組及空白對(duì)照組的細(xì)胞，用胰酶消化后離心，使用rpmi-1640基礎(chǔ)培養(yǎng)基重懸并進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)，調(diào)整細(xì)胞密度為1x10⁵/ml；

將調(diào)整細(xì)胞密度后的shrna實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞接種于3個(gè)transwell小室，每個(gè)transwell小室分別加50μl基質(zhì)膠稀釋液，在37℃環(huán)境下孵育2h，待膠凝固作為侵襲組；

將調(diào)整細(xì)胞密度后的shrna實(shí)驗(yàn)組，陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組的細(xì)胞接種于3個(gè)transwell小室，作為遷移組；

每個(gè)小室加入200μl細(xì)胞懸液，24孔板加入600μlrpmi-1640完全培養(yǎng)基，將transwell小室放入24孔板并在37℃、5%co2培養(yǎng)箱中孵育，遷移組12h，侵襲組24h；

取出培養(yǎng)箱中的transwell小室，使用pbs清洗2遍，用棉簽輕輕拭去小室內(nèi)側(cè)細(xì)胞，pbs再洗2遍；

將小室濾膜用4%多聚甲醛固定20min，棄固定液，每孔加入600μl結(jié)晶紫染液染色15min，pbs清洗3遍后將小室取出，自然干燥；

正置于載玻片，放于熒光顯微鏡下拍照，并計(jì)數(shù)每個(gè)小室外側(cè)的中央部分及其周圍隨機(jī)3個(gè)視野。

圖1a-圖1e分別為肺癌細(xì)胞spca-1、nci-h1650、a549、nci-h1975及正常肺上皮細(xì)胞beas-2b篩選高表達(dá)ang-2細(xì)胞株，五株細(xì)胞在完培中貼壁生長(zhǎng)，繁殖較快，其中beas-2b，spca-1，a549，nci-1650細(xì)胞2-3天傳代一次，nci-h1975細(xì)胞3-4天傳代一次，各細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)良好。

如圖2-圖4所示為用westernblot檢測(cè)spca-1、nci-h1650、a549、nci-h1975及正常肺上皮細(xì)胞beas-2b這五株細(xì)胞中ang-2蛋白表達(dá)及基因水平表達(dá)。正常肺上皮細(xì)胞beas-2b中ang-2表達(dá)量最少，癌細(xì)胞中a549及nci-h1975表達(dá)量高，qrt-pcr以正常肺上皮細(xì)胞作為對(duì)照組，結(jié)果與westernblot一致。

圖5a與圖5b所示分別為shrna成功轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞轉(zhuǎn)染平衡光圖和shrna成功轉(zhuǎn)染a549細(xì)胞轉(zhuǎn)染熒光圖。

如圖6-圖7所示，westernblotting結(jié)果顯示shrna實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間ang-2表達(dá)差異明顯，其中以序列為ttactca-ttgtatgaacat的shrna-1抑制最顯著。rt-pcr結(jié)果顯示陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中ang-2表達(dá)比shrna實(shí)驗(yàn)組高。如圖8所示，實(shí)驗(yàn)組中的shrna-1、shrna-2、shrna-3對(duì)ang-2-mrna抑制效率分別為63.44%，10.81%，8.19%，rt-pcr以空白對(duì)照組為對(duì)照，結(jié)果與westernblotting相一致，同樣顯示shrna-1對(duì)ang-2表達(dá)的抑制作用最明顯。westernblotting和rt-pcr均表明序列為ttactca-ttgtatgaacat的shrna-1對(duì)ang-2的抑制作用最明顯，篩選出抑制效果最好的shrna-1序列為特異性shrna。

如圖9所示，cck-8方法檢測(cè)干擾ang-2基因?qū)Ψ伟┘?xì)胞增殖能力的影響，轉(zhuǎn)染0h和24h，shrna實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組之間細(xì)胞增殖無明顯差異（p>0.05），轉(zhuǎn)染48h和72h后，shrna實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞增殖速度明顯低于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，抑制效果越明顯。

ang-2在腫瘤中通過促進(jìn)血管形成而促進(jìn)癌細(xì)胞的侵襲和轉(zhuǎn)移。對(duì)ang-2干擾前后細(xì)胞侵襲、遷移能力改變的檢測(cè)；收集轉(zhuǎn)染shrna干擾ang-2的shrna實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞、陰性對(duì)照組細(xì)胞及空白對(duì)照組接種于transwell小室，24小時(shí)后固定染色空氣干燥；如圖10所示，左邊附圖為shrna實(shí)驗(yàn)組的a549細(xì)胞侵襲結(jié)晶紫染色圖，中間附圖為陰性對(duì)照組的a549細(xì)胞侵襲結(jié)晶紫染色圖，右邊附圖為空白對(duì)照組的a549細(xì)胞侵襲結(jié)晶紫染色圖；如表1所示為shrna實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組中肺癌細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，shrna實(shí)驗(yàn)組與陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組相比細(xì)胞侵襲、遷移數(shù)據(jù)明顯減少，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，如圖11陰性對(duì)照組未見明顯統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。侵襲組數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)顯示，如圖12所示，shrna實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞量明顯少于陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，而陰性對(duì)照組和空白對(duì)照組間差異未見統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，由上表明shrna靶向ang-2基因能夠有效抑制肺癌細(xì)胞侵襲、遷移能力。

表1為肺癌細(xì)胞侵襲、遷移結(jié)晶紫染色細(xì)胞計(jì)數(shù)

shrna實(shí)驗(yàn)組、陰性對(duì)照組與空白對(duì)照組三組進(jìn)行比較*p<0.05.

間充質(zhì)細(xì)胞參與組織修復(fù)，尤其是腫瘤侵襲和遷移，emt是間充質(zhì)細(xì)胞的一個(gè)重要來源。對(duì)ang-2干擾后，emt各蛋白表達(dá)如圖13和圖14所示，shrna實(shí)驗(yàn)組中細(xì)胞的e-cadherin蛋白量表達(dá)增加，snail、vim和twist蛋白表達(dá)降低，emt蛋白e-cadherin表達(dá)升高，snail，vim與twist表達(dá)降低，使其上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化能力下降。

e-cadherin,snail,twist和vimentin是調(diào)節(jié)emt的關(guān)鍵蛋白，e-cadherin是一個(gè)重要的經(jīng)典鈣黏蛋白，調(diào)節(jié)正常成熟上皮細(xì)胞損傷，e-cadherin表達(dá)缺失促進(jìn)腫瘤侵襲和轉(zhuǎn)移，可作為emt標(biāo)志。然而，vimentin是中間絲的一個(gè)組成部分，高表達(dá)時(shí)可使emt相關(guān)基因高表達(dá)，是emt正向表達(dá)的標(biāo)志。snail,twist也是emt調(diào)節(jié)的重要標(biāo)志，其異常表達(dá)影響emt過程，增加腫瘤細(xì)胞的侵襲和遷移。通過轉(zhuǎn)染ang-2高表達(dá)細(xì)胞株篩選抑制效果最好的shrna序列，觀察干擾ang-2以后對(duì)肺癌細(xì)胞生物學(xué)行為影響，細(xì)胞增殖、侵襲、遷移能力明顯抑制。

上述實(shí)施例只是本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不是對(duì)本發(fā)明技術(shù)方案的限制，只要是不經(jīng)過創(chuàng)造性勞動(dòng)即可在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)上實(shí)現(xiàn)的技術(shù)方案，均應(yīng)視為落入本發(fā)明專利的權(quán)利保護(hù)范圍內(nèi)。