本發(fā)明涉及生物制劑的技術領域，尤其涉及一種從海洋球石藻中提取鄰苯二甲酸二丁酯的方法。

背景技術：

海洋球石藻(coccolithophores)是一類單細胞海洋微型浮游植物，隸屬于定鞭藻門(haptophyta＝prymnesiophyta)定鞭藻綱(prymnesiophyceae)。海洋球石藻代謝產(chǎn)物中富含多種生物活性物質，如二十二碳六烯酸(dha)、聚酮類化合物等，尤其是海洋微藻細胞中總脂含量最高可達細胞干重的50％，這些化合物具有良好的抑菌、抗氧化、抗腫瘤等生物功能，在生物技術領域具有廣闊的應用前景。但目前有關海洋球石藻脂類活性物質領域的研究較少。

有鑒于此，本發(fā)明人研究和設計了一種從海洋球石藻中提取鄰苯二甲酸二丁酯的方法，本案由此產(chǎn)生。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于提供一種從海洋球石藻中提取鄰苯二甲酸二丁酯的方法，旨在通過薄層層析法、硅膠柱層析法、凝膠柱層析法、制備型薄層ptlc等方法對海洋球石藻乙酸乙酯相提取物的鄰苯二甲酸二丁酯進行分離、純化，以便于后續(xù)大規(guī)?；a(chǎn)鄰苯二甲酸二丁酯。

為了解決上述目的，本發(fā)明采用的技術方案如下：

一種從海洋球石藻中提取鄰苯二甲酸二丁酯的方法,依次以：用乙酸乙酯進行萃?。挥梅聪喙枘z柱進行層析；用葡聚糖凝膠柱sephadexlh-20進行層析；用反相硅膠柱進行層析；用正相硅膠柱進行層析；用ptlc制備的方法從海洋球石藻中提取鄰苯二甲酸二丁酯。

作為實施例的優(yōu)選方式，上述提取鄰苯二甲酸二丁酯的方法具體包括以下步驟：

步驟一、制備海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物：先用乙醇溶液浸提，獲得乙醇浸膏，再以乙酸乙酯為萃取劑進行萃取處理，合并萃取液，減壓濃縮得到海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物；

作為實施例的優(yōu)選方式，海洋球石藻生長至穩(wěn)定期，收獲，冷凍干燥獲得海洋球石藻藻粉g，用質量分數(shù)為75％的乙醇溶液浸提，獲得乙醇浸膏，加入等體積的乙酸乙酯和水，反復萃取，收集乙酸乙酯相，合并、減壓濃縮至干，獲得海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物；

步驟二、反相硅膠柱層析制備鄰苯二甲酸二丁酯一次粗品：將獲得的海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物以反相硅膠柱進行層析處理，收集，檢測、合并、減壓濃縮至干，得到鄰苯二甲酸二丁酯一次粗品；

作為實施例的優(yōu)選方式，將海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物用適量的分析純甲醇溶解，加入量以甲醇正好沒過萃取物為宜，進行反相硅膠柱層析；依次用水，質量分數(shù)為25％的甲醇溶液，質量分數(shù)為50％的甲醇溶液，質量分數(shù)為75％的甲醇溶液，甲醇洗脫，每個梯度洗脫1.5l，流速控制為30ml/min，每200ml收集1管，旋蒸，初步用tlc分析流出物，合并鄰苯二甲酸二丁酯高濃度流分段，減壓濃縮至干，獲得鄰苯二甲酸二丁酯一次粗品；

步驟三、葡聚糖凝膠柱sephadexlh-20層析制備鄰苯二甲酸二丁酯二次粗品：將鄰苯二甲酸二丁酯一次粗品以葡聚糖凝膠柱sephadexlh-20進行層析處理，收集，檢測、合并、減壓濃縮至干，得到鄰苯二甲酸二丁酯二次粗品；

將鄰苯二甲酸二丁酯一次粗品用適量甲醇溶解后，上葡聚糖凝膠柱sephadexlh-20，用甲醇作為洗脫劑進行洗脫，流速控制12-13s/drop，使用自動收集器收集各餾分，每30min收集一管，初步用tlc分析流出物，合并80至90管的餾分，減壓濃縮至干，獲得鄰苯二甲酸二丁酯二次粗品；

步驟四、反相硅膠柱層析制備鄰苯二甲酸二丁酯一次精品：將獲得的鄰苯二甲酸二丁酯二次粗品以反相硅膠柱進行層析處理，收集，檢測、合并、減壓濃縮至干，得到鄰苯二甲酸二丁酯一次精品；

將鄰苯二甲酸二丁酯二次粗品，依次采用質量分數(shù)為30％，40％，50％，60％，70％的甲醇水溶液梯度洗脫，最后用甲醇洗脫進行反相硅膠柱層析，每個梯度洗脫300ml，流速控制為5ml/min，旋蒸，初步用tlc分析流出物，合并鄰苯二甲酸二丁酯高濃度流分段，減壓濃縮至干，獲得鄰苯二甲酸二丁酯一次精品；

步驟五、正相硅膠柱層析制備鄰苯二甲酸二丁酯二次精品：將獲得的鄰苯二甲酸二丁酯一次精品以正相硅膠柱進行層析處理，收集，檢測、合并、減壓濃縮至干，得到鄰苯二甲酸二丁酯二次精品；

將鄰苯二甲酸二丁酯一次精品經(jīng)過正相硅膠柱層析：用硅膠粉拌樣，硅膠用石油醚飽和后裝柱，樣品上柱后用石油醚丙酮體系進行洗脫，石油醚和丙酮的體積比為200：1，收集餾分，減壓濃縮至干，獲得鄰苯二甲酸二丁酯二次精品；

步驟六、ptlc制備鄰苯二甲酸二丁酯純品：將獲得的鄰苯二甲酸二丁酯二次精品進行ptlc，點樣、展開，刮板，樣品回收，保存于-20℃，得到鄰苯二甲酸二丁酯純品；

將鄰苯二甲酸二丁酯二次精品經(jīng)過ptlc，最終得到鄰苯二甲酸二丁酯；采用高效薄層層析板，在體積比為石油醚：乙酸乙酯＝80：1的展開劑中展開，前后兩端顯色，用刀片刮取中間部分，合并，用甲醇溶解，高速離心，收集上清液，減壓濃縮至干，最終得到鄰苯二甲酸二丁酯。

一種鄰苯二甲酸二丁酯在制備抗大腸桿菌、枯草芽孢桿菌及金黃色葡萄球菌藥劑中的應用。

由于本發(fā)明系統(tǒng)采用了上述的技術方案，使得本實用性具有以下有益效果：本發(fā)明首次采用薄層層析法、硅膠柱層析法、凝膠柱層析法、制備型薄層等方法對海洋球石藻乙酸乙酯相提取物的鄰苯二甲酸二丁酯進行了分離、純化，并對鄰苯二甲酸二丁酯的抗菌活性進行了研究，以便為后續(xù)大規(guī)模生產(chǎn)鄰苯二甲酸二丁酯奠定基礎。

附圖說明

圖1為本發(fā)明鄰苯二甲酸二丁酯tlc的圖。

具體實施方式

實施例1一種從海洋球石藻中提取鄰苯二甲酸二丁酯的方法

本發(fā)明揭示了一種從海洋球石藻中提取鄰苯二甲酸二丁酯的方法,依次以：用乙酸乙酯進行萃??；用反相硅膠柱進行層析；用葡聚糖凝膠柱sephadexlh-20進行層析；用反相硅膠柱進行層析；用正相硅膠柱進行層析；用ptlc制備的方法從海洋球石藻中提取鄰苯二甲酸二丁酯。

作為實施例的優(yōu)選方式，上述提取鄰苯二甲酸二丁酯的方法具體包括以下步驟：

步驟一、制備海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物：先用乙醇溶液浸提，獲得乙醇浸膏，再以乙酸乙酯為萃取劑進行萃取處理，合并萃取液，減壓濃縮得到海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物；

海洋球石藻生長至穩(wěn)定期，收獲，冷凍干燥獲得海洋球石藻藻粉19.3740g，用質量分數(shù)為75％的乙醇浸提，獲得乙醇浸膏5.1247g，加入等體積的乙酸乙酯和水，反復萃取，收集乙酸乙酯相，合并、減壓濃縮至干，獲得海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物4.2357g；

步驟二、反相硅膠柱層析制備鄰苯二甲酸二丁酯一次粗品：將獲得的海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物以反相硅膠柱進行層析處理，收集，檢測、合并、減壓濃縮至干，得到鄰苯二甲酸二丁酯一次粗品；

將4.2357g海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物用適量的分析純甲醇溶解后，進行反相硅膠(180g)柱層析；依次用水，質量分數(shù)為25％的甲醇溶液，質量分數(shù)為50％的甲醇溶液，質量分數(shù)為75％的甲醇溶液，甲醇洗脫，每個梯度洗脫1.5l，流速控制為30ml/min，每200ml收集1管，旋蒸，初步用tlc分析流出物，合并棕櫚酸高濃度流分段，減壓濃縮至干，獲得鄰苯二甲酸二丁酯一次粗品；

步驟三、葡聚糖凝膠柱sephadexlh-20層析制備鄰苯二甲酸二丁酯二次粗品：將鄰苯二甲酸二丁酯一次粗品以葡聚糖凝膠柱sephadexlh-20進行層析處理，收集，檢測、合并、減壓濃縮至干，得到鄰苯二甲酸二丁酯二次粗品；

將海洋球石藻乙酸乙酯相萃取物一次粗品用適量甲醇溶解后，上葡聚糖凝膠柱sephadexlh-20，用甲醇作為洗脫劑進行洗脫，流速控制12-13s/drop，使用自動收集器收集各餾分，每30min收集一管，初步用tlc分析流出物，合并80至90管的餾分，減壓濃縮至干，獲得鄰苯二甲酸二丁酯二次粗品；

步驟四、反相硅膠柱層析制備鄰苯二甲酸二丁酯一次精品：將獲得的鄰苯二甲酸二丁酯二次粗品以反相硅膠柱進行層析處理，收集，檢測、合并、減壓濃縮至干，得到鄰苯二甲酸二丁酯一次精品；

將鄰苯二甲酸二丁酯二次粗品，依次采用質量分數(shù)為30％，40％，50％，60％，70％的甲醇水梯度洗脫，最后用甲醇洗脫進行反相硅膠柱層析，每個梯度洗脫300ml，流速控制為5ml/min，旋蒸，初步用tlc分析流出物，合并鄰苯二甲酸二丁酯高濃度流分段，減壓濃縮至干，獲得鄰苯二甲酸二丁酯一次精品；

步驟五、正相硅膠柱層析制備鄰苯二甲酸二丁酯二次精品：將獲得的鄰苯二甲酸二丁酯一次精品以正相硅膠柱進行層析處理，收集，檢測、合并、減壓濃縮至干，得到鄰苯二甲酸二丁酯二次精品；

將鄰苯二甲酸二丁酯一次精品經(jīng)過正相硅膠柱層析，用硅膠粉拌樣，硅膠用石油醚飽和后裝柱，樣品上柱后用石油醚和丙酮體系進行洗脫，石油醚和丙酮的體積比為200：1，收集餾分，減壓濃縮至干，獲得鄰苯二甲酸二丁酯二次精品；

步驟六、ptlc制備鄰苯二甲酸二丁酯純品：將獲得的鄰苯二甲酸二丁酯二次精品進行ptlc，點樣、展開，刮板，樣品回收，保存于-20℃，得到鄰苯二甲酸二丁酯純品；

將鄰苯二甲酸二丁酯二次精品經(jīng)過ptlc，最終得到鄰苯二甲酸二丁酯：采用高效薄層層析板，在體積比為：石油醚：乙酸乙酯＝80：1的展開劑中展開，前后兩端顯色，用刀片刮取中間部分，合并，用甲醇溶解，高速離心，收集上清液，減壓濃縮至干，最終得到鄰苯二甲酸二丁酯。

實施例2鄰苯二甲酸二丁酯的抑菌活性

最小抑菌濃度mic的測定：

試管二倍稀釋法：采用倍比稀釋的方法獲得不同濃度的藥液，接種供試菌，設置陽性對照及陰性對照，在合適的溫度下孵育，從而確定mic值。

表1鄰苯二甲酸二丁酯的抑菌活性

注:1)，)-無抑菌圈，+7.1～9.0mm，++9.1～11.0mm。

對鄰苯二甲酸二丁酯進行抗菌試驗結果表明，鄰苯二甲酸二丁酯對大腸桿菌、枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌都有抑制作用，其中對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌有更強的抑制作用。

表2鄰苯二甲酸二丁酯不同稀釋度mic的測定

注：-無菌落生長，+有菌落生長

mic測定實驗結果表明，鄰苯二甲酸二丁酯具有抵抗枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的效果，其mic值分別為5mg/ml，10mg/ml。

實施例3細胞毒活性實驗

a.細胞凍存：

配制10％dmso小牛血清凍存液；取對數(shù)期生長的lo2、hepg2細胞，用胰蛋白酶消化單層生長細胞；1000rpm離心5min；移除上清，加入新的凍存液；分裝于凍存管中，標好名稱、時間；將裝有細胞的凍存管放入-20℃冰箱2h，然后放入-70℃冰箱中過夜，迅速取出凍存管，移入液氮中凍存。

b.細胞復蘇：

從液氮中取出細胞凍存管，37℃水浴中迅速解凍，控制這個過程在1分鐘之內；吸出細胞懸浮液至離心管中并加入10倍培養(yǎng)基，輕輕混勻；1000rpm離心5min；倒掉上清液，重復洗一次，血球計數(shù)板計數(shù)，靜置co2培養(yǎng)箱37℃培養(yǎng)；次日更換培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)。

c.mtt法檢測細胞活力：

本實驗所選的腫瘤細胞為肝癌細胞系hepg2和正常肝細胞lo2。用胰酶消化對數(shù)生長期的腫瘤細胞，加入新鮮培養(yǎng)液后用血球計數(shù)板計數(shù)，調整好細胞濃度后接種于96孔板，置于37℃co2培養(yǎng)箱內培養(yǎng)24h。將6種單體化合物配制成濃度為10mg/ml的藥液，每個濃度三個平行實驗，以順鉑為陽性對照。每孔中加入20μlmtt溶液，37℃培養(yǎng)4h。去除上清，每孔加入dmso150μl。37℃搖床培養(yǎng)2小時，在酶標儀490nm處測定光密度(od490)值，計算抑制率。

抑制率％＝(1-實驗組平均od值/對照組平均od值)×100％

表3鄰苯二甲酸二丁酯對lo2(正常)和hepg2(肝癌)細胞的抑制率

細胞毒活性實驗表明，鄰苯二甲酸二丁酯對hepg2肝癌細胞有一定的抑制作用，但效果不明顯，同時其對正常細胞lo2也有一定的損害作用。

鄰苯二甲酸二正丁酯又稱dbp為有芳香味的無色透明油狀液體，廣泛存在于香煙、煙氣中，主要在食品及工業(yè)中用做塑化劑，也可用作體外殺蟲劑。本研究結果表明鄰苯二甲酸二丁酯dbp對枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌的mic值分別為5mg/ml、10mg/ml，這一結果為將來利用鄰苯二甲酸二丁酯控制枯草芽孢桿菌、金黃色葡萄球菌這一重要的海水養(yǎng)殖病害問題提供了一個新線索。另外鄰苯二甲酸二丁酯也有一定的細胞毒活性，對本試驗中的肝癌細胞hepg2有抵抗效果。

以上所述，僅為本發(fā)明較佳實施例而已，故不能依此限定本發(fā)明實施的范圍，即依本發(fā)明專利范圍及說明書內容所作的等效變化與修飾，皆應仍屬本發(fā)明涵蓋的范圍內。