本發(fā)明涉及基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種在作物種子胚乳合成花青素的轉(zhuǎn)基因育種方法。

背景技術(shù)：

花青素(anthocyanins)屬于酚類化合物中的類黃酮(flavonoid)植物營養(yǎng)素，是一種水溶性色素，廣泛存在于植物的花、葉和果實(shí)中，賦予了植物鮮艷的色彩?；ㄇ嗨鼐哂袕?qiáng)的抗氧化活性，對心血管疾病、糖尿病和一些慢性疾病具有較好預(yù)防作用，對人們的健康具有重要的促進(jìn)作用。同時(shí)，花青素也是一種天然的色素，在食品、保健品、醫(yī)藥用品、化妝品、食品添加劑等領(lǐng)域具有廣闊的應(yīng)用價(jià)值。食物來源中，花青素主要在有色水果和有色蔬菜中，如葡萄、紫椰菜等，而在糧食作物中含量較少。天然的有色類糧食谷物，其花青素等色素是存在于谷物的種皮中。當(dāng)有色谷物進(jìn)行精加工去除種皮時(shí)，作為主要食用部分的胚乳是白色的且不含花青素。

黑米在東南亞各國是一種傳統(tǒng)的重要營養(yǎng)保健食品，其主要營養(yǎng)物質(zhì)是種皮中的花青素。傳統(tǒng)食用的黑米都是糙米，其口感和蒸煮特性都較差，而去掉種皮變成精米后，又失去了種皮含有的花青素等營養(yǎng)成分。因此，如能在胚乳中產(chǎn)生花青素，則可以解決上述問題，增加稻米(精米)營養(yǎng)價(jià)值，這也是功能型水稻基因工程育種的主要目標(biāo)之一。

花青素的生物合成與調(diào)控涉及到多個(gè)基因，包括結(jié)構(gòu)基因(編碼各類酶，催化形成花青素的基礎(chǔ)結(jié)構(gòu))、修飾基因(編碼糖基轉(zhuǎn)移酶等，對花青素結(jié)構(gòu)進(jìn)行穩(wěn)定加工)、轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(負(fù)責(zé)把花青素運(yùn)到液泡儲存)以及調(diào)控它們的器官特異和時(shí)空特異表達(dá)的調(diào)節(jié)基因。其中的調(diào)節(jié)基因主要是3個(gè)轉(zhuǎn)錄因子基因，它們的時(shí)空特異表達(dá)的myb、bhlh和wd40蛋白因子形成三因子復(fù)合體(簡稱mbw)，可以激活上述的結(jié)構(gòu)基因、修飾蛋白基因、和轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白基因，以完成花青素的合成、修飾、和運(yùn)轉(zhuǎn)。本發(fā)明的研究發(fā)現(xiàn)，在白米水稻品種中，由于涉及花青素的生物合成的結(jié)構(gòu)基因和調(diào)節(jié)基因大多是突變失去功能的或在胚乳不表達(dá)(或很低水平表達(dá))的(見圖1)，因此傳統(tǒng)雜交育種方法不能實(shí)現(xiàn)花青素在胚乳的合成。而普通基因工程方法導(dǎo)入少數(shù)相關(guān)基因，如只導(dǎo)入在水稻胚乳表達(dá)的花青素調(diào)節(jié)基因，或只導(dǎo)入在水稻胚乳表達(dá)的幾個(gè)花青素結(jié)構(gòu)基因被證明是無效的，不能夠構(gòu)建花青素合成、修飾、和運(yùn)轉(zhuǎn)的完整途徑，只能合成部分黃酮類中間產(chǎn)物，不能產(chǎn)生花青素(shinetal.,2006；ogoetal.,2013)。因此，采用多基因代謝工程的方法，導(dǎo)入在水稻胚乳特異表達(dá)的花青素合成途徑完整的調(diào)節(jié)基因和結(jié)構(gòu)基因，通過外源轉(zhuǎn)基因表達(dá)以及激活內(nèi)源基因的表達(dá)，共同作用才有可能在胚乳中實(shí)現(xiàn)花青素的合成。這相比較于已報(bào)道的在胚乳產(chǎn)生β-類胡蘿卜素的“黃金大米”、在胚乳合成蝦青素的“蝦青素大米”(專利公開號：cn105907780a)、以及以胚乳作為生物反應(yīng)器生產(chǎn)具有生物活性的“人血清蛋白米”，在胚乳中合成花青素需要更多的不同功能的基因及其組合，難度更大，因此目前還沒有在水稻胚乳中生產(chǎn)花青素的報(bào)告。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種在作物種子胚乳合成花青素的轉(zhuǎn)基因育種方法。

本發(fā)明的目的通過下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種在作物種子胚乳合成花青素的轉(zhuǎn)基因育種方法，包括如下步驟：在作物中轉(zhuǎn)入包含6個(gè)表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白的基因和2個(gè)表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的基因構(gòu)成的基因組合，獲得種子胚乳為紫色的、合成花青素的轉(zhuǎn)基因作物；

其中，所述的結(jié)構(gòu)蛋白的基因?yàn)椴闋柾铣擅富?chs)、查爾酮異構(gòu)酶基因(chi)、黃烷酮-3-羥化酶基因(f3h)、類烷酮-3-羥化酶基因(f3’h)、二羥黃酮醇4-還原酶基因(dfr)和花青素合成酶基因(ans)；

所述的轉(zhuǎn)錄因子的基因?yàn)榉謩e編碼myb蛋白的pl基因和編碼bhlh蛋白的lc基因。

所述作物為水稻、玉米、小麥、高粱、大麥等；優(yōu)選為水稻；更優(yōu)選為水稻品種中花11號。

所述的表達(dá)結(jié)構(gòu)蛋白的基因包括作物胚乳表達(dá)啟動(dòng)子、編碼結(jié)構(gòu)蛋白的基因和終止子。

所述的表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子的基因包括作物胚乳表達(dá)啟動(dòng)子、編碼轉(zhuǎn)錄因子的基因和終止子。

所述的作物胚乳表達(dá)啟動(dòng)子優(yōu)選為胚乳儲存蛋白基因的啟動(dòng)子；更優(yōu)選為水稻胚乳儲存蛋白基因啟動(dòng)子ensp1～ensp8，其中，ensp1～ensp8的序列分別如genbankno.eu264107、genbankno.ay427569、genbankno.ay427571、genbankno.ay427575、genbankno.eu264106、genbankno.d63901、genbankno.ay427572和genbankno.ay427574所示。

表達(dá)所述的查爾酮合成酶的基因優(yōu)選包含水稻胚乳儲存蛋白基因啟動(dòng)子ensp8、如seqidno.1所示的編碼查爾酮合成酶的基因和tmas終止子。tmas終止子是甘露堿合成酶終止子，序列如genbankno.dq005465所示。

表達(dá)所述的查爾酮異構(gòu)酶的基因優(yōu)選包含水稻胚乳儲存蛋白基因啟動(dòng)子ensp4、如seqidno.2所示的編碼查爾酮異構(gòu)酶的基因和tocs終止子。tocs終止子是章魚堿合成酶終止子，序列如genbankno.dq005461所示。

表達(dá)所述的黃烷酮-3-羥化酶的基因優(yōu)選包含水稻胚乳儲存蛋白基因啟動(dòng)子ensp3、如seqidno.3所示的編碼黃烷酮-3-羥化酶的基因和t35s終止子。t35s終止子是camv35s終止子，序列如genbankno.af234296.1所示。

表達(dá)所述的類烷酮-3-羥化酶的基因優(yōu)選包含水稻胚乳儲存蛋白基因啟動(dòng)子ensp7、如seqidno.4所示的編碼類烷酮-3-羥化酶的基因和trbc終止子。trbc終止子是核糖體小亞基終止子，序列如genbankno.dq005473所示。

表達(dá)所述的二羥黃酮醇4-還原酶的基因優(yōu)選包含水稻胚乳儲存蛋白基因啟動(dòng)子ensp5、如seqidno.5所示的編碼二羥黃酮醇4-還原酶的基因和tags終止子。tags終止子是農(nóng)桿堿合成酶終止子，序列如genbankno.dq005453所示。

表達(dá)所述的花青素合成酶的基因優(yōu)選包含水稻胚乳儲存蛋白基因啟動(dòng)子ensp6、如seqidno.6所示的編碼花青素合成酶的基因和tnos終止子。tnos終止子是胭脂堿合成酶終止子，序列如genbankno.dq005463所示。

表達(dá)所述的myb蛋白的基因優(yōu)選包含水稻胚乳儲存蛋白基因啟動(dòng)子ensp1、編碼玉米轉(zhuǎn)錄因子zmpl的基因和tmas終止子。所述的編碼玉米轉(zhuǎn)錄因子zmpl的基因如genbankno.nm_001112415所示。

表達(dá)所述的bhlh蛋白的基因優(yōu)選包含水稻胚乳儲存蛋白基因啟動(dòng)子ensp2、編碼玉米轉(zhuǎn)錄因子zmlc的基因和tmas終止子。所述的編碼玉米轉(zhuǎn)錄因子zmlc的基因如genbankno.nm_001111869所示。

所述的在作物種子胚乳合成花青素的轉(zhuǎn)基因育種方法，優(yōu)選包括如下步驟：

(1)克隆在胚乳完成花青素合成途徑必需的全部6個(gè)結(jié)構(gòu)基因(chs、chi、f3h、f3’h、dfr和ans)和2個(gè)調(diào)節(jié)基因(pl和lc)，并將這8個(gè)基因分別與作物胚乳表達(dá)啟動(dòng)子融合，分別構(gòu)建基因表達(dá)盒；

(2)將步驟(1)得到的8個(gè)基因表達(dá)盒構(gòu)建到一個(gè)植物轉(zhuǎn)化載體上，獲得含chs、chi、f3h、f3’h、dfr、ans、pl和lc的多基因轉(zhuǎn)化載體；

(3)將得到的多基因轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化育種作物，獲得種子胚乳為紫色的、合成花青素的、優(yōu)選為無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因作物。

所述的在作物種子胚乳合成花青素的轉(zhuǎn)基因育種方法，還包括如下步驟：為了獲得可以剔除篩選標(biāo)記基因的轉(zhuǎn)化植物，將標(biāo)記基因/標(biāo)記刪除基因的無篩選標(biāo)記(marker-free)結(jié)構(gòu)構(gòu)建到步驟(2)得到的多基因轉(zhuǎn)化載體，獲得含所述10個(gè)基因的、能在轉(zhuǎn)基因植株中自動(dòng)刪除篩選標(biāo)記的多基因轉(zhuǎn)化載體。

所述的標(biāo)記基因包括潮霉素hpt標(biāo)記基因等。

所述的標(biāo)記刪除基因包括cre標(biāo)記刪除基因等。

所述的將得到的多基因轉(zhuǎn)化載體轉(zhuǎn)化育種作物可通過常規(guī)的作物轉(zhuǎn)化方法得到，如使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化方法，轉(zhuǎn)化育種作物的愈傷組織，篩選，得到轉(zhuǎn)基因作物。

一種胚乳為紫色的作物種子，通過上述轉(zhuǎn)基因育種方法得到。

本發(fā)明相對于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

雖然植物花青素合成代謝涉及的基因網(wǎng)絡(luò)大體上已經(jīng)被闡明，但在本發(fā)明之前，在白米水稻中導(dǎo)入那些基因是在胚乳中構(gòu)建花青素合成途徑所必需是不清楚的。本發(fā)明通過研究，發(fā)現(xiàn)2個(gè)調(diào)節(jié)基因和6個(gè)結(jié)構(gòu)基因是在胚乳中高水平合成花青素所必需的。本發(fā)明進(jìn)而利用多基因遺傳工程方法，首次在作物水稻的胚乳中實(shí)現(xiàn)了花青素的合成，并獲得了無篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因“紫米”產(chǎn)品，可以直接用于食用，也可以作為原材料用于生產(chǎn)花青素的原料。本發(fā)明對于新的功能性作物育種具有重要的指導(dǎo)意義和生產(chǎn)應(yīng)用價(jià)值。另外，本發(fā)明可以實(shí)現(xiàn)在作物種子胚乳合成積累有用的活性物質(zhì)或營養(yǎng)物質(zhì)(如花青素)，因此本發(fā)明對重要的、復(fù)雜生物合成途徑和重要農(nóng)藝性狀的多基因遺傳工程操作提供了技術(shù)方法，具有重要的應(yīng)用價(jià)值。

附圖說明

圖1是轉(zhuǎn)基因作物種子胚乳中重建的花青素合成途徑圖；其中，圖a是發(fā)明人先前的未發(fā)表研究成果圖，在白米水稻品種中，編碼bhlh和myb轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)基因是功能缺失突變基因或在胚乳不表達(dá)，而內(nèi)源oswd40基因是功能型，因此需要轉(zhuǎn)化導(dǎo)入外源相應(yīng)基因zmpl和zmlc才能表達(dá)出轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體mbw；在內(nèi)源結(jié)構(gòu)基因中，編碼dfr的基因?yàn)楣δ苋笔蛔?，其它的在胚乳不表達(dá)或低水平表達(dá)；圖b指示由導(dǎo)入的外源基因和被重建的mbw復(fù)合體激活的內(nèi)源基因構(gòu)成的花青素合成、修飾、和運(yùn)轉(zhuǎn)途徑，黑色粗大箭頭代表導(dǎo)入外源轉(zhuǎn)基因表達(dá)后的酶催化反應(yīng)，灰色粗大箭頭代表由重建的轉(zhuǎn)錄因子復(fù)合體激活表達(dá)內(nèi)源基因的酶催化反應(yīng)，黑色細(xì)線小箭頭代表內(nèi)源功能基因在胚乳中低水平表達(dá)的酶催化反應(yīng)，帶×的虛線箭頭代表內(nèi)源功能基因在胚乳中不表達(dá)或內(nèi)源基因功能缺失突變而不存在的酶催化反應(yīng)，下劃線指示的是5個(gè)絕對必要的外源基因及其表達(dá)的蛋白，其余的3個(gè)外源結(jié)構(gòu)基因具有增強(qiáng)相應(yīng)的酶催化反應(yīng)的作用。

圖2是多基因組裝過程中(經(jīng)7輪組裝)產(chǎn)生的含有不同數(shù)目的目的基因的載體質(zhì)粒的酶切檢測結(jié)果圖和多基因載體pyltac380mf-10g的結(jié)構(gòu)示意圖；其中，圖a為noti酶切檢測結(jié)果圖，圖b為含8個(gè)花青素合成基因(sschs、sschi、ssf3h、ssf3’h、ssdfr、ssans、zmpl和zmlc)和2個(gè)基因(hpt標(biāo)記基因/cre標(biāo)記刪除基因)的marker-free結(jié)構(gòu)的pyltac380mf-10g的結(jié)構(gòu)示意圖；1個(gè)基因，1g；2個(gè)基因，2g；如此類推。

圖3是對導(dǎo)入pyltac380mf-10g的水稻轉(zhuǎn)化體基因組dna的8個(gè)外源基因片段的pcr檢測結(jié)果圖；ck+為多基因載體pyltac380mf-10g質(zhì)粒；wt為野生型對照基因組dna。

圖4是以rt-pcr對pyltac380mf-10g水稻轉(zhuǎn)化體的授粉后20天發(fā)育種子的8個(gè)外源基因的表達(dá)檢測結(jié)果圖。

圖5是轉(zhuǎn)pyltac380mf-10g水稻轉(zhuǎn)化體的標(biāo)記刪除檢測的原理示意圖(a)與t1、t2代轉(zhuǎn)化體標(biāo)記刪除的pcr檢測結(jié)果圖(b)及標(biāo)記刪除的測序鑒定結(jié)果圖(c)。

圖6是合成花青素的pyltac380mf-10g轉(zhuǎn)化水稻后的表型圖；其中，圖a為糙米和精米的表型圖，圖b為糙米橫切面的表型圖；野生型為受體品種中花11。

圖7是hplc檢測pyltac380mf-10g轉(zhuǎn)化水稻種子的花青素鑒定結(jié)果圖；其中，圖a為不同花青素的標(biāo)準(zhǔn)樣品的色譜圖，圖b為pyltac380mf-10g轉(zhuǎn)化水稻株系#3種子的色譜圖，圖c為野生型(中花11)胚乳的色譜圖，圖d為定量分析結(jié)果圖。

圖8是半定量rt-pcr檢測轉(zhuǎn)化水稻和野生型種子(授粉后7天和14天)的內(nèi)源基因和外源基因的表達(dá)結(jié)果圖；其中，黑色粗體是外源表達(dá)的基因；灰色粗體是內(nèi)源激活表達(dá)的基因；虛線方框表示完全無表達(dá)的內(nèi)源基因，小寫字母是功能缺失突變基因。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無特殊說明，均為常規(guī)分子生物學(xué)方法；所使用的材料、試劑等，如無特殊說明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

表1實(shí)施例中各個(gè)名稱引物對應(yīng)的核苷酸序列

實(shí)施例1

本發(fā)明通過研究發(fā)現(xiàn)，要想在作物胚乳中合成花青素，必需要同時(shí)導(dǎo)入6個(gè)結(jié)構(gòu)基因(chs、chi、f3h、f3’h、dfr和ans)和2個(gè)調(diào)節(jié)基因(pl和lc)的組合來一起實(shí)現(xiàn)(圖1)。根據(jù)以上研究基礎(chǔ)，本實(shí)施例建立了一種在水稻胚乳中生產(chǎn)花青素的轉(zhuǎn)基因育種方法，具體包括以下步驟：

s1.8個(gè)必需基因表達(dá)盒的構(gòu)建：

s1.1.8個(gè)必需基因(sschs、sschi、ssf3h、ssf3’h、ssdfr、ssans、zmpl和zmlc)編碼區(qū)的克?。焊鶕?jù)chs、chi、f3h、f3’h、dfr、ans這6個(gè)基因dna序列高度保守特性，直接用rt-pcr方法，分別通過引物對p1/p2、p3/p4、p5/p6、p7/p8、p9/p10、p11/p12從彩葉草(solenostemonscutellarioides(l.)codd)葉片的cdna中擴(kuò)增得到sschs編碼區(qū)、sschi編碼區(qū)、ssf3h編碼區(qū)、ssf3’h編碼區(qū)、ssdfr編碼區(qū)、ssans編碼區(qū)，將獲得的6個(gè)基因編碼區(qū)分別克隆到質(zhì)粒載體puc18上，測序獲得如seqidno.1～6所示的dna序列(依次對應(yīng)前述6個(gè)基因編碼區(qū))；根據(jù)玉米zmpl基因cdna序列(genbankno.nm_001112415)和玉米zmlc基因cdna序列(genbankno.nm_001111869)，直接用rt-pcr方法，分別通過引物對p13/p14、p15/p16從紫色玉米葉片cdna中擴(kuò)增zmpl編碼區(qū)和zmlc編碼區(qū)，克隆到質(zhì)粒載體puc18，測序確定，序列分別如genbankno.nm_001112415和genbankno.nm_001111869所示。

s1.2.花青素合成必需的8個(gè)基因表達(dá)盒在多基因供給載體上的構(gòu)建：

zmpl基因表達(dá)盒pyl322d1-zmpl構(gòu)建：用引物pd1-1/pd1-2反向擴(kuò)增多基因供給載體i(即pylvs，見linetal.,2003,efficientlinkingandtransferofmultiplegenesbyamultigeneassemblyandtransformationvectorsystem.procnatlacadsci.,100:5962-5967；zl02134869.3，多基因載體的構(gòu)建方法與應(yīng)用。下同)，獲得載體骨架片段a；以抽提的水稻日本晴的基因組dna為模板(下同)，用引物fensp1/rensp1擴(kuò)增約2.3kb的水稻胚乳特異啟動(dòng)子(genbankno.eu264107)，命名為ensp1(endospermspecificpromoter)，作為片段b；用引物f-pl/r-pl擴(kuò)增zmpl基因，作為片段c；參考質(zhì)粒psat3(genbankno.dq005465)的甘露堿合成酶終止子(manopinesynthaseterminator)序列(簡稱tmas終止子)，直接合成片段d(其中5’端具有與片段c的3’端重疊的序列cacggccgagcagcttgtgtag，3’端具有與載體骨架片段a的5’端重疊的序列g(shù)tcgacatgtacaagcttagc)。每個(gè)片段兩側(cè)，分別帶有20～25bp的重疊序列(引物表里的下劃線，下同)，利用gibson組裝的原理(gibson,2011,enzymaticassemblyofoverlappingdnafragments.methodsenzymol.,498:349-361.下同)，按質(zhì)粒載體多片段一步組裝的方法(zhuetal.,2014,robustmulti-typeplasmidmodificationsbasedonisothermalinvitrorecombination.gene,548:39-42.下同)，獲得含3.5kb的zmpl基因表達(dá)盒(圖2中兩個(gè)noti位點(diǎn)之間)的多基因供給載體，命名為pyl322d1-zmpl(用于第1輪組裝)。

zmlc基因表達(dá)盒pyl322d2-zmlc構(gòu)建：用引物pd2-1/pd2-2反向擴(kuò)增多基因供給載體ii(即pylsv,見linetal.,2003；zl02134869.3。下同)，獲得載體骨架片段a；以水稻日本晴基因組dna為模板，用引物fensp2/rensp2擴(kuò)增約2.3kb的水稻胚乳特異啟動(dòng)子序列(genbankno.ay427569)，命名為ensp2，作為片段b；用引物f-lc/r-lc擴(kuò)增zmlc基因，作為片段c；參考質(zhì)粒psat3(genbankno.dq005465)的甘露堿合成酶終止子tmas序列，直接合成片段d(其5’端具有與片段c的3’端重疊的序列cgcaaagctatagggaagcggtga，3’端具有與載體骨架片段a的5’端重疊的序列g(shù)tcgacatgtacaagcttgc)。每個(gè)片段兩側(cè)，分別帶有20～25bp的同源序列，利用gibson組裝的原理，按質(zhì)粒載體多片段一步組裝的方法，獲得含4.5kb的zmlc基因表達(dá)盒(圖2中兩個(gè)noti位點(diǎn)之間)的多基因供給載體，命名為pyl322d1-zmlc(用于第2輪組裝)。

ssf3h基因表達(dá)盒pyl322d1-ssf3h構(gòu)建：用引物pd1-1/pd1-2反向擴(kuò)增多基因供給載體i(linetal.,2003；zl02134869.3)，獲得載體骨架片段a；以水稻日本晴基因組dna為模板，用引物fensp3/rensp3擴(kuò)增約1.5kb的水稻胚乳特異啟動(dòng)子序列(genbankno.ay427571)，命名為ensp3，作為片段b；用引物f-f3h/r-f3h擴(kuò)增ssf3h基因，作為片段c；用引物f-t35s/r-t35s從質(zhì)粒pcambia1300(cambia公司，genbankno.af234296.1)擴(kuò)增camv35s終止子t35s作為片段d。每個(gè)片段兩側(cè)，分別帶有20～25bp的同源序列，利用gibson組裝的原理，按質(zhì)粒載體多片段一步組裝的方法，獲得含2.8kb的ssf3h基因表達(dá)盒的多基因供給載體pyl322d1-ssf3h(用于第3輪組裝)。

sschi基因表達(dá)盒pyl322d2-sschi構(gòu)建：用引物pd2-1/pd2-2反向擴(kuò)增多基因供給載體ii(linetal.,2003；zl02134869.3)，獲得載體骨架片段a；以水稻日本晴基因組dna為模板，用引物fensp4/rensp4擴(kuò)增約1kb的水稻胚乳特異啟動(dòng)子序列(genbankno.ay427575)，命名為ensp4，作為片段b；用引物f-chi/r-chi擴(kuò)增sschi基因，作為片段c；參考質(zhì)粒psat1(genbankno.dq005461)章魚堿合成酶終止子(ocsterminator)，簡稱tocs終止子，直接合成tocs序列作為片段d(其5’端具有與片段c的3’端重疊的序列g(shù)gacttgctgaagcagacatga，3’端具有與載體骨架片段a的5’端重疊的序列g(shù)tcgacatgtacaagcttgc)。每個(gè)片段兩側(cè)，分別帶有20～25bp的同源序列，利用gibson組裝的原理，按質(zhì)粒載體多片段一步組裝的方法，獲得含3.7kb的sschi基因表達(dá)盒的多基因供給載體pyl322d1-sschi。

ssdfr基因表達(dá)盒構(gòu)建進(jìn)入pyl322d2-sschi獲得pyl322d2-sschi/ssdfr:以水稻日本晴基因組dna為模板，用引物fensp5/rensp5擴(kuò)增約2.3kb的水稻胚乳特異啟動(dòng)子(genbankno.eu264106)，命名為ensp5，作為片段a；用引物f-dfr/r-dfr擴(kuò)增ssdfr基因，作為片段b；參考質(zhì)粒psat7(genbankno.dq005453)直接合成農(nóng)桿堿合成酶終止子(agropinesynthaseterminator)，簡稱tags終止子，再用引物f-tags/r-tags擴(kuò)增作為片段c。上述3個(gè)片段間具有20～25bp的同源序列，混合上述片段作為模板，用引物f-dfr-a/r-dfr-a做重疊pcr擴(kuò)增，直接拼接成2.5kb的ensp5-ssdfr-tags表達(dá)盒，兩側(cè)加asci酶切位點(diǎn)；最終用asci酶切連入pyl322d2-sschi載體的相同位點(diǎn)，獲得具有兩個(gè)基因表達(dá)盒的多基因供給載體pyl322d2-sschi/ssdfr(用于第4輪組裝)。

ssans基因表達(dá)盒pyl322d1-ssans構(gòu)建：用引物pd1-1/pd1-2反向擴(kuò)增多基因供給載體i(pylvs，見linetal.,2003；zl02134869.3)，獲得載體骨架片段a；以水稻日本晴基因組dna為模板，用引物fensp6/rensp6擴(kuò)增0.64kb的水稻胚乳特異啟動(dòng)子(genbankno.d63901)，命名為ensp6，作為片段b；用引物f-ans/r-ans擴(kuò)增ssans基因，作為片段c；參考質(zhì)粒psat2(genbankno.dq005463)對應(yīng)序列，直接合成胭脂堿合成酶終止子(nopalinesynthaseterminator)，簡稱tnos終止子，作為片段d(其5’端具有與片段c的3’端重疊的序列ccaaacgaggatgaatctaattaa，3’端具有與載體骨架片段a的5’端重疊的序列g(shù)tcgacatgtacaagcttagc)。每個(gè)片段兩側(cè)，分別帶有20～25bp的同源序列，利用gibson組裝的原理，按質(zhì)粒載體多片段一步組裝的方法，獲得含2.0kb的ssans基因表達(dá)盒的多基因供給載體pyl322d1-ssans(用于第5輪組裝)。

ssf3’h基因表達(dá)盒pyl322d2-ssf3’h構(gòu)建：用引物pd2-1/pd2-2反向擴(kuò)增多基因供給載體ii(linetal.,2003；zl02134869.3)，獲得載體骨架片段a；用引物fensp7/rensp7、水稻日本晴基因組dna為模板，擴(kuò)增約0.8kb的水稻胚乳特異啟動(dòng)子序列(genbankno.ay427572)，命名為ensp7，作為片段b；用引物f-f3’h/r-f3’h擴(kuò)增ssf3’h基因，作為片段c；參考質(zhì)粒psat6(genbankno.dq005473)對應(yīng)序列，直接合成核糖體小亞基終止子(rubiscosmallsubunitterminator)，簡稱trbc終止子，作為片段d(其5’端具有與片段c的3’端重疊的序列catgtttatgaagctcaagcttga，3’端具有與載體骨架片段a的5’端重疊的序列cgagctagcggccgcatgcatcgat)。每個(gè)片段兩側(cè)，分別帶有20～25bp的同源序列，利用gibson組裝的原理，按質(zhì)粒載體多片段一步組裝的方法，獲得含3.3kb的ssf3’h基因表達(dá)盒的多基因供給載體pyl322d1-ssf3’h。

sschs基因表達(dá)盒構(gòu)建進(jìn)入pyl322d2-ssf3’h獲得pyl322d2-ssf3’h/sschs:以水稻日本晴基因組dna為模板，用引物fensp8/rensp8擴(kuò)增0.9kb的水稻胚乳特異啟動(dòng)子序列(genbankno.ay427574)，命名為ensp8，作為片段a；用引物f-chs/r-chs擴(kuò)增sschs基因，作為片段b；參考質(zhì)粒psat3(genbankno.dq005465)的甘露堿合成酶終止子tmas序列，直接合成，再用引物f-tmas/r-tmas擴(kuò)增作為片段c作為片段c。上述片段間具有20～25bp的同源序列，混合上述片段作為模板，用引物f-chs-a/r-chs-a做重疊pcr方式擴(kuò)增，直接拼接成2.4kb的ensp8-sschs-tmas表達(dá)盒，兩側(cè)加asci酶切位點(diǎn)；最終用asci酶切連入pyl322d2-sschs載體的相同位點(diǎn)，獲得具有兩個(gè)基因表達(dá)盒的多基因供給載體pyl322d2-ssf3’h/sschs(用于第6輪組裝)。

s1.3.含2個(gè)基因的marker-free結(jié)構(gòu)構(gòu)建：

用引物f-322-s/r-322-b反向擴(kuò)增質(zhì)粒pcambia1300，獲得的兩端具有saci和bamhi位點(diǎn)的pbr322復(fù)制子，與直接商業(yè)合成的含gateway重組位點(diǎn)片段saci/attp1/noti/loxp/asci/fsei/hindiii/loxp/attp2/bamhi(序列如下)，用saci和bamhi雙酶切后連接，獲得中間載體mf-1；用引物f-hpt-a/r-hpt-a從質(zhì)粒pcambia1300直接擴(kuò)增獲得兩端具有asci位點(diǎn)的2.1kb的抗潮霉素基因hpt的表達(dá)盒，asci單酶切連接入中間載體mf-1的相同位點(diǎn)，獲得中間載體mf-2；以水稻中花11基因組dna為模板，用引物f-v4/r-v4直接pcr擴(kuò)增水稻花藥特異表達(dá)基因(基因號os04g0604000)啟動(dòng)子pv4作為片段a、參考cre酶基因序列(genbankno.dq340306)直接合成cre基因，以其為模板，再用引物f-cre/r-cre直接pcr擴(kuò)增，獲得片段b，參考質(zhì)粒psat2(genbankno.dq005463)對應(yīng)序列、合成tnos終止子，用引物f-nos/r-nos進(jìn)行pcr，獲得片段c，上述片段具有20～25bp同源序列，混合上述片段作為模板，用引物f-mf-f/r-mf-h做重疊pcr直接拼接出兩側(cè)具有fsei和hindiii位點(diǎn)的約3.2kb的cre標(biāo)記刪除基因表達(dá)盒；用fsei和hindiii雙酶切cre標(biāo)記刪除基因表達(dá)盒、連接進(jìn)入相同位點(diǎn)的中間載體mf-2，獲得含hpt標(biāo)記基因和cre標(biāo)記刪除基因的marker-free結(jié)構(gòu)載體mf-hpt-cre(用于第7輪組裝)。

合成的含gateway重組位點(diǎn)的片段序列：

atcacaagtttgtacaaaaaagcaggctgaagtcataacttcgtatagcatacattatacgaagttatatatcataacttcgtatagcatacattatacgaagttatgacccagctttcttgtacaaagtggt(方框表示酶切位點(diǎn)，下劃線為對應(yīng)位點(diǎn))。

s2.水稻胚乳特異合成花青素的多基因載體pyltac380mf-10g的組裝：多基因載體系統(tǒng)是由1個(gè)基于可轉(zhuǎn)化人工染色體(tac)的接受載體質(zhì)粒pyltac747和2個(gè)裝載基因的供給載體i質(zhì)粒pylvs和供給載體ii質(zhì)粒pylsv組成，利用cre/loxp位點(diǎn)特異重組方法，使不同的供給載體交替地和接受載體進(jìn)行2輪以上的基因組裝，構(gòu)建多基因載體(linetal.,2003；zl02134869.3)。

s2.1.zmpl基因表達(dá)盒的組裝(第1輪)：將供給載體pyl322d1-zmpl質(zhì)粒與接受載體tac質(zhì)粒混合，用bio-redgenepulserxcell電激儀(參數(shù)為voltage：1600v，charge：fast，voltageboosterresistance：200ω，capacitance：25μf)轉(zhuǎn)化表達(dá)cre酶的大腸桿菌菌株ns3529(linetal.,2003)感受態(tài)細(xì)胞，在卡拉霉素(25mg/l)和氯霉素(15mg/l)的雙抗lb平板(下同)上篩選轉(zhuǎn)化子，利用ns3529內(nèi)源表達(dá)的cre酶，實(shí)現(xiàn)供給載體質(zhì)粒重組和供給載體骨架的刪除。洗下雙抗平板上的混合菌落混抽質(zhì)粒，再用i-scei酶切消除未重組的質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化不含cre基因的大腸桿菌dh10b，在卡拉霉素平板上鑒定獲得含1個(gè)基因的tac載體質(zhì)粒，命名為pyltac380gw-1g。

s2.2.zmlc基因表達(dá)盒的組裝(第2輪)：將供給載體pyl322d2-zmlc質(zhì)粒與步驟s2.1構(gòu)建的含zmpl基因表達(dá)盒的接受載體pyltac380gw-1g質(zhì)?；旌希娂まD(zhuǎn)化ns3529感受態(tài)細(xì)胞，在卡拉霉素(25mg/l)和氨芐霉素(70mg/l)雙抗lb平板(下同)上篩選轉(zhuǎn)化子，利用ns3529內(nèi)源表達(dá)的cre酶，實(shí)現(xiàn)供給載體質(zhì)粒重組和供給載體骨架的刪除。洗下雙抗平板上的混合菌落混抽質(zhì)粒，再用pi-scei酶切切斷未重組質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh10b，在卡拉霉素平板上鑒定獲得含2個(gè)基因的載體pyltac380gw-2g。

s2.3.ssf3h基因表達(dá)盒的組裝(第3輪)：將供給載體pyl322d1-ssf3h質(zhì)粒與步驟s2.2獲得的含2個(gè)目的基因的接受載體pyltac380gw-2g質(zhì)?；旌?，共同電激轉(zhuǎn)化表達(dá)cre酶的大腸桿菌菌株ns3529感受態(tài)細(xì)胞，在卡拉霉素和氯霉素雙抗平板上篩選轉(zhuǎn)化子，利用ns3529內(nèi)源表達(dá)的cre酶，實(shí)現(xiàn)供給載體質(zhì)粒重組和其骨架的刪除，洗下雙抗平板上的混合菌落混抽質(zhì)粒，再用i-scei酶切消除未重組質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化dh10b，在卡拉霉素平板上鑒定獲得含3個(gè)基因的載體pyltac380gw-3g。

s2.4.sschi基因表達(dá)盒和ssdfr基因表達(dá)盒的雙基因組裝(第4輪)：將含sschi基因和ssdfr基因的供給載體pyl322d2-sschi/ssdfr質(zhì)粒與步驟s2.3獲得的含3個(gè)基因的接受載體pyltac380gw-3g質(zhì)粒混合，電激轉(zhuǎn)化ns3529感受態(tài)細(xì)胞，在卡拉霉素和氨芐霉素雙抗平板上篩選轉(zhuǎn)化子，利用ns3529內(nèi)源表達(dá)的cre酶，實(shí)現(xiàn)供給載體質(zhì)粒重組和其骨架的刪除。洗下雙抗平板上的混合菌落混抽質(zhì)粒，再用pi-scei酶切消除未重組質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh10b感受態(tài)細(xì)胞，在卡拉霉素平板上鑒定獲得含花青素合成必需的5個(gè)基因的多基因載體pyltac380gw-5g。

s2.5.ssans基因表達(dá)盒的組裝(第5輪)：將供給載體pyl322d1-ssans質(zhì)粒與步驟s2.4獲得的含5個(gè)目的基因的接受載體pyltac380gw-5g質(zhì)?；旌?，電激轉(zhuǎn)化表達(dá)cre酶的大腸桿菌菌株ns3529感受態(tài)細(xì)胞，在卡拉霉素和氯霉素雙抗平板上篩選轉(zhuǎn)化子，利用ns3529內(nèi)源表達(dá)的cre酶，實(shí)現(xiàn)供給載體質(zhì)粒重組和供給載體骨架的刪除。洗下雙抗平板上的混合菌落混抽質(zhì)粒，再用i-scei酶切消除未重組的質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化不含cre基因的大腸桿菌dh10b，在卡拉霉素平板上鑒定獲得含6個(gè)基因的多基因載體pyltac380gw-6g。

s2.6.ssf3’h基因表達(dá)盒和sschs基因表達(dá)盒的雙基因組裝(第6輪)：將含ssf3’h基因和sschs基因的供給載體pyl322d2-ssf3’h/sschs質(zhì)粒與步驟s2.5獲得的含6個(gè)基因的接受載體pyltac380gw-6g質(zhì)粒混合，電激轉(zhuǎn)化ns3529感受態(tài)細(xì)胞，在卡拉霉素和氨芐霉素雙抗平板上篩選轉(zhuǎn)化子，利用ns3529內(nèi)源表達(dá)的cre酶，實(shí)現(xiàn)供給載體質(zhì)粒重組和其骨架的刪除。洗下雙抗平板上的混合菌落混抽質(zhì)粒，再用pi-scei酶切消除未重組質(zhì)粒后，轉(zhuǎn)化dh10b，在卡拉霉素平板上鑒定獲得含花青素合成必需的8個(gè)基因的多基因載體pyltac380gw-8g。

s2.7.marker-free結(jié)構(gòu)載體的組裝(第7輪)：

將含hpt標(biāo)記基因和cre標(biāo)記刪除基因的pbr322-hpt-cre質(zhì)粒與步驟s2.6獲得的含8個(gè)花青素合成必需基因的接受載體pyltac380gw-8g質(zhì)粒混合，加入gateway反應(yīng)的bp混合酶，25℃反應(yīng)5小時(shí)，再直接電激轉(zhuǎn)化dh10b感受態(tài)細(xì)胞，在卡拉霉素，在卡拉霉素平板上鑒定獲得含10個(gè)基因的多基因載體pyltac380mf-10g(圖2)。

s3.多基因載體pyltac380mf-10g的水稻轉(zhuǎn)化與檢測

水稻的遺傳轉(zhuǎn)化：把多基因載體pyltac380mf-10g質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌eha105，用于轉(zhuǎn)化水稻胚愈傷組織。將水稻品種中花11未成熟種子或成熟種子，在25℃黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織(nishimuraetal.2006,aprotocolforagrobacterium-mediatedtransformationinrice.natprotoc.，1:2796-2802。下同)。用適量的轉(zhuǎn)有多基因載體質(zhì)粒的農(nóng)桿菌懸浮于加有100μmol/l乙酰丁香酮的侵染液培養(yǎng)基中，28℃震蕩培養(yǎng)(200rpm，0.5h)，用分光光度計(jì)調(diào)od550值為0.3～0.4，即可用于愈傷組織的浸染。挑選顏色新鮮呈淡黃色、生長旺盛的顆粒狀胚性愈傷組織，和農(nóng)桿菌菌液混合，浸泡20min，吸干菌液后轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(2n6-as培養(yǎng)基)(nishimura，etal.,2006)，暗培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)移到含50mg/l潮霉素的篩選培養(yǎng)基(n6d-s培養(yǎng)基)(nishimura，etal.,2006)上，每2周繼一次代，繼代2次?？剐院Y選后，把帶有綠點(diǎn)的抗性愈傷轉(zhuǎn)到有分化培養(yǎng)基上，分化出轉(zhuǎn)化苗，獲得轉(zhuǎn)化植株。

s3.1.轉(zhuǎn)化植株基因組pcr檢測：對獲得的t0代植株葉片，用sds法抽提基因組dna作為模板，用引物f-sschs/r-sschs、f-sschi/r-sschi、f-ssf3h/r-ssf3h、f-ssf3’h/r-ssf3’h、f-ssdfr/r-ssdfr、f-ssans/r-ssans、f-zmpl/r-zmpl和f-zmlc/r-zmlc分別pcr擴(kuò)增，檢測外源sschs(約398bp)、sschi(約336bp)、ssf3h(約529bp)、ssf3’h(約403bp)、ssdfr(約466bp)、ssans(約400bp)、zmpl(497bp)和zmlc(約485bp)八個(gè)基因。所用擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec，58℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸5min。結(jié)果顯示，野生型(wt)對照都不能擴(kuò)出外源基因，轉(zhuǎn)基因植株都能擴(kuò)出上述8個(gè)基因(圖3)。

s3.2.轉(zhuǎn)基因植株t1種子的rt-pcr檢測：把轉(zhuǎn)基因植株的t1代授粉后20天呈現(xiàn)紫色的發(fā)育種子，液氮條件下研磨成粉，再用trizol方法抽提種子的總rna，用mmv逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，oligdt引物反轉(zhuǎn)錄為cdna作為模板，用與s3.1.相同的檢測引物分別進(jìn)行外源sschs、sschi、ssf3h、ssf3’h、ssdfr、ssans、zmpl和zmlc的rt-pcr檢測，用引物f-actin1/r-actin1擴(kuò)增水稻內(nèi)源actin1基因(約480bp)作為內(nèi)參。除actin1引物外，其余基因檢測引物和擴(kuò)增條件同s3.1.的檢測條件，只是pcr循環(huán)數(shù)改為25個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示，對照野生型種子不能擴(kuò)出外源基因，紫色的轉(zhuǎn)基因種子能擴(kuò)增出特異的正確條帶，外源基因在種子中均能表達(dá)(圖4)。

s3.3.轉(zhuǎn)基因植株標(biāo)記刪除鑒定：

對獲得的t1代植株葉片，用sds法抽提基因組dna作為模板，用pcr擴(kuò)增方法，檢測標(biāo)記基因刪除情況。用引物fm1、r1、r2同時(shí)進(jìn)行三引物pcr擴(kuò)增；其中r1位于hpt基因編碼區(qū)內(nèi)測，與fm1擴(kuò)增產(chǎn)物約550bp；fm1和r2位于兩個(gè)loxp位點(diǎn)外側(cè)，當(dāng)沒發(fā)生片段刪除時(shí)距離約5.4kb，在30sec延伸條件下是不能擴(kuò)增出目標(biāo)片段的，而只有當(dāng)發(fā)生片段刪除時(shí)，才能擴(kuò)增約300bp的小片段。所用引物請見表1，所用擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec，58℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸5min。結(jié)果顯示，t1代植株大多發(fā)生了預(yù)期的部分標(biāo)記刪除，t2代植株能獲得預(yù)期的標(biāo)記基因刪除純合體；對300bp的pcr產(chǎn)物直接測序，結(jié)果表明該片段序列與預(yù)期的標(biāo)記刪除后產(chǎn)生的序列完全一致，證明獲得了無標(biāo)記(marker-free)的轉(zhuǎn)基因植株(圖5)。

實(shí)施例2

轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中花青素的外觀和高效液相色譜檢測：

轉(zhuǎn)基因水稻胚乳中花青素的觀察：在導(dǎo)入上述8個(gè)基因的轉(zhuǎn)基因水稻種子糙米比野生型糙米顏色明顯加深，加工成精米(去除種皮)后，其整個(gè)種子呈現(xiàn)出深的紫黑色；其不同橫切面觀察，顯示整個(gè)胚乳內(nèi)部也為紫黑色(胚為正常黃白色)，表明花青素特異在轉(zhuǎn)基因水稻的胚乳合成(圖6)。

轉(zhuǎn)基因水稻種子花青素的提取與高效液相色譜(hplc)鑒定：取轉(zhuǎn)基因材料和野生型對照的水稻種子各0.1g，研磨成粉末，加入1毫升酸化甲醇(甲醇：水：hcl＝85:12:3)，在4℃，黑暗條件下提取8h；12000g，4℃離心15min，收集并用直徑為0.45mm的millipore濾頭過濾上清液作為樣品。使用hp1200-dad高效液相色譜系統(tǒng)(agilenttechnologies,waldbronn,germany)對樣品在520nm(mau520)對花青素進(jìn)行分析。色譜條件為使用nucleodurhc18色譜柱(250mm×4.60mm)(pretechinstruments,sollentuna,sweden)，柱溫為40℃，流動(dòng)相流速為1ml/min，流動(dòng)相包括溶液a(1.6％甲酸甲醇溶液)與溶液b(1.6％甲酸水溶液)兩種。洗脫程序?yàn)?0-5min時(shí)，15％a和85％b；5-10min時(shí)，20％a和80％b；10-28min時(shí)，28％a和72％b；28-32min時(shí)，40％a和60％b；32-40mi時(shí)，0％a和100％b；花青素hplc純標(biāo)樣矢車菊-3-o-葡萄糖苷(cyanidin3-o-glucoside，c3g)、芍藥色素-3-o-葡萄糖苷(peonidin3-o-glucoside，p3g)、天竺葵-3-o-葡萄糖苷(pelargonidin3-o-glucoside,pel3g)和矢車菊-3，5,-二葡萄糖苷(cyanidin-3,5-diglucoside，c35g)購自sigma公司，并作為對照。繪制花青素標(biāo)樣c3g和p3g標(biāo)準(zhǔn)曲線對水稻種子樣本中花青素做定量分析。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)基因水稻種子具有與花青素標(biāo)樣c3g和p3g相同的特征峰，表明在轉(zhuǎn)基因水稻種子中成功合成了c3g和p3g兩種花青素，總含量可達(dá)1mg/g(圖7)。

實(shí)施例3

轉(zhuǎn)基因水稻和野生型種子(授粉后7天和14天)的內(nèi)源基因和外源基因的半定量rt-pcr表達(dá)檢測：

轉(zhuǎn)基因植株t3代種子的半定量rt-pcr檢測：把轉(zhuǎn)基因植株和野生型對照授粉后7天和14天的種子，液氮條件下研磨成粉，再用trizol方法抽提種子的總rna，用mmv逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，oligdt引物反轉(zhuǎn)錄為cdna模板，用與實(shí)施例1步驟s3.1.和s3.2.相同的引物對8個(gè)外源基因sschs、sschi、ssf3h、ssf3’h、ssdfr、ssans、zmpl和zmlc和水稻內(nèi)源actin1基因(內(nèi)參)進(jìn)行半定量rt-pcr檢測；用引物f-osc1/r-osc1、f-osb1/r-osb1、f-osb2/r-osb2、f-osrc/r-osrc、f-oswd40/r-oswd40、f-oschs/r-oschs、f-oschi/r-oschi、f-osf3h/r-osf3h、f-osf3’h/r-osf3’h、f-osdfr/r-osdfr、f-osans/r-osans、f-os3gt/r-os3gt、f-osa3’mt/r-osa3’mt、f-osgstu/r-osgstu、f-osmrp15/r-osmrp15和f-osanp/r-osanp對16個(gè)相關(guān)內(nèi)源基因osc1、osb1、osb2、osrc、oswd40、oschs、oschi、osf3h、osf3’h、osdfr、osans、os3gt、osa3’mt、osgstu、osmrp15和osanp分別進(jìn)行半定量rt-pcr檢測；擴(kuò)增條件同實(shí)施例1步驟s3.1，只是pcr循環(huán)數(shù)改為22個(gè)循環(huán)。結(jié)果顯示(圖8)，外源基因只在轉(zhuǎn)基因種子中強(qiáng)表達(dá)；內(nèi)源基因在野生型種子中大多不表達(dá)或表達(dá)極低，在轉(zhuǎn)基因植株中外源調(diào)節(jié)基因只能激活部分結(jié)構(gòu)基因，激活修飾基因和轉(zhuǎn)運(yùn)基因表達(dá)；當(dāng)外源基因與外源基因激活的內(nèi)源基因共同表達(dá)時(shí)，才能在胚乳中實(shí)現(xiàn)花青素的合成。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種在作物種子胚乳合成花青素的轉(zhuǎn)基因育種方法

<130>2

<160>134

<170>patentinversion3.5

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gagttgcttccaaattcttaatctaggtggatggacagaccc42

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<211>30

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tcatcatcaatattataataaaaatatcca30

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aaataaggcgcgccaaactatttttatgtatgcaagagtcag42

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aaataaggcgcgcctcatcatcaatattataataaaaatatccattaaacacg53

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<212>dna

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<220>

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<400>53

ctagctcgagaggcgcgcctacccttctacatcggcttaggtgtagc47

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<211>49

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<210>55

<211>49

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<220>

<223>f-ans

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ccttcaccacaattcaaatattataatggttgctacaatagctccaagc49

<210>56

<211>47

<212>dna

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<220>

<223>r-ans

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gcaagcttgtacatgtcgacactggataattataatatcagt42

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tgcatgcgatgatggcagccattgctgattctacaatactagtg44

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<212>dna

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agtagccatcgggcttatgatcaagcttgagcttcataaacatg44

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<211>21

<212>dna

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gatcttttaaccgtgctacgc21

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<220>

<223>r-chs

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<220>

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cttcacagtgttcctcttaattaaaatcttggactcccatgttggc46

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<212>dna

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<220>

<223>r-tmas

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gcggccgcgatctgataatttatttgaaaattc33

<210>67

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<212>dna

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<220>

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<400>68

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<223>r-hpt-a

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aattaaggcgcgccgcggtttgcgtattggctagagcagcttgc44

<210>73

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<212>dna

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<223>r-v4

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<210>75

<211>48

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<223>f-cre

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<212>dna

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<220>

<223>r-cre

<400>76

ccaaatgtttgaacgatcgggactaatcgccatcttccagcagg44

<210>77

<211>44

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-nos

<400>77

cctgctggaagatggcgattagtcccgatcgttcaaacatttgg44

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<212>dna

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<220>

<223>r-nos

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<212>dna

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<212>dna

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<212>dna

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<220>

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<400>86

ctgcttgatggtctgcgttcttg23

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<211>23

<212>dna

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<220>

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<400>87

gcagggagtggtggtaaagatga23

<210>88

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<212>dna

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<220>

<223>r-ssf3'h

<400>88

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<210>89

<211>23

<212>dna

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<212>dna

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<210>91

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<212>dna

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<400>91

gacgaggaaaggcggaggaaatg23

<210>92

<211>23

<212>dna

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<220>

<223>r-ssans

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<210>93

<211>23

<212>dna

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<220>

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<211>23

<212>dna

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<220>

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<400>94

catcatcattggcgtcggcgtct23

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<211>23

<212>dna

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<220>

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<400>95

gacgggagcagcacaggaaatga23

<210>96

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-zmlc

<400>96

ggctcttgatggcgtcgaacact23

<210>97

<211>20

<212>dna

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<220>

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<400>97

caacacccctgctatgtacg20

<210>98

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-actin1

<400>98

atcaccagagtccaacacaa20

<210>99

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<212>dna

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<223>fm1

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<212>dna

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<223>r1

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gtctggaccgatggctgtgtag22

<210>101

<211>21

<212>dna

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<223>r2

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ccatactctttgctatcctac21

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<211>20

<212>dna

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ctactggaacagcacgctca20

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<211>20

<212>dna

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<220>

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ctcacgtcgtccatccagtc20

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<211>22

<212>dna

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<223>f-osb1

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<212>dna

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<220>

<223>r-osb1

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tagctttccggagagcttctg21

<210>106

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<212>dna

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<223>f-osb2

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ggcgtgcttgagctgggaacc21

<210>107

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-osb2

<400>107

gtcgcctagctcgtcttctcc21

<210>108

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-osrc

<400>108

ccatgtgctgaaagagaggag21

<210>109

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-osrc

<400>109

cgatgatggacacctgcaccac22

<210>110

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

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<400>110

ggacaaggagcattccacca20

<210>111

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-oswd40

<400>111

tctctgcaccggcatcatac20

<210>112

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-oschs

<400>112

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<210>113

<211>20

<212>dna

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<223>r-oschs

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<211>20

<212>dna

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<220>

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<400>114

cagtactcggacaaggtgac20

<210>115

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-oschi

<400>115

ggattccgccttcaggagctg21

<210>116

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-osf3h

<400>116

agggtggcgtacaaccagttc21

<210>117

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-osf3h

<400>117

ggacttcaccgggtacgagaag22

<210>118

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-osf3'h

<400>118

atcaaggagacgtttcggcttc22

<210>119

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-osf3'h

<400>119

tggcagtcatcagtgtgaccat22

<210>120

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

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<223>f-osdfr

<400>120

gcccactactcgatcctgaa20

<210>121

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-osdfr

<400>121

cagcgtgtacctgaacctga20

<210>122

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-osans

<400>122

tgacggatgtggagctgaga20

<210>123

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-osans

<400>123

tgtatgacgccccactcctc20

<210>124

<211>18

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-os3gt

<400>124

gcgaccagaggacgaacg18

<210>125

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-os3gt

<400>125

gattatctcgacgaacttgg20

<210>126

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-osa3'mt

<400>126

gtggtggtggagtgcgtgctgc22

<210>127

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-osa3'mt

<400>127

catcagccagcagcaaacgac21

<210>128

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-osgstu

<400>128

gggcctgcgagaacctcaacg21

<210>129

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-osgstu

<400>129

aaccttgcatgcatgttcacc21

<210>130

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-osmrp15

<400>130

gagacgatgccgtatcttagttc23

<210>131

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-osmrp15

<400>131

tttgtggcactatcatctcatc22

<210>132

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-osanp

<400>132

ctcgtgctcgccttcagcgac21

<210>133

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-osanp

<400>133

cccacttgtgcacacgagctg21

<210>134

<211>175

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>含gateway重組位點(diǎn)的片段序列

<400>134

gagctcatcacaagtttgtacaaaaaagcaggctgaagcggcgccgtcataacttcgtat60

agcatacattatacgaagttatggcgcgccatggccggccatcaagcttataacttcgta120

tagcatacattatacgaagttatgacccagctttcttgtacaaagtggtggatcc175