本發(fā)明涉及生物技術(shù)和植物基因工程領(lǐng)域，特別涉及一種花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4及其應(yīng)用。

背景技術(shù)：

啟動(dòng)子是rna聚合酶特異性識(shí)別和結(jié)合的dna序列，控制基因表達(dá)的起始時(shí)間、表達(dá)程度和表達(dá)位置。按其功能，主要分為組成型啟動(dòng)子、誘導(dǎo)型啟動(dòng)子和特異性啟動(dòng)子三大類。組成型啟動(dòng)子表達(dá)基因沒(méi)有時(shí)空特異性，在各組織器官均有表達(dá)，如玉米u(yù)biqultin啟動(dòng)子、水稻actinl啟動(dòng)子和花椰菜花葉病毒(camv)35s啟動(dòng)子；誘導(dǎo)型啟動(dòng)子控制的基因，其表達(dá)受各種誘導(dǎo)因子，如激素、化學(xué)物質(zhì)、溫度和光等的誘導(dǎo)表達(dá)；而特異性啟動(dòng)子控制的基因的表達(dá)具有器官或組織特異性和時(shí)空性，如水稻花器官特異表達(dá)啟動(dòng)子osm45、水稻花藥特異性啟動(dòng)子osg6b、煙草花藥絨氈層特異性啟動(dòng)子ta29等。

植物基因工程操作和轉(zhuǎn)基因方法使外源基因?qū)胫参锔鼮橛行?，為功能基因組的開(kāi)展和農(nóng)作物基因工程育種奠定了基礎(chǔ)。常規(guī)轉(zhuǎn)基因操作，都需要利用抗生素作為篩選標(biāo)記，提高轉(zhuǎn)基因植物篩選的效率。由于常規(guī)轉(zhuǎn)基因植物，大多保留了抗性篩選基因，這大大增加了人們對(duì)轉(zhuǎn)基因植物，特別是轉(zhuǎn)基因食品安全性的憂慮，擔(dān)心以抗生素為篩選標(biāo)記的選擇標(biāo)記基因及其產(chǎn)物在食用時(shí)會(huì)產(chǎn)生毒性或引起過(guò)敏反應(yīng)。盡管并沒(méi)有確切的證據(jù)證實(shí)存在這種安全隱患，但這種憂慮嚴(yán)重地阻礙了轉(zhuǎn)基因植物產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化和商業(yè)化進(jìn)程。因此，建立一種簡(jiǎn)單、高效的無(wú)篩選標(biāo)記的植物重組表達(dá)載體系統(tǒng)，對(duì)提高轉(zhuǎn)基因植物的安全性，促進(jìn)其產(chǎn)品的產(chǎn)業(yè)化和商業(yè)化進(jìn)程有著十分重要的作用和意義。

無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)基因植物獲得的方法主要有：共轉(zhuǎn)化方法(包括使用雙t-dna區(qū)載體)、轉(zhuǎn)座子方法、同源重組法和位點(diǎn)特異性重組方法。其中位點(diǎn)特異性重組方法是目前用得最廣的方法，其主要是利用重組酶與其特異識(shí)別的dna位點(diǎn)，主要包括來(lái)源于噬菌體p1的cre/loxp系統(tǒng)、酵母2μ質(zhì)粒的flp/frt系統(tǒng)和酵母psrl的r/rs系統(tǒng)。其中cre/loxp系統(tǒng)是目前研究與使用最多的成熟系統(tǒng)。利用cre/loxp系統(tǒng)進(jìn)行標(biāo)記基因刪除(markerfree)操作的策略主要有兩類：(1)把cre酶基因表達(dá)盒用雜交或再轉(zhuǎn)化的間接方法，導(dǎo)入篩選標(biāo)記基因含有l(wèi)oxp位點(diǎn)的轉(zhuǎn)基因植物，再通過(guò)自交進(jìn)一步分離去掉重組酶基因及轉(zhuǎn)化重組酶基因所引入的另一個(gè)篩選標(biāo)記，整個(gè)過(guò)程耗時(shí)費(fèi)力，也不適于無(wú)性繁殖植物；(2)表達(dá)cre酶，直接切除位于兩個(gè)同向loxp位點(diǎn)內(nèi)的篩選標(biāo)記基因和cre酶基因表達(dá)盒本身，相比之下，第二種策略更加簡(jiǎn)單有效。由于cre重組酶基因在植物中組成型表達(dá)會(huì)導(dǎo)致植物形態(tài)和產(chǎn)量性狀的改變。因此，使用器官特異誘導(dǎo)啟動(dòng)子，在特定器官和特定時(shí)期調(diào)控cre重組酶基因表達(dá)，能夠?qū)崿F(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的抗性篩選標(biāo)記基因和cre酶基因表達(dá)盒的自身切除。目前，已有一些利用誘導(dǎo)啟動(dòng)子和器官特異啟動(dòng)子控制cre酶基因的表達(dá)，成功實(shí)現(xiàn)轉(zhuǎn)基因植物的markerfree操作的報(bào)道。如煙草花藥絨氈層特異性啟動(dòng)子ta29控制cre的表達(dá)來(lái)獲得markerfree的轉(zhuǎn)基因植物，但是它在單子葉植物中去除標(biāo)記基因效率不高。因此，尋找和利用新的、更加有效地植物器官特異表達(dá)啟動(dòng)子，對(duì)于提高轉(zhuǎn)基因植物安全性具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的首要目的在于克服現(xiàn)有技術(shù)的缺點(diǎn)與不足，提供一種花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4的應(yīng)用。

本發(fā)明的再一目的在于提供一種無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)，其含有花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4。

本發(fā)明的目的通過(guò)下述技術(shù)方案實(shí)現(xiàn)：一種花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4，是具有如下特征的dna分子：其核苷酸序列如seqidno:1所示；或是在嚴(yán)格條件下與seqidno:1限定的dna序列雜交的dna分子；或是與seqidno:1限定的dna序列具有90％以上的相似性，且能調(diào)控目的基因在花藥中特異表達(dá)的dna分子。

該花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4，是水稻villin4基因(loc_os04g51440)的啟動(dòng)子，能啟動(dòng)villin4在水稻花藥中特異性表達(dá)，其中在成熟期花藥中表達(dá)最高，而在其它組織器官如根、莖、葉等器官中沒(méi)有表達(dá)。

所述的花藥優(yōu)選為水稻花藥。

所述的花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4在構(gòu)建于花藥中特異性表達(dá)的基因表達(dá)盒或是于花藥中特異性表達(dá)的表達(dá)載體中的應(yīng)用。

一種于花藥中特異性表達(dá)的基因表達(dá)盒，包含上述花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4。

所述的于花藥中特異性表達(dá)的基因表達(dá)盒，還包括目的表達(dá)基因和終止子。

一種于花藥中特異性表達(dá)的表達(dá)載體，包含上述花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4或是上述于花藥中特異性表達(dá)的基因表達(dá)盒。

所述的于花藥中特異性表達(dá)的表達(dá)載體優(yōu)選為無(wú)篩選標(biāo)記轉(zhuǎn)化載體系統(tǒng)；更優(yōu)選為含有所述pv4啟動(dòng)子的植物cre/loxp重組表達(dá)載體，可在植物中實(shí)現(xiàn)篩選標(biāo)記基因刪除。

所述的植物cre/loxp重組表達(dá)載體的t-dna區(qū)內(nèi)含有兩個(gè)同向loxp序列，兩個(gè)同向1oxp序列之間含有cre重組酶表達(dá)盒和標(biāo)記基因表達(dá)盒；cre重組酶表達(dá)盒中啟動(dòng)cre重組酶表達(dá)的啟動(dòng)子是所述的pv4啟動(dòng)子。

所述的植物cre/loxp重組表達(dá)載體還含有多克隆位點(diǎn)或外源目的基因的表達(dá)盒；多克隆位點(diǎn)或外源目的基因表達(dá)盒位于t-dna區(qū)內(nèi)，在所述兩個(gè)同向loxp序列區(qū)間之外。

所述的植物cre/loxp重組表達(dá)載體被轉(zhuǎn)入植物后，能在花藥發(fā)育過(guò)程中將所述兩個(gè)同向loxp序列之間的cre重組酶表達(dá)盒和篩選標(biāo)記基因表達(dá)盒刪除，從而去除標(biāo)記基因和cre基因本身。

所述的植物cre/loxp重組表達(dá)載體具體可為如圖3所示的9個(gè)表達(dá)載體，即pyl-pv4mf1、pyl-pv4mf2、pyl-pv4mf3、pyl-pv4mf4、pyl-pv4mf5、pyl-pv4mf6、pyl-pv4mf7、pyl-pv4mf8和pyl-pv4mf9。

所述的植物cre/loxp重組表達(dá)載體，可用于轉(zhuǎn)化單子葉植物或雙子葉植物，培育無(wú)篩選標(biāo)記的轉(zhuǎn)基因植物。

所述的單子葉植物包括水稻、玉米、小麥、高粱、大麥、燕麥、黑麥等，優(yōu)選為水稻。

本發(fā)明相對(duì)于現(xiàn)有技術(shù)具有如下的優(yōu)點(diǎn)及效果：

本發(fā)明用含有pv4啟動(dòng)子的植物cre/loxp重組表達(dá)載體的轉(zhuǎn)基因?qū)嶒?yàn)證明，在轉(zhuǎn)基因植物中，pv4啟動(dòng)子可以控制cre重組酶在花藥中的特異表達(dá)，而在愈傷組織和根、莖、葉等器官中沒(méi)有表達(dá)。這樣可以不影響轉(zhuǎn)基因愈傷細(xì)胞的抗性篩選，得到轉(zhuǎn)基因植株和在花藥產(chǎn)生刪除標(biāo)記基因的雄配子，最終在轉(zhuǎn)基因植物后代中可篩選到無(wú)篩選標(biāo)記(markerfree)的轉(zhuǎn)基因植物。

附圖說(shuō)明

圖1為pv4啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的水稻villin4基因的qrt-pcr表達(dá)模式結(jié)果圖；其中，用水稻osactin1基因作為表達(dá)內(nèi)參。

圖2為pv4啟動(dòng)子中預(yù)測(cè)的組織特異表達(dá)的相關(guān)功能元件示意圖，其中，小寫字母為內(nèi)含子；下劃線加陰影為5’utr區(qū)；粗體為重要的花粉特異元件。

圖3為含pv4啟動(dòng)子的植物cre/loxp重組表達(dá)載體系統(tǒng)圖譜圖；其中，圖(a)是具有多克隆位點(diǎn)的不同植物篩選抗性的cre/loxp重組表達(dá)載體示意圖，pyl-pv4mf1、2、3的抗性分別是潮霉素hpt、卡拉霉素nptii以及草甘膦bar；圖(b)是具有玉米u(yù)bi啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因(待克隆)表達(dá)盒的不同植物篩選抗性cre/loxp重組表達(dá)載體，pyl-pv4mf4、5、6的抗性基因分別是抗潮霉素基因hpt、抗卡拉霉素基因nptii以及抗草甘膦基因bar；圖(c)是具有花椰菜35s啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)目的基因(待克隆)表達(dá)盒的不同植物篩選抗性基因-cre/loxp重組表達(dá)載體，pyl-pv4mf7、8、9的抗性基因分別是hpt、nptii以及bar。

圖4為pyl-pv4mf1轉(zhuǎn)化的t0代植株的hpt基因的pcr檢測(cè)結(jié)果圖。

圖5為pyl-pv4mf1轉(zhuǎn)化的t0植株#1的cre基因的rt-pcr表達(dá)分析結(jié)果圖。

圖6為pv4控制cre/loxp系統(tǒng)的篩選標(biāo)記刪除的模式圖；pv4在花藥中驅(qū)動(dòng)cre基因表達(dá)，在花藥中自刪除篩選標(biāo)記基因和cre基因，最終在后代中獲得完全無(wú)篩選標(biāo)記的植株。

圖7為pyl-pv4mf1的t1代植株以p1、p2和p3為引物的pcr擴(kuò)增檢測(cè)篩選標(biāo)記刪除情況結(jié)果圖。

圖8為pyl-pv4mf1的t1代植株發(fā)生篩選標(biāo)記刪除的p1/p3pcr產(chǎn)物測(cè)序結(jié)果圖。

具體實(shí)施方式

下面結(jié)合實(shí)施例及附圖對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步詳細(xì)的描述，但本發(fā)明的實(shí)施方式不限于此。下述實(shí)施例中所使用的試驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)分子生物學(xué)方法；所使用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，為可從商業(yè)途徑得到的試劑和材料。

表1實(shí)施例中各個(gè)名稱引物對(duì)應(yīng)的核苷酸序列

實(shí)施例1

水稻花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4的克隆與分析：

s1.水稻villin4基因的表達(dá)模式：在本發(fā)明的前期研究中，為分離克隆花藥特異表達(dá)的啟動(dòng)子，通過(guò)對(duì)ricexpro芯片(http://ricexpro.dna.affrc.go.jp/)的分析，發(fā)現(xiàn)水稻微絲發(fā)育相關(guān)的villin4基因(loc_os04g51440)主要在水稻花藥中特異高表達(dá)。

提取水稻(品種日本晴)愈傷組織、根、莖、葉及不同發(fā)育時(shí)期花藥和雌蕊的總rna反轉(zhuǎn)錄成cdna，通過(guò)qrt-pcr分析villin4基因的表達(dá)(引物為fq-v4/rq-v4)，用水稻osactin1作為內(nèi)參基因(引物為factin1/ractin1，大小約250bp)，反應(yīng)程序：95℃預(yù)變性30s；95℃變性5s，58℃退火20s，72℃延伸15s，72℃15s讀板，40個(gè)循環(huán)；55℃至90℃溶解曲線。結(jié)果表明，該基因在愈傷、根、莖等組織沒(méi)有表達(dá)，在葉和雌蕊中有微弱表達(dá)，主要是在花藥發(fā)育后期高表達(dá)(圖1)。因此，villin4基因是一個(gè)花藥特異表達(dá)的基因，其啟動(dòng)子pv4是一個(gè)花藥特異表達(dá)的啟動(dòng)子。

s2.villin4基因的啟動(dòng)子pv4的克隆和順式元件分析：villin4基因的atg上游區(qū)1kb處是另一基因的3’端，因此用引物f1/r1擴(kuò)增水稻(日本晴)dna，連入t載體puc18后測(cè)序，獲得villin4基因的啟動(dòng)子pv4(seqidno:1)，即獲得t-pv4載體；用啟動(dòng)子順式元件預(yù)測(cè)網(wǎng)站place(http://www.dna.affrc.go.jp/place/signalup.html)分析seqidno:1，預(yù)測(cè)結(jié)果顯示pv4存在多個(gè)器官或組織特異性表達(dá)的相關(guān)元件，含有多個(gè)花粉特異表達(dá)元件，進(jìn)一步表明pv4是一個(gè)花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子(圖2)。所用pcr擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec、58℃退火30sec、72℃延伸1min，共35個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸5min。

實(shí)施例2

含pv4啟動(dòng)子的植物cre/loxp重組表達(dá)載體系統(tǒng)pyl-pv4mf1～9的構(gòu)建：

s1.pyl-pv4mf1～3重組表達(dá)載體的構(gòu)建：

s1.1.中間載體pyl-mcs的構(gòu)建：用引物f1300/r1300(引物5’末端分別含psti和pmei位點(diǎn))反向擴(kuò)增質(zhì)粒pcambia1300(cambia公司)，獲得含psti和pmei位點(diǎn)、且含t-dna區(qū)的載體骨架(去除hpt表達(dá)盒)；直接合成含多個(gè)唯一酶切位點(diǎn)的psti/fsei/hindiii/saci/asci/swai/sbfi/paci/mlui/pmei多克隆位點(diǎn)片段mcs-i；用psti和pmei雙酶切mcs-i，連入載體骨架的相同位點(diǎn)，獲得中間載體pyl-mcs。

合成的mcs-i片段序列如下：

5’-aattaactgcagatccaggccggccataagctttgagctctaagcgcgcctatttaaatacctgcaggtttaattaagaacgcgttcagtttaaacttaaatta-3’(下劃線分別對(duì)應(yīng)psti/fsei/hindiii/saci/asci/swai/sbfi/paci/mlui/pmei位點(diǎn))。

s1.2.pyl-pv4mf1的構(gòu)建：用引物f-p-lox/r-fsei從pcambia1300質(zhì)粒擴(kuò)增2.2kb的hpt表達(dá)盒，并在兩側(cè)加入psti/loxp位點(diǎn)序列和fsei位點(diǎn)，psti和fsei雙酶切、連入中間載體pyl-mcs的相同位點(diǎn)，獲得中間載體pyl-loxp-hpt；用引物f-p-lox/r-fsei從pcambia2301(cambia公司)質(zhì)粒擴(kuò)增約2.0kb的nptii表達(dá)盒，psti和fsei雙酶切、連入中間載體pyl-mcs的相同位點(diǎn)，獲得中間載體pyl-loxp-nptii；用引物f-p-lox/r-fsei從pcambia3301(cambia公司)質(zhì)粒擴(kuò)增約1.6kb的bar表達(dá)盒，并在兩側(cè)加入psti-loxp位點(diǎn)序列和fsei位點(diǎn)，psti和fsei雙酶切后連入中間載體pyl-mcs的相同位點(diǎn)，獲得中間載體pyl-loxp-bar；

pv4啟動(dòng)cre基因的表達(dá)盒拼接：用引物f-pv4-loxp-hindiii/r-pv4從t-pv4載體上擴(kuò)增1kb左右pv4啟動(dòng)子，獲得引入loxp位點(diǎn)的pv4啟動(dòng)子片段a；參考cre酶基因序列(genbankno.dq340306)合成的1.3kbcre基因，用引物f-cre1/r-cre1擴(kuò)增，作為片段b；用引物f-tnos/r-tnos-fsei從質(zhì)粒pcambia1305(cambia公司)擴(kuò)增0.38kb的nos終止子tnos，作為片段c；上述每個(gè)片段一側(cè)，分別帶有20～25bp的同源序列，利用基于gibson克隆的原理(gibson,2011,enzymaticassemblyofoverlappingdnafragments.methodsenzymol.,498:349-361.)的等溫重組反應(yīng)后的irr-pcr(isothermalrecombinationreaction-basedpcr)方法(具有同源末端的多個(gè)小片段，混合后加入gibsonassemblymastermix(neb公司)進(jìn)行等溫重組反應(yīng)(50℃、30分鐘)，再以反應(yīng)產(chǎn)物作為模板直接進(jìn)行pcr擴(kuò)增，體外拼接成完整大片段(chenw,zengd,shenr,max,zhangq,chenl,liuy-g,zhuq.2016,rapidinvitrosplicingofcodingsequencesfromgenomicdnabyisothermalrecombinationreaction-basedpcr.biotechnology&biotechnologicalequipment,30:864-868.)，用引物f-pv4-loxp-hindiii/r-tnos-fsei直接拼接三個(gè)片段獲得了結(jié)構(gòu)為fsei-cre-loxp-hindiii的表達(dá)盒；把含花藥特異啟動(dòng)子pv4的cre基因的表達(dá)盒(fsei-cre-loxp-hindiii表達(dá)盒)直接酶切連接，插入fsei和hindiii酶切的中間載體pyl-loxp-hpt，獲得植物篩選標(biāo)記為hpt的cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf1(圖3a)。

s1.3.pyl-pv4mf2的構(gòu)建：把含花藥特異啟動(dòng)子pv4的cre基因的表達(dá)盒(fsei-cre-loxp-hindiii表達(dá)盒)直接酶切連接，插入fsei和hindiii酶切的中間載體pyl-loxp-nptii，獲得植物篩選標(biāo)記為nptii(卡拉霉素)的cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf2(圖3a)。

s1.4.pyl-pv4mf3的構(gòu)建：把含花藥特異啟動(dòng)子pv4的cre基因的表達(dá)盒(fsei-cre-loxp-hindiii表達(dá)盒)直接酶切連接，插入fsei和hindiii酶切的中間載體pyl-loxp-bar，獲得植物篩選標(biāo)記基因?yàn)閎ar(抗草甘膦)的cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf3(圖3a)。

s2.pyl-pv4mf4～6重組表達(dá)載體的構(gòu)建:

s2.1.pyl-pv4mf4的構(gòu)建：參考玉米u(yù)bi啟動(dòng)子序列(genbankno.jx947345)用引物f-ubi-hindiii/r-ubi-saci直接從抽提的玉米葉片dna中pcr擴(kuò)增獲得，ubi啟動(dòng)子兩端引物引入hindiii和saci位點(diǎn)，再用hindiii和saci雙酶切連入pyl-pv4mf1的相同位點(diǎn)，獲得中間載體pyl-pv4mf1-ubi；用引物f-tnos-mlui/r-tnos-pmei從質(zhì)粒pcambia1305(cambia公司)擴(kuò)增0.38kb的nos終止子tnos，引入mlui/pmei雙酶切位點(diǎn)，再用mlui/pmei雙酶切連入中間載體pyl-pv4mf1-ubi的相同位點(diǎn)，最終獲得植物篩選標(biāo)記為hpt，并具有pubi-mcs-tnos表達(dá)盒的cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf4載體(圖3b)。

s2.2.pyl-pv4mf5的構(gòu)建：用hindiii和pmei雙酶切pyl-pv4mf4載體獲得pubi-mcs-tnos表達(dá)盒，直接連入相同位點(diǎn)的pyl-pv4mf2載體，獲得植物篩選標(biāo)記為nptii，并具有pubi-mcs-tnos表達(dá)盒的cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf5(圖3b)。

s2.3.pyl-pv4mf5的構(gòu)建：用hindiii和pmei雙酶切pyl-pv4mf4載體獲得pubi-mcs-tnos表達(dá)盒，直接連入相同位點(diǎn)的pyl-pv4mf3載體，獲得植物篩選標(biāo)記為bar，并具有pubi-mcs-tnos表達(dá)盒的cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf6(圖3b)。

s3.pyl-pv4mf7～9重組表達(dá)載體的構(gòu)建：

s3.1.pyl-pv4mf7的構(gòu)建：用引物f-p35s-hindiii/r-p35s-saci從質(zhì)粒pcambia1305(cambia公司)直接擴(kuò)增獲得加hindiii和saci位點(diǎn)雙位點(diǎn)花椰菜病毒p35s啟動(dòng)子，再用hindiii和saci雙酶切連入pyl-pv4mf1的相同位點(diǎn)，獲得中間載體pyl-pv4mf1-35s；用引物f-tnos-mlui/r-tnos-pmei從質(zhì)粒pcambia1305(cambia公司)擴(kuò)增0.38kb的nos終止子tnos，引入mlui/pmei雙酶切位點(diǎn)，再用mlui/pmei雙酶切連入中間載體pyl-pv4mf1-35s的相同位點(diǎn)，最終獲得植物篩選標(biāo)記為hpt，并具有p35s-mcs-tnos表達(dá)盒的cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf7載體(圖3c)。

s3.2.pyl-pv4mf8的構(gòu)建：用hindiii和pmei雙酶切pyl-pv4mf7載體，獲得p35s-mcs-tnos表達(dá)盒，直接連入相同位點(diǎn)的pyl-pv4mf2，獲得植物篩選標(biāo)記為nptii，并具有p35s-mcs-tnos表達(dá)盒的cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf8(圖3c)。

s3.3.pyl-pv4mf9的構(gòu)建：用hindiii和pmei雙酶切pyl-pv4mf7載體，獲得p35s-mcs-tnos表達(dá)盒，直接連入pyl-pv4mf3的相同位點(diǎn)，獲得植物篩選標(biāo)記為bar，并具有p35s-mcs-tnos表達(dá)盒的cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf9(圖3c)。

實(shí)施例3

無(wú)篩選標(biāo)記(markerfree)轉(zhuǎn)基因植株的獲得與分析：

s1.含pv4的cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf1的水稻轉(zhuǎn)化與檢測(cè)

s1.1.水稻的遺傳轉(zhuǎn)化：把cre/loxp重組表達(dá)載體pyl-pv4mf1質(zhì)粒轉(zhuǎn)入農(nóng)桿菌eha105，得到轉(zhuǎn)化有pyl-pv4mf1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌，用于轉(zhuǎn)化水稻(日本晴)胚愈傷組織。水稻遺傳轉(zhuǎn)化方法按照nishimura等(2006)詳細(xì)報(bào)道的方法進(jìn)行(nishimura,etal.2006,aprotocolforagrobacterium-mediatedtransformationinrice.natprotoc.，1:2796-2802。下同)。將水稻未成熟種子或成熟種子，在25℃黑暗條件下誘導(dǎo)愈傷組織。用適量的pyl-pv4mf1質(zhì)粒的農(nóng)桿菌懸浮于加有100μmol/l乙酰丁香酮的侵染液培養(yǎng)基(aam培養(yǎng)基)(nishimura，etal.,2006)中，28℃震蕩培養(yǎng)(200rpm，0.5h)，用分光光度計(jì)調(diào)od550值為0.3～0.4，即可用于愈傷組織的浸染。挑選顏色新鮮呈淡黃色、生長(zhǎng)旺盛的顆粒狀胚性愈傷組織，和前述調(diào)節(jié)好od值的農(nóng)桿菌菌液混合，浸泡20min，吸干菌液后轉(zhuǎn)到共培養(yǎng)培養(yǎng)基(2n6-as培養(yǎng)基)(nishimura，etal.,2006)，暗培養(yǎng)3天后，轉(zhuǎn)移到含50mg/l潮霉素的篩選培養(yǎng)基(n6d-s培養(yǎng)基)(nishimura，etal.,2006)上，每2周繼一次代，繼代2次。抗性篩選后，把帶有綠點(diǎn)的抗性愈傷轉(zhuǎn)到有分化培養(yǎng)基(hiei，etal.,1994)上，分化出轉(zhuǎn)化苗，獲得t0轉(zhuǎn)化植株。

s1.2.轉(zhuǎn)化植株基因組pcr檢測(cè)：對(duì)獲得的t0代植株葉片，用sds法抽提基因組dna作為模板，用pcr擴(kuò)增方法，檢測(cè)外源hpt片段(約330bp)，引物為f-hpt/r-hpt所用擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec，58℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸5min。結(jié)果顯示，野生型(wt)對(duì)照都不能擴(kuò)出外源基因，轉(zhuǎn)基因植株都能擴(kuò)出上述hpt片段(圖4)。

s1.3.t0代轉(zhuǎn)化體cre基因的rt-pcr表達(dá)檢測(cè)：

利用trizol方法，抽提t(yī)0轉(zhuǎn)化體(#1)抗性愈傷組織、分化產(chǎn)生的根、莖、葉以及成熟花藥的總rna，用mmv逆轉(zhuǎn)錄試劑盒，oligdt引物反轉(zhuǎn)錄為cdna，用引物f-rt-cre/r-rt-cre、f-hpt/r-hpt和factin1/ractin1分別進(jìn)行cre基因(約290bp)、hpt(約330bp)和水稻內(nèi)源actin1基因(內(nèi)參，約250bp)的rt-pcr表達(dá)檢測(cè)。所用擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec，58℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共25個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸5min。結(jié)果顯示，pv4驅(qū)動(dòng)cre基因只在花藥里表達(dá)，在愈傷、根、莖和葉中均無(wú)表達(dá)(圖5)，說(shuō)明pv4確實(shí)是花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子。

s2.轉(zhuǎn)pyl-pv4mf1水稻t1代植株篩選標(biāo)記刪除鑒定

s2.1.pv4控制cre/loxp系統(tǒng)的標(biāo)記基因刪除原理：pv4是花藥特異啟動(dòng)子，在轉(zhuǎn)基因的t0轉(zhuǎn)化體中，只在花藥中驅(qū)動(dòng)cre基因表達(dá)，而在其他器官不表達(dá)。在花藥中，當(dāng)cre基因表達(dá)時(shí)，位于兩個(gè)同向loxp位點(diǎn)間的hpt基因(標(biāo)記基因)和cre基因同時(shí)被刪除，只留下一個(gè)loxp位點(diǎn)。由于標(biāo)記刪除發(fā)生在t0代植株的雄配子而不發(fā)生在雌配子，在t1代植株中，這種篩選標(biāo)記刪除是雜合的；但在下一代(t2)植株中，就能分離獲得大量的標(biāo)記完全刪除純合的轉(zhuǎn)基因植物(圖6)。

s2.2.pcr鑒定標(biāo)記刪除的轉(zhuǎn)基因植物：對(duì)獲得的t1代植株葉片，用sds法抽提基因組dna作為模板，用pcr擴(kuò)增方法，檢測(cè)標(biāo)記基因刪除情況。用引物p1、p2、p3同時(shí)進(jìn)行三引物pcr擴(kuò)增；其中p2位于hpt基因編碼區(qū)內(nèi)測(cè)，與p1擴(kuò)增產(chǎn)物約500bp；p1和p3位于兩個(gè)loxp位點(diǎn)外側(cè)，當(dāng)沒(méi)發(fā)生刪除時(shí)距離約5.2kb，在30sec延伸條件下是不能擴(kuò)增的，而只有當(dāng)發(fā)生刪除時(shí)，才能擴(kuò)增出刪除hpt/cre后產(chǎn)生的230bp的小片段。所用擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性4min；94℃變性30sec，60℃褪火30sec，72℃延伸30sec，共30個(gè)循環(huán)；最后72℃再延伸5min。結(jié)果顯示，t1代植株大多發(fā)生了預(yù)期的標(biāo)記刪除(圖7)。

s2.3.刪除小片段pcr產(chǎn)物測(cè)序鑒定：對(duì)p1/p3擴(kuò)增的刪除hpt/cre后產(chǎn)生的230bp的小片段pcr產(chǎn)物進(jìn)行直接測(cè)序，結(jié)果表明該片段與預(yù)期的片段序列完全一致(圖8)。

上述結(jié)果表明，pv4控制的cre/loxp重組表達(dá)載體在轉(zhuǎn)基因植物t1代中，就能按預(yù)期設(shè)計(jì)在花藥中實(shí)現(xiàn)標(biāo)記基因的刪除，在其下一代植株中，就能獲得標(biāo)記刪除純合的轉(zhuǎn)基因植物。

上述實(shí)施例為本發(fā)明較佳的實(shí)施方式，但本發(fā)明的實(shí)施方式并不受上述實(shí)施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實(shí)質(zhì)與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡(jiǎn)化，均應(yīng)為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。

sequencelisting

<110>華南農(nóng)業(yè)大學(xué)

<120>一種花藥特異表達(dá)啟動(dòng)子pv4及其應(yīng)用

<130>1

<160>31

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>1098

<212>dna

<213>水稻

<400>1

gttgcagtaggatagaggtggctcggtatgcatgtgagaagtgcgtgaaatgtaccgaat60

caatattccttttttgaagattttattgtttcattctttgccccgaggaggaaaaagaga120

gcagaaagtttcagaaaaaattgaaggttttcgatttgagtgtttcggtctgaatgaaaa180

ttttcaaaagcatttggaacttttctattgttttgaaagtttttgttatgctcagacact240

cctcctgccccagatcagttgggtatcatgagatacctcaagaacatgggcccagaatga300

agtaaactaattctgtaatgaatatatgaaaataatggtgacaaacaattcattacagga360

gaaaaggttgataaaactcatgacaagagttttggttcttatccattccatcagttgact420

gtcaatctttcatgaggacatattctagtttaggaatcctactagcacctattttcctag480

tcttgatagttttaggattagtctatttacaacaatttttgcagttccaatgtataatgg540

gggggggggtgattttgcaggtctgaacatcatttggaagaaaaggtaaaagtatgaatg600

gcgcatgcccctgctatatatagcaaatccacaaacaacccacttccccatccgcttacc660

acactaagtgcatgcactcacaaatttaccttttctttgccttaacccgttttgcgcgga720

tggccctttacttttcccctcttgtcctctctccggactctgggtcgtcgcttctctccc780

cacaaggattttccaaatttcattgccatcaagaacacacaggcttcaggtaagagggtc840

tatctgcatttgtgttcttttatttttcattcaatgacattttttatgttcctatgatcc900

ttttgtgttctcgggtgtaatttgttgccaactatatcataatgagcttttgttggtgtt960

tgggtgaccattgtgatgtttgaactatgatcatatcattcatctttttcttaaaaaaaa1020

aaacttgtttgcagttccagcatgatgttagcgtcgttttgagacaaaatcaggaaaggc1080

tctttcacaacatcaagc1098

<210>2

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>fq-v4

<400>2

cctgctcctgacattgatgttacc24

<210>3

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>rq-v4

<400>3

gctgttcctcagagttgagcta22

<210>4

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>factin1

<400>4

cagcacattccagcagatgt20

<210>5

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>ractin1

<400>5

accacaggtagcaataggta20

<210>6

<211>24

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f1

<400>6

gttgcagtaggatagaggtggctc24

<210>7

<211>26

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r1

<400>7

gcttgatgttgtgaaagagcctttcc26

<210>8

<211>39

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f1300

<400>8

aataaactgcagcggcgttaattcagtacattaaaaacg39

<210>9

<211>31

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r1300

<400>9

ccttcagtttaaactatcagtgtttgacagg31

<210>10

<211>79

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-p-lox

<400>10

aattaaaactgcagaataacttcgtatagcatacattatacgaagttattaattcggggg60

atctggattttagtactgg79

<210>11

<211>45

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-fsei

<400>11

aattaaaggccggccgcggtttgcgtattggctagagcagcttgc45

<210>12

<211>71

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-pv4-loxp-hindiii

<400>12

attaatgagctcaataacttcgtataatgtatgctatacgaagttatacgcgccgttgca60

gtaggatagag71

<210>13

<211>48

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-pv4

<400>13

gtacggtcagtaaattggacatgcttgatgttgtgaaagagcctttcc48

<210>14

<211>48

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-cre1

<400>14

ggaaaggctctttcacaacatcaagcatgtccaatttactgaccgtac48

<210>15

<211>44

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-cre1

<400>15

ccaaatgtttgaacgatcgggactaatcgccatcttccagcagg44

<210>16

<211>44

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-tnos

<400>16

cctgctggaagatggcgattagtcccgatcgttcaaacatttgg44

<210>17

<211>36

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-tnos-fsei

<400>17

aattaaaaggccggcccccgatctagtaacatagat36

<210>18

<211>39

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-ubi-hindiii

<400>18

aattaaaagctttcgtgcccctctctagagataatgagc39

<210>19

<211>39

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-ubi-saci

<400>19

aattaagagctcgcagaagtaacacctaacaacagggtg39

<210>20

<211>34

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-tnos-mlui

<400>20

aattaaacgcgttcccgatcgttcaaacatttgg34

<210>21

<211>34

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-tnos-pmei

<400>21

aattaagtttaaaccccgatctagtaacatagat34

<210>22

<211>36

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-p35s-hindiii

<400>22

aattaaaagctttcccgccttcagtttagcttcatg36

<210>23

<211>37

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-p35s-saci

<400>23

aattaagagctcgtcaagagtcccccgtgttctctcc37

<210>24

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-hpt

<400>24

cggtcattgactggagcgagg21

<210>25

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-hpt

<400>25

ctacacagccatcggtccagac22

<210>26

<211>20

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>f-rt-cre

<400>26

cctggaaaatgcttctgtcc20

<210>27

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>r-rt-cre

<400>27

cagcattgctgtcacttggtcg22

<210>28

<211>22

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p1

<400>28

cattactcgcatccattctcag22

<210>29

<211>21

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p2

<400>29

cgggactgtcgggcgtacaca21

<210>30

<211>23

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>p3

<400>30

gcttggattctgcgtttgtttcc23

<210>31

<211>104

<212>dna

<213>artificialsequence

<220>

<223>多克隆位點(diǎn)片段mcs-i

<400>31

aattaactgcagatccaggccggccataagctttgagctctaagcgcgcctatttaaata60

cctgcaggtttaattaagaacgcgttcagtttaaacttaaatta104