本發(fā)明涉及一種細(xì)菌dna的提取方法。
背景技術(shù)：
：植物內(nèi)生細(xì)菌是植物微生態(tài)系統(tǒng)的組成成分，具有促進(jìn)植物生長(zhǎng)和拮抗病原菌的作用。了解植物內(nèi)生細(xì)菌多樣性，對(duì)于探究不同寄主植物在不同生長(zhǎng)環(huán)境下的內(nèi)生細(xì)菌群落結(jié)構(gòu)差異和發(fā)現(xiàn)功能菌株等具有重要意義。近年來快速發(fā)展的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為研究植物內(nèi)生細(xì)菌的重要手段，這些技術(shù)應(yīng)用的前提是需要從土壤中提取出高質(zhì)量的植物內(nèi)生細(xì)菌dna，以滿足下游pcr、酶切和測(cè)序等操作的需求。現(xiàn)有對(duì)根部?jī)?nèi)生細(xì)菌dna的提取，前處理主要是利用naclo、酒精或無菌水清洗多次，然后就開始研磨，很容易使緊緊貼附在植物根部表面的微小土壤顆粒不能被徹底清洗，這樣提取過程中來自土壤顆粒dna也會(huì)被提取出來，造成根際細(xì)菌dna對(duì)植物本身根部?jī)?nèi)生細(xì)菌dna的污染。另外，現(xiàn)有提取方法在清洗完根部組織后一般采用手動(dòng)法提取和純化，效率低，提取時(shí)間大約在3小時(shí)左右。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明是要解決現(xiàn)有對(duì)根部?jī)?nèi)生細(xì)菌dna的提取方法容易造成根際細(xì)菌dna對(duì)植物本身根部?jī)?nèi)生細(xì)菌dna的污染，以及提取時(shí)間長(zhǎng)的問題，提供一種提取植物根部?jī)?nèi)生細(xì)菌dna的方法。本發(fā)明提取植物根部?jī)?nèi)生細(xì)菌dna的方法，包括以下步驟：一、將植物根部樣品放入無菌離心管，手動(dòng)顛倒離心管3～5次，以便使無菌水沖洗掉植物根部樣品表面殘留浮土，沖洗至植物體表面沒有浮土殘留；二、向裝有植物根部樣品的離心管中加入質(zhì)量濃度0.04％～0.06％的sds溶液，直至sds溶液沒過樣品，手動(dòng)顛倒離心管數(shù)次，棄去sds溶液，再用無菌水沖洗數(shù)次，直至離心管內(nèi)沒有sds溶液的泡沫留下；三、用體積濃度為70％～75％的乙醇溶液沖洗植物根部樣品2～3次，再用無菌水沖洗2～3次；四、然后將表面沖洗干凈的植物根部樣品轉(zhuǎn)移到滅菌研缽中，用滅菌剪刀將樣品剪碎，充分研磨植物根部樣品；五、使用fastdnaspinkitforsoil試劑盒提取植物根部樣品中的內(nèi)生細(xì)菌dna。進(jìn)一步的，步驟四中研磨植物根部樣品時(shí)還加入10mm磷酸鈉緩沖液，便于研磨，加入體積過多會(huì)稀釋所提取的dna濃度；進(jìn)一步的，步驟五中使用fastdnaspinkitforsoil試劑盒提取植物根部樣品中的內(nèi)生細(xì)菌dna的方法具體為：1)取研磨充分的植物根部樣品0.3-0.5克裝入fastdnaspinkitforsoil試劑盒中配套的2.0ml離心管，加入122μlmt緩沖液(試劑盒配套提供)和978μlsodiumphosphatebuffer(試劑盒配套提供)；2)將步驟1)中的離心管放到核酸快速提取震蕩儀，打碎植物根部樣品(5.5m/s,30s)；3)1,4000g離心30min，將上清液(800μl左右)轉(zhuǎn)移到2.0ml離心管，加入250μlpps(試劑盒配套提供)，渦旋震蕩20s；4)1,4000g離心10min，將上清液(1000μl左右)轉(zhuǎn)移到2.0ml離心管，加入250μlpps(試劑盒配套提供)，渦旋震蕩20s；5)1,4000g離心10min，將上清液(1200μl左右)轉(zhuǎn)移到15.0ml離心管，加入1mlbindingmatrix(試劑盒配套提供，使用前需要搖勻)，手動(dòng)顛倒離心管2min，將離心管靜止防置30min；6)吸取并丟棄上清液(1800μl左右)，盡量不要碰觸底部液面；7)用移液器吸取步驟6)中離心管底部剩余的液體，再小心釋放，目的是使底部剩余液體變成均勻的懸浮液，之后將懸浮液轉(zhuǎn)移到spintmfilter過濾柱中(試劑盒配套提供)；8)1,4000g離心1min，棄掉底部液體；9)向spintmfilter過濾柱中加入500μlsews-m，渦旋震蕩，目的使過濾柱中底部白色沉淀變成懸浮液；10)1,4000g離心1min，棄掉底部液體；11)重復(fù)步驟9)和10)；12)不加入任何試劑，將步驟11)中的過濾柱1,4000g離心2min，棄掉底部液體，目的是風(fēng)干過濾柱中底部白色沉淀，然后將底部離心管更換為新的2.0ml離心管；13)室溫靜止5min，然后向過濾柱中加入100μldes(試劑盒配套提供)，再次渦旋震蕩將白色沉淀變成懸浮液；14)1,4000g離心1min，底部澄清液體即為內(nèi)生細(xì)菌dna；15)用電泳儀檢測(cè)dna提取效果，在凝膠成像儀下進(jìn)行觀察，拍照，用微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的dna濃度，記錄，并于-20℃保存待用。本發(fā)明的有益效果：本發(fā)明使用表面活性劑sds預(yù)先處理植物根部樣品，sds有去污和分散的功能，使用sds清洗植物根部即不會(huì)對(duì)植物根部本身造成損傷，又可以增強(qiáng)清洗效果。另外，現(xiàn)有提取方法在清洗完根部組織后一般采用手動(dòng)法提取，本發(fā)明將原本應(yīng)用在提取土壤微生物dna試劑盒的方法借鑒到植物部?jī)?nèi)生細(xì)菌dna的提取，避免了以往單一的對(duì)內(nèi)生細(xì)菌的純手動(dòng)提取，縮短了提取過程，本方法提取過程所用的時(shí)間大約是40分鐘，簡(jiǎn)化了提取步驟，進(jìn)而減少了手動(dòng)的繁瑣過程對(duì)dna造成污染的機(jī)會(huì)，也省去了dna的純化步驟，提高了提取效率，省時(shí)省力。本發(fā)明方法提取的dna純度高，od260/od280在1.6到1.8之間。附圖說明圖1為植物內(nèi)生細(xì)菌總dna瓊脂糖電泳圖；圖2為植物內(nèi)生細(xì)菌dna的pcr擴(kuò)增效果圖；圖3為pcr產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳圖。具體實(shí)施方式本發(fā)明技術(shù)方案不局限于以下所列舉具體實(shí)施方式，還包括各具體實(shí)施方式間的任意組合。具體實(shí)施方式一：本實(shí)施方式提取植物根部?jī)?nèi)生細(xì)菌dna的方法，包括以下步驟：一、將植物根部樣品放入無菌離心管，手動(dòng)顛倒離心管3～5次，沖洗至植物體表面沒有浮土殘留；二、向裝有植物根部樣品的離心管中加入質(zhì)量濃度0.04％～0.06％的sds溶液，直至sds溶液沒過樣品，手動(dòng)顛倒離心管3～5次，棄去sds溶液，再用無菌水沖洗3～5次，直至離心管內(nèi)沒有sds溶液的泡沫留下；三、用體積濃度為70％～75％的乙醇溶液沖洗植物根部樣品2～3次，再用無菌水沖洗2～3次；四、然后將表面沖洗干凈的植物根部樣品轉(zhuǎn)移到滅菌研缽中，用滅菌剪刀將樣品剪碎，充分研磨植物根部樣品；五、然后使用fastdnaspinkitforsoil試劑盒提取植物根部樣品中的內(nèi)生細(xì)菌dna。具體實(shí)施方式二：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟三用體積濃度為71％～74％的乙醇溶液沖洗植物根部樣品。其它與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式三：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一不同的是：步驟三用體積濃度為72％～73％的乙醇溶液沖洗植物根部樣品。其它與具體實(shí)施方式一相同。具體實(shí)施方式四：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至三之一不同的是：步驟四向裝有植物根部樣品的離心管中加入質(zhì)量濃度00.05％的sds溶液。其它與具體實(shí)施方式一至三之一相同。具體實(shí)施方式五：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至四之一不同的是：步驟四中研磨植物根部樣品時(shí)還加入10mm磷酸鈉緩沖液，便于研磨，加入體積過多會(huì)稀釋所提取的dna濃度。其它與具體實(shí)施方式一至四之一相同。具體實(shí)施方式六：本實(shí)施方式與具體實(shí)施方式一至五之一不同的是：步驟五中使用fastdnaspinkitforsoil試劑盒提取植物根部樣品中的內(nèi)生細(xì)菌dna的方法具體為：1)取研磨充分的植物根部樣品0.3-0.5克裝入fastdnaspinkitforsoil試劑盒中配套的2.0ml離心管，加入122μlmt緩沖液和978μlsodiumphosphatebuffer；2)將步驟1)中的離心管放到核酸快速提取震蕩儀，打碎植物根部樣品；3)1,4000g離心30min，將上清液轉(zhuǎn)移到2.0ml離心管，加入250μlpps，渦旋震蕩20s；4)1,4000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到2.0ml離心管，加入250μlpps，渦旋震蕩20s；5)1,4000g離心10min，將上清液轉(zhuǎn)移到15.0ml離心管，加入1mlbindingmatrix，手動(dòng)顛倒離心管2min，將離心管靜止防置30min；6)吸取并丟棄上清液，盡量不要碰觸底部液面；7)用移液器吸取步驟6)中離心管底部剩余的液體，再小心釋放，目的是使底部剩余液體變成均勻的懸浮液，之后將懸浮液轉(zhuǎn)移到spintmfilter過濾柱中；8)1,4000g離心1min，棄掉底部液體；9)向spintmfilter過濾柱中加入500μlsews-m，渦旋震蕩，目的使過濾柱中底部白色沉淀變成懸浮液；10)1,4000g離心1min，棄掉底部液體；11)重復(fù)步驟9)和10)；12)不加入任何試劑，將步驟11)中的過濾柱1,4000g離心2min，棄掉底部液體，目的是風(fēng)干過濾柱中底部白色沉淀，然后將底部離心管更換為新的2.0ml離心管；13)室溫靜止5min，然后向過濾柱中加入100μldes，再次渦旋震蕩將白色沉淀變成懸浮液；14)1,4000g離心1min，底部澄清液體即為內(nèi)生細(xì)菌dna；15)用電泳儀檢測(cè)dna提取效果，在凝膠成像儀下進(jìn)行觀察，拍照，用微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的dna濃度，記錄，并于-20℃保存待用。其它與具體實(shí)施方式一至五之一相同。下面對(duì)本發(fā)明的實(shí)施例做詳細(xì)說明，以下實(shí)施例在以本發(fā)明技術(shù)方案為前提下進(jìn)行實(shí)施，給出了詳細(xì)的實(shí)施方案和具體的操作過程，但本發(fā)明的保護(hù)范圍不限于下述的實(shí)施例。實(shí)施例1：提取植物根部?jī)?nèi)生細(xì)菌dna的方法，包括以下步驟：1、將大豆根部樣品放入50ml無菌離心管，手動(dòng)顛倒離心管數(shù)次，以便使無菌水沖洗掉大豆根部樣品表面殘留浮土，可多次沖洗直至植物體表面沒有浮土殘留；2、向上述裝有大豆根部樣品的離心管中加入0.05％sds溶液，直至液體沒過樣品，手動(dòng)顛倒離心管數(shù)次，棄去sds溶液，用無菌水沖洗5次，直至離心管內(nèi)沒有sds溶液的泡沫留下；3、用70％酒精沖洗大豆根部樣品2次，再用無菌水沖洗2次；4、將上述表面沖洗干凈的大豆根部樣品轉(zhuǎn)移到滅菌研缽中，用滅菌剪刀將樣品剪碎；5、充分研磨大豆根部樣品，此過程中可加入少量體積的10mm磷酸鈉緩沖液，便于研磨，加入體積過多會(huì)稀釋所提取的dna濃度；6、取研磨充分的大豆根部樣品0.3-0.5克裝入fastdnaspinkitforsoil試劑盒中配套的2.0ml離心管，加入122μlmt緩沖液(試劑盒配套提供)和978μlsodiumphosphatebuffer(試劑盒配套提供)；7、將6步驟中的離心管放到核酸快速提取震蕩儀，打碎大豆根部樣品(5.5m/s,30s)；8、1,4000g離心30min；9、將上清液(800μl左右)轉(zhuǎn)移到2.0ml離心管，加入250μlpps(試劑盒配套提供)，渦旋震蕩20s；10、1,4000g離心10min；11、將上清液(1000μl左右)轉(zhuǎn)移到2.0ml離心管，加入250μlpps(試劑盒配套提供)，渦旋震蕩20s；12、1,4000g離心10min；13、將上清液(1200μl左右)轉(zhuǎn)移到15.0ml離心管，加入1mlbindingmatrix(試劑盒配套提供，使用前需要搖勻)，手動(dòng)顛倒離心管2min，將離心管靜止防置30min；14、吸取并丟棄上清液1800μl左右，盡量不要碰觸底部液面；15、用移液器吸取14步驟中離心管底部剩余的液體，再小心釋放，目的是使底部剩余液體變成均勻的懸浮液，之后將懸浮液轉(zhuǎn)移到spintmfilter過濾柱中(試劑盒配套提供)；16、1,4000g離心1min，棄掉底部液體；17、向spintmfilter過濾柱中加入500μlsews-m，渦旋震蕩，目的使過濾柱中底部白色沉淀變成懸浮液；18、1,4000g離心1min，棄掉底部液體；19、重復(fù)步驟17；20、重復(fù)步驟18；21、不加入任何試劑，將步驟20中的過濾柱1,4000g離心2min，棄掉底部液體，目的是風(fēng)干過濾柱中底部白色沉淀，然后將底部離心管更換為新的2.0ml離心管；22、室溫靜止5min；23、向過濾柱中加入100μldes(試劑盒配套提供)，再次渦旋震蕩將白色沉淀變成懸浮液；24、1,4000g離心1min，底部澄清液體即為內(nèi)生細(xì)菌dna；25、用電泳儀檢測(cè)dna提取效果，在凝膠成像儀下進(jìn)行觀察，拍照，用微量分光光度計(jì)測(cè)定提取的dna濃度，記錄，并于-20℃保存待用。本實(shí)施例方法提取的植物內(nèi)生細(xì)菌總dna瓊脂糖電泳圖如圖1所示，可以看出dna的純度較高(條帶的明亮程度越大代表所獲得的dna量越高)，提取效果較好。本方法提取的dna的od260/od280在1.6到1.8之間。巢式pcr擴(kuò)增根內(nèi)生細(xì)菌16srrna基因。利用引物(如表1)進(jìn)行pcr擴(kuò)增，反應(yīng)為：premix(5u·μl-1，extaq，takara)12.5μl，引物63fmi/1492ry各1μl(20pmol·μl-1)，lna-mit63/lna-mit1492各3.75μl(20pmol·μl-1)，lna-pla63/lna-pla1492各1.25μl(20pmol·μl-1)dna模板0.5μl，無菌水定容至25μl反應(yīng)體系，設(shè)未添加dna模板為陰性對(duì)照。擴(kuò)增條件為：94℃3min；94℃1min，70℃1min，54℃1min，72℃2min，30個(gè)循環(huán)；72℃10min。表1引物序列長(zhǎng)度lna-mit635’-gtcgaacgttgttttcggp-3’18lna-mit14925’-cttcaccccagtcgaagap-3’18lna-pla635’-tcggacgggaagtggtp-3’16lna-pla14925’-cttcactccagtcactagcp-3’1963f-mi5’-yrkgcytwayacatgcaagtc-3’211492r-y5’-ggytaccttgttacgactt-3’19植物內(nèi)生細(xì)菌dna的pcr擴(kuò)增效果如圖2所示，圖2中m表示dnamarker，d表示陰性對(duì)照，s表示植物內(nèi)生細(xì)菌dna的pcr擴(kuò)增片段。從pcr結(jié)果我們可以驗(yàn)證本提取方法確實(shí)能夠提取出來自植物內(nèi)生細(xì)菌的dna，pcr產(chǎn)物可用于測(cè)序或酶切等下游實(shí)驗(yàn)。將得到的內(nèi)生細(xì)菌dna的pcr產(chǎn)物進(jìn)行變性梯度凝膠電泳，如圖3所示。變性梯度凝膠電泳是pcr的下游實(shí)驗(yàn)，能獲得清晰的變性梯度凝膠電泳條帶圖譜能再次說明通過該提取方法獲得的pcr產(chǎn)物足以滿足后續(xù)實(shí)驗(yàn)的需要。因?yàn)楸景l(fā)明用0.05％sds溶液和預(yù)先處理了植物根部樣品，其中sds為表面活性劑，其作用是能使附著在植物根上的土壤顆粒和微生物從根表面脫離，然后又用75％酒精處理了根部樣品，酒精有殺菌的作用，這進(jìn)一步對(duì)根部表面進(jìn)行了除菌，經(jīng)過sds和酒精雙重處理后，又用無菌水對(duì)根部樣品進(jìn)行了多次清洗，可認(rèn)為根部表面的土壤顆粒和微生物已經(jīng)被清除掉了，所以再對(duì)這部分表面已經(jīng)被除菌的根進(jìn)行dna提取，即可認(rèn)為所獲得的為內(nèi)生細(xì)菌的dna。對(duì)根表面先除菌再進(jìn)行后續(xù)關(guān)于內(nèi)生細(xì)菌的研究也是目前國(guó)際上公認(rèn)的研究?jī)?nèi)生細(xì)菌的方法。本方法提取過程所用的時(shí)間大約是40分鐘，與現(xiàn)有的提取方法(3小時(shí))相比所用時(shí)間顯著降低。序列表<110>中國(guó)科學(xué)院東北地理與農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所<120>一種提取植物根部?jī)?nèi)生細(xì)菌dna的方法<160>6<210>1<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物lna-mit63<400>1gtcgaacgttgttttcgg18<210>2<211>18<212>dna<213>人工序列<220><223>引物lna-mit1492<400>2cttcaccccagtcgaaga18<210>3<211>16<212>dna<213>人工序列<220><223>引物lna-pla63<400>3tcggacgggaagtggt16<210>4<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物lna-pla1492<400>4cttcactccagtcactagc19<210>5<211>21<212>dna<213>人工序列<220><223>引物63f-mi<400>5yrkgcytwayacatgcaagtc21<210>6<211>19<212>dna<213>人工序列<220><223>引物1492r-y<400>6ggytaccttgttacgactt19當(dāng)前第1頁(yè)12