本發(fā)明屬于細(xì)胞培養(yǎng)領(lǐng)域，具體涉及將人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的方法及其所用培養(yǎng)基。
背景技術(shù)：
：：人源胚胎干細(xì)胞細(xì)胞系來(lái)源于原腸胚之前的人體胚胎，經(jīng)過(guò)數(shù)代的培養(yǎng)形成的細(xì)胞系具有體外無(wú)限增殖，自我更新且具有多功能干性等特點(diǎn)。胚胎干細(xì)胞能分化為體內(nèi)的三個(gè)胚層的細(xì)胞。胚胎干細(xì)胞體外定向分化的研究有助于了解胚胎發(fā)育的機(jī)制及為再生醫(yī)學(xué)的臨床研究提供方法。卵泡由卵母細(xì)胞及周圍的卵泡顆粒細(xì)胞(granulosacell)組成，二者之間相互聯(lián)系。卵泡的發(fā)育階段大致可分為原始卵泡、初級(jí)卵泡、腔前卵泡、有腔卵泡，最終有腔卵泡排出成熟的可受精的卵細(xì)胞。大部分的原始卵泡會(huì)處于休眠期，每一個(gè)生殖周期會(huì)激活一些原始卵泡形成初級(jí)卵泡，但一般只有一個(gè)卵泡能最終成熟并排卵，這個(gè)過(guò)程同時(shí)伴隨一部分原始卵泡的凋亡。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的是提供一種將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的成套培養(yǎng)基。本發(fā)明提供的成套培養(yǎng)基包括培養(yǎng)基1、培養(yǎng)基2和培養(yǎng)基3；所述培養(yǎng)基1、所述培養(yǎng)基2和所述培養(yǎng)基3均為哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基，所述培養(yǎng)基1含有骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bmp4)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白8a(bmp8a)，所述培養(yǎng)基2含有g(shù)df9:bmp15二聚體蛋白和表皮生長(zhǎng)因子(egf)，所述培養(yǎng)基3含有生長(zhǎng)分化因子9(gdf9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bmp15)；所述gdf9:bmp15二聚體蛋白是由gdf9蛋白和bmp15蛋白組成的二聚體蛋白。所述培養(yǎng)基1中的骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bmp4)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白8a(bmp8a)是單獨(dú)的形式。所述培養(yǎng)基3中的生長(zhǎng)分化因子9(gdf9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bmp15)也是單獨(dú)的形式。上述成套培養(yǎng)基中，所述成套培養(yǎng)基由成套使用的所述培養(yǎng)基1、所述培養(yǎng)基2、所述培養(yǎng)基3、培養(yǎng)基4和培養(yǎng)基5組成；所述培養(yǎng)基4是將滋養(yǎng)層細(xì)胞在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)后得到的培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基5是在所述培養(yǎng)基4中添加殺稻瘟菌素后得到的培養(yǎng)基。所述骨形態(tài)發(fā)生蛋白15的氨基酸序列為序列11；所述生長(zhǎng)分化因子9的氨基酸序列為序列12。上述成套培養(yǎng)基中，所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基是將基礎(chǔ)培養(yǎng)基、血清替代物、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子(fgf)、青霉素和鏈霉素混勻得到的液體培養(yǎng)基；所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基是將基礎(chǔ)培養(yǎng)基、胎牛血清、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、青霉素和鏈霉素混勻得到的液體培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基1是在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中添加所述bmp4和所述bmp8a后得到的液體培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基2是在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中添加所述gdf9:bmp15二聚體蛋白和所述egf后得到的液體培養(yǎng)基；所述培養(yǎng)基3是在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中添加所述gdf9和所述bmp15后得到的液體培養(yǎng)基。上述成套培養(yǎng)基中所述bmp4在所述培養(yǎng)基1中的濃度為150ng/ml；所述bmp8a在所述培養(yǎng)基1中的濃度為50ng/ml；所述gdf9:bmp15二聚體蛋白在所述培養(yǎng)基2中的濃度為0.35ng/ml；所述egf在所述培養(yǎng)基2中的濃度為10ng/ml；所述gdf9在所述培養(yǎng)基3中的濃度為50ng/ml；所述bmp15在所述培養(yǎng)基3中的濃度為25ng/ml；所述殺稻瘟菌素在所述培養(yǎng)基5中的濃度為2μg/ml；所述血清替代物在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)為20％；所述fgf在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度為8ng/ml；所述胎牛血清在所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的體積分?jǐn)?shù)為10％；所述l-谷氨酰胺在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的濃度均為1mm；所述甘氨酸在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的濃度均為7.5mg/l；所述l-丙氨酸在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的濃度均為8.9mg/l；所述l-天冬酰胺在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的濃度均為13.2mg/l；所述l-天冬氨酸在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的濃度均為13.3mg/l；所述l-谷氨酸在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的濃度均為14.7mg/l；所述l-脯氨酸在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的濃度均為11.5mg/l；所述l-絲氨酸在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的濃度均為10.5mg/l；所述青霉素在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的濃度均為100i.u；所述鏈霉素在所述胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基和所述哺乳動(dòng)物細(xì)胞分化培養(yǎng)基中的濃度均為100μg/ml。上述成套培養(yǎng)基中，所述gdf9:bmp15二聚體蛋白是將表達(dá)gdf9蛋白和bmp15蛋白的載體轉(zhuǎn)入細(xì)胞中表達(dá)得到的。所述表達(dá)gdf9蛋白和bmp15蛋白的載體具體為piggybac-gdf9-bmp15質(zhì)粒，所述piggybac-gdf9-bmp15質(zhì)粒是將序列3所示的dna片段(序列3第1-54位為信號(hào)肽序列，787-1218位為bmp15基因成熟肽編碼基因序列)插入piggybac載體，且將序列4所示的dna片段(序列4第1-72位為信號(hào)肽序列，943-1461位為gdf9基因成熟肽編碼基因序列)插入piggybac載體，且保持piggybac載體的其他序列不變得到的載體。所述細(xì)胞具體為293t細(xì)胞。所述gdf9:bmp15二聚體蛋白的具體制備方法如下：(1)將序列3所示的dna片段(序列3第1-54位為信號(hào)肽序列，787-1218位為bmp15基因成熟肽編碼基因序列)插入piggybac載體，且將序列4所示的dna片段(序列4第1-72位為信號(hào)肽序列，943-1461位為gdf9基因成熟肽編碼基因序列)插入piggybac載體，且保持piggybac載體的其他序列不變，得到piggybac-gdf9-bmp15質(zhì)粒，該質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)gdf9蛋白和bmp15蛋白；(2)將piggybac-gdf9-bmp15質(zhì)粒和聚醚酰亞胺共同轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞，轉(zhuǎn)染后收集上清液。用minipellicon超濾系統(tǒng)將上清液置換成蛋白濃縮液；所述蛋白濃縮液為將gdf9蛋白和bmp15蛋白溶解在緩沖液中得到的溶液；(3)向步驟(2)中的蛋白濃縮液中加入抗c-myc瓊脂糖耦聯(lián)抗體，孵育，離心，棄上清液，收集瓊脂糖耦聯(lián)抗體；所述抗c-myc瓊脂糖耦聯(lián)抗體是用緩沖液對(duì)瓊脂糖耦聯(lián)抗體進(jìn)行預(yù)處理得到的，所述預(yù)處理的具體方法如下：用緩沖液重懸瓊脂糖耦聯(lián)抗體，離心，棄上清液，洗3次，再用緩沖液進(jìn)行重懸，得到抗c-myc瓊脂糖耦聯(lián)抗體；(4)清洗2次步驟(3)獲得的瓊脂糖耦聯(lián)抗體，每次用緩沖液重懸，離心，棄上清液，再用緩沖液重懸；(5)向步驟(4)中重懸獲得的蛋白濃縮液中加入tev蛋白酶進(jìn)行消化處理，tev蛋白酶與蛋白濃縮液中的蛋白的質(zhì)量比為1：50-1：200，孵育，離心，轉(zhuǎn)移上清液至新管；(6)向步驟(5)中獲得的上清液中加入抗flag瓊脂糖耦聯(lián)抗體(預(yù)處理步驟同上)，孵育，離心，棄上清液，收集瓊脂糖耦聯(lián)抗體；(7)清洗2次步驟(6)獲得的瓊脂糖耦聯(lián)抗體，每次用1ml緩沖液重懸，離心，棄上清液，收集瓊脂糖耦聯(lián)抗體；然后用400μl3xflag-peptide重懸瓊脂糖耦聯(lián)抗體；孵育，離心，收集上清液，所述上清液中含有g(shù)df9:bmp15二聚體蛋白。上述成套培養(yǎng)基中，所述基礎(chǔ)培養(yǎng)基為knockouttmd-mem。本發(fā)明的第二個(gè)目的是提供將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的產(chǎn)品。本發(fā)明提供的將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的產(chǎn)品包括上述成套培養(yǎng)基、表達(dá)dazl的慢病毒和表達(dá)boule的慢病毒。所述表達(dá)dazl的慢病毒是將序列1所示的dazl基因插入到pentrtmdirectional載體的not1和asc1酶切位點(diǎn)間，然后用lr酶將序列1所示的dazl基因重組到p2k7病毒載體的attl1和attl2位點(diǎn)間，得到慢病毒載體dazl，然后與輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293ft進(jìn)行包裝，得到表達(dá)dazl的慢病毒顆粒。所述表達(dá)boule的慢病毒為將序列2所示的boule基因插入到pentrtmdirectional載體的not1和asc1酶切位點(diǎn)間，然后用lr酶將序列2所示的boule基因重組到p2k7病毒載體的attl1和attl2位點(diǎn)間，得到慢病毒載體boule，然后與輔助質(zhì)粒共同轉(zhuǎn)染包裝細(xì)胞293ft進(jìn)行包裝，得到表達(dá)boule的慢病毒顆粒。所述dazl蛋白的氨基酸序列為序列9；所述boule蛋白的氨基酸序列為序列10。本發(fā)明提供的將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的產(chǎn)品還包括胚胎干細(xì)胞。本發(fā)明的第三個(gè)目的是提供下述a1或a2的制備方法：a1、上述成套培養(yǎng)基的制備方法，包括如下步驟：分別制備所述培養(yǎng)基1、所述培養(yǎng)基2、所述培養(yǎng)基3、所述培養(yǎng)基4和所述培養(yǎng)基5，再將所述培養(yǎng)基1、所述培養(yǎng)基2、所述培養(yǎng)基3、所述培養(yǎng)基4和所述培養(yǎng)基5分別進(jìn)行獨(dú)立包裝，得到所述成套培養(yǎng)基；a2、上述產(chǎn)品的制備方法，包括如下步驟：將上述成套培養(yǎng)基、所述表達(dá)dazl的慢病毒和所述表達(dá)boule的慢病毒分別進(jìn)行單獨(dú)包裝，得到所述產(chǎn)品。本發(fā)明的第四個(gè)目的是提供將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的組合物。本發(fā)明提供的將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的組合物為如下b1)-b3)中任一種：b1)由上述gdf9:bmp15二聚體蛋白和egf組成；b2)由細(xì)胞因子gdf9和bmp15組成；b3)由表達(dá)dazl的慢病毒和表達(dá)boule的慢病毒組成。本發(fā)明的第五個(gè)目的是提供將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的成套試劑。本發(fā)明提供的將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的成套試劑為如下c1)-c4)中任一種：c1)由上述b1)所示的組合物、上述b2)所示的組合物與上述b3)所示的組合物組成；c2)由上述b1)所示的組合物與上述b2)所示的組合物組成；c3)由上述b2)所示的組合物與上述b3)所示的組合物組成；c4)由上述b1)所示的組合物與上述b3)所示的組合物組成。所述成套試劑中的所述組合物配套使用。本發(fā)明的第六個(gè)目的是提供下述1)-7)中任一種應(yīng)用：1)上述成套培養(yǎng)基在制備將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的產(chǎn)品中的應(yīng)用；2)上述成套培養(yǎng)基在將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡中的應(yīng)用；3)上述產(chǎn)品在將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡中的應(yīng)用；4)上述組合物在制備將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的產(chǎn)品中的應(yīng)用；5)上述組合物在將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡中的應(yīng)用；6)上述成套試劑在制備將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的產(chǎn)品中的應(yīng)用；7)上述成套試劑在將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡中的應(yīng)用。本發(fā)明的最后一個(gè)目的是提供將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的方法。本發(fā)明的方法包括如下步驟：(1)用上述培養(yǎng)基1培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞，得到第一次分化培養(yǎng)后細(xì)胞；(2)移除所述培養(yǎng)基1，在所述第一次分化培養(yǎng)后細(xì)胞中高表達(dá)dazl和boule外源基因，恢復(fù)培養(yǎng)，得到恢復(fù)培養(yǎng)后細(xì)胞；(3)在上述培養(yǎng)基2中培養(yǎng)所述恢復(fù)培養(yǎng)后細(xì)胞，得到第二次分化培養(yǎng)后細(xì)胞；(4)移除所述培養(yǎng)基2，在上述培養(yǎng)基3中繼續(xù)培養(yǎng)所述第二次分化培養(yǎng)后細(xì)胞，得到卵泡。上述方法中，所述將胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的具體步驟如下：(d1)用上述培養(yǎng)基1培養(yǎng)胚胎干細(xì)胞1小時(shí)，得到第一次分化培養(yǎng)后細(xì)胞；(d2)移除所述培養(yǎng)基1，用所述表達(dá)dazl的慢病毒和所述表達(dá)boule的慢病毒共同轉(zhuǎn)染所述第一次分化培養(yǎng)后細(xì)胞，得到轉(zhuǎn)染后細(xì)胞；所述轉(zhuǎn)染的時(shí)間為1天；(d3)在上述培養(yǎng)基4中恢復(fù)培養(yǎng)所述轉(zhuǎn)染后細(xì)胞1天，得到第一次恢復(fù)培養(yǎng)后細(xì)胞；(d4)在上述培養(yǎng)基5中培養(yǎng)所述第一次恢復(fù)培養(yǎng)后細(xì)胞3天，然后再在所述培養(yǎng)基4中恢復(fù)培養(yǎng)1天，得到第二次恢復(fù)培養(yǎng)后細(xì)胞；(d5)移除所述培養(yǎng)基4，在上述培養(yǎng)基2中培養(yǎng)所述第二次恢復(fù)培養(yǎng)后細(xì)胞1天，得到第二次分化培養(yǎng)后細(xì)胞；(d6)移除所述培養(yǎng)基2，在上述培養(yǎng)基3中繼續(xù)培養(yǎng)所述第二次分化培養(yǎng)后細(xì)胞，得到卵泡。本文中，胚胎干細(xì)胞可為離體的哺乳動(dòng)物胚胎干細(xì)胞，如離體的人胚胎干細(xì)胞，具體可為人胚胎干細(xì)胞h9(xx)細(xì)胞系或人胚胎干細(xì)胞hsf6細(xì)胞系(xx)。本發(fā)明通過(guò)在人胚胎干細(xì)胞中高表達(dá)dazl和boule外源基因，同時(shí)加入gdf9和bmp15等生長(zhǎng)因子進(jìn)行內(nèi)源刺激的方法，成功在體外獲得人卵泡。本發(fā)明首次建立了人源胚胎干細(xì)胞向卵泡的體外分化方法。不僅突破了體外研究人早期生殖細(xì)胞發(fā)育及卵泡發(fā)生等發(fā)育機(jī)理的瓶頸，而且還為研究早期受精卵發(fā)育機(jī)理提供材料，也為治療卵巢早衰等女性不孕癥提供新的思路。附圖說(shuō)明圖1為4n期細(xì)胞富集在高表達(dá)dazl和boule的細(xì)胞中。圖1a為dna含量分析?？招木€代表對(duì)照組，轉(zhuǎn)染egfp和mcherry熒光蛋白的質(zhì)粒(controlgroup，cg，linecurves)；實(shí)心線代表誘導(dǎo)組，轉(zhuǎn)染dazl-ires-egfp(同時(shí)表達(dá)dazl和egfp)和boule-ires-mcherry(同時(shí)表達(dá)boule和mcherry)質(zhì)粒(inducedgroup，ig，solidcurves)。其中，d5代表對(duì)照組第5天結(jié)果；d5’代表誘導(dǎo)組第5天結(jié)果；d6代表對(duì)照組第6天結(jié)果；d6’代表誘導(dǎo)組第6天結(jié)果；d7代表對(duì)照組第7天結(jié)果；d7’代表誘導(dǎo)組第7天結(jié)果；d8代表對(duì)照組第8天結(jié)果；d8’代表誘導(dǎo)組第8天結(jié)果。圖1b為流式細(xì)胞點(diǎn)狀圖(facsplots)。圖中分別顯示普通胚胎干細(xì)胞系(圖左)、對(duì)照組(圖中)和誘導(dǎo)組(圖右)中egfp單熒光、mcherry單熒光以及egfp和mcherry雙熒光細(xì)胞群，用以區(qū)分表達(dá)不同基因的細(xì)胞群。nc代表不表達(dá)任何熒光的對(duì)照組細(xì)胞；c代表只表達(dá)mcherry細(xì)胞；g代表只表達(dá)egfp細(xì)胞；c+g代表同時(shí)表達(dá)mcherry和egfp細(xì)胞；ni代表不表達(dá)任何熒光的誘導(dǎo)組細(xì)胞；b代表只表達(dá)boule-ires-mcherry(同時(shí)表達(dá)boule和mcherry)的細(xì)胞；d代表只表達(dá)dazl-ires-egfp(同時(shí)表達(dá)dazl和egfp)的細(xì)胞；b+d代表同時(shí)表達(dá)boule-ires-mcherry和dazl-ires-egfp的細(xì)胞。圖1c為第六天對(duì)照組(cg)和誘導(dǎo)組(ig)的dna含量分析結(jié)果。圖2為體外誘導(dǎo)中的人源胚胎干細(xì)胞減數(shù)分裂進(jìn)程的分析。圖2a為對(duì)照組(ctrl)和誘導(dǎo)組(induced)中prdm9和γh2ax的熒光染色結(jié)果。圖2b為對(duì)照組(ctrl)和誘導(dǎo)組(induced)中sycp3和γh2ax的熒光染色結(jié)果。圖2c為誘導(dǎo)組(induced)中prdm9和γh2ax的熒光染色高倍鏡結(jié)果。圖中標(biāo)尺(bar)：20μm。圖2d為誘導(dǎo)組(induced)中sycp3和γh2ax的熒光染色高倍鏡結(jié)果。圖中標(biāo)尺(bar)：20μm。圖2e為誘導(dǎo)組(induced)中sycp3和mlh1的熒光染色高倍鏡結(jié)果。圖中標(biāo)尺(bar)：10μm。圖2f為第六天到第九天體外誘導(dǎo)減數(shù)分裂中同時(shí)表達(dá)prdm9和γh2ax的陽(yáng)性細(xì)胞百分比圖。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析超過(guò)200個(gè)細(xì)胞核，誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差。圖2g為第七天細(xì)胞核的sycp3表達(dá)百分比堆砌條形圖。其中，n代表沒(méi)有sycp3表達(dá)；p代表點(diǎn)狀sycp3表達(dá)；e代表?xiàng)l狀sycp3表達(dá)，每組分析超過(guò)200個(gè)細(xì)胞核。圖3為人卵泡(humanfollicle-likecells)體外分化。圖3a為從未分化的胚胎干細(xì)胞(hesc)到誘導(dǎo)人卵泡(humanfollicle-likecells)的實(shí)驗(yàn)流程及簡(jiǎn)要步驟。圖3b為第十一天未誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞在相差顯微鏡下結(jié)果，形態(tài)學(xué)上與卵泡類似。圖3c為第十一天誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞在相差顯微鏡下結(jié)果，形態(tài)學(xué)上與卵泡類似。圖3d為第十一天四個(gè)不同的人卵泡(humanfollicle-likecells)在相差顯微鏡高倍鏡下結(jié)果，形態(tài)學(xué)上與卵泡類似。圖3e為第十一天誘導(dǎo)的人卵泡(humanfollicle-likecells)在體式鏡下結(jié)果，形態(tài)學(xué)上與卵泡類似。圖3f為第十一天收集人卵泡(humanfollicle-likecells)在體式鏡下結(jié)果。圖3g為zp2熒光染色結(jié)果。圖3h為nobox熒光染色結(jié)果。圖3i為amh熒光染色結(jié)果。p.c.代表相差顯微鏡下結(jié)果。圖3b、c、e和f的標(biāo)尺：500mm；圖3d的標(biāo)尺：100mm；圖3g、h和i的標(biāo)尺：50mm。圖4為人源類卵泡全基因組rna測(cè)序與反轉(zhuǎn)錄熒光定量pcr結(jié)果。圖4a為人源胚胎干細(xì)胞(es)、自發(fā)分化的人源胚胎干細(xì)胞(sde)和人源卵泡(flc，flc_1來(lái)源于hsf6細(xì)胞系，flc_2來(lái)源于h9細(xì)胞系)的全基因組rna測(cè)序結(jié)果的非監(jiān)督聚圖(unsupervisedhierarchicalclustering)。圖4b為人源胚胎干細(xì)胞(es)、自發(fā)分化的人源胚胎干細(xì)胞(sde)和人源卵泡(flc，flc_1來(lái)源于hsf6細(xì)胞系，flc_2來(lái)源于h9細(xì)胞系)的熱圖(heatmap)與基因本體(geneontology)分析。其中，左圖是熱圖結(jié)果；右圖是基因本體分析。圖4c為自發(fā)分化的人源胚胎干細(xì)胞(sde)和人源卵泡(flc)轉(zhuǎn)錄組散點(diǎn)圖。紅色的點(diǎn)指示出在人源生殖組織(如卵子和顆粒細(xì)胞)中特異表達(dá)的基因會(huì)在卵泡樣本中富集表達(dá)。圖4d為30個(gè)卵泡的反轉(zhuǎn)錄熒光定量pcr結(jié)果。圖5為人源類卵泡的小鼠腎包囊移植(mousekidneycapsules)結(jié)果。圖5a為獲得人源卵泡并做小鼠腎包囊移植的簡(jiǎn)要流程。紅色箭頭指示移植后的腎包囊組織。圖5b為移植點(diǎn)附近的腎臟蘇木精-伊紅(h&estaining)染色結(jié)果。圖5c為對(duì)照組(自發(fā)分化細(xì)胞的腎包囊移植)的蘇木精-伊紅(h&estaining)染色結(jié)果。圖5d為實(shí)驗(yàn)組(人源卵泡腎包囊移植)的蘇木精-伊紅(h&estaining)染色結(jié)果。箭頭指示初級(jí)卵泡結(jié)構(gòu)。圖5e為實(shí)驗(yàn)組的蘇木精-伊紅(h&estaining)染色高倍鏡結(jié)果。雙箭頭指示gv(germinalvesicle)期卵泡樣結(jié)構(gòu)。圖5f為nobox的熒光染色結(jié)果。圖5g為amh熒光染色結(jié)果。圖5b，c，d，e的標(biāo)尺：50μm；圖5f的標(biāo)尺：10μm；圖5g的標(biāo)尺：20μm。具體實(shí)施方式下述實(shí)施例中所使用的實(shí)驗(yàn)方法如無(wú)特殊說(shuō)明，均為常規(guī)方法。下述實(shí)施例中所用的材料、試劑等，如無(wú)特殊說(shuō)明，均可從商業(yè)途徑得到。下述實(shí)施例中的定量試驗(yàn)，均設(shè)置三次重復(fù)實(shí)驗(yàn)，結(jié)果取平均值。下述實(shí)施例中的人胚胎干細(xì)胞h9(xx)細(xì)胞系是wicell,inc.的產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的人胚胎干細(xì)胞hsf6(xx)細(xì)胞系在“kee,k,etal.humandazl,dazandboulegenesmodulateprimordialgerm-cellandhaploidgameteformation.nature462.7270(2009):222.”文獻(xiàn)中公開過(guò)，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的滋養(yǎng)層細(xì)胞的制備方法如下：取懷孕13.5天icr品系小鼠胚胎，在體式顯微鏡下去掉頭、尾巴、四肢及內(nèi)臟，用手術(shù)刀切碎留下的肉塊，用5mltrypletmexpress(貨號(hào)12605010)消化10min，然后鋪入用0.1％明膠(sigma，g6144)包被的175培養(yǎng)瓶中。用滋養(yǎng)層培養(yǎng)基培養(yǎng)(成分為dmem,10％fbs,甘氨酸7.5mg/l,l-丙氨酸8.9mg/l，l-天冬酰胺13.2mg/l,l-天冬氨酸13.3mg/l，l-谷氨酸酸14.7mg/l，l-脯氨酸11.5mg/l,l-絲氨酸10.5mg/l)，l-谷氨酰胺1mm，青霉素100i.u.，鏈霉素100μg/ml)，傳代三次之后，用5mltrypletmexpress(貨號(hào)12605010)消化5min，收集細(xì)胞，接著用滋養(yǎng)層培養(yǎng)基30ml重懸細(xì)胞，然后去清華大學(xué)輻射動(dòng)物中心使用70gray計(jì)量輻射細(xì)胞15min。最后分裝凍存，凍存液配方為10％dmso(sigam，貨號(hào)：d2650，dmso為溶劑)和90％fbs。下述實(shí)施例中的培養(yǎng)基及其配方如下：1、胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基是將knockouttmd-mem(公司為invitrogen，貨號(hào)為10829018)、血清替代物(knockoutserumreplacer)(knockouttmserumreplacement，貨號(hào)：10828028)、l-谷氨酰胺(l-glutamine)、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、人源fgfbasic(堿性成纖維細(xì)胞生長(zhǎng)因子，r&dsystems)、青霉素和鏈霉素(penicillin-streptomycinsolution)混勻得到的培養(yǎng)基，溶劑為knockouttmd-mem，其余為溶質(zhì)，其中各溶質(zhì)在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中的濃度如下：血清替代物20％(體積分?jǐn)?shù))，l-谷氨酰胺1mm，甘氨酸7.5mg/l，l-丙氨酸8.9mg/l，l-天冬酰胺13.2mg/l，l-天冬氨酸13.3mg/l，l-谷氨酸14.7mg/l，l-脯氨酸11.5mg/l，l-絲氨酸10.5mg/l，人源basicfgf8ng/ml，青霉素100i.u.，鏈霉素100μg/ml。2、分化培養(yǎng)基是將knockouttmd-mem、胎牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、青霉素和鏈霉素混勻得到的培養(yǎng)基，溶劑為knockouttmd-mem，其余為溶質(zhì)，其中各溶質(zhì)在分化培養(yǎng)基中的濃度為胎牛血清10％(體積分?jǐn)?shù))，l-谷氨酰胺1mm，甘氨酸7.5mg/l，l-丙氨酸8.9mg/l，l-天冬酰胺13.2mg/l，l-天冬氨酸13.3mg/l，l-谷氨酸14.7mg/l，l-脯氨酸11.5mg/l，l-絲氨酸10.5mg/l，青霉素100i.u.，鏈霉素100μg/ml。3、293ft細(xì)胞培養(yǎng)液是將dmem、胎牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、青霉素和鏈霉素、1mm丙酮酸鈉、10μg/ml遺傳霉素混勻得到的培養(yǎng)基，溶劑為dmem，其余為溶質(zhì)，其中各溶質(zhì)在分化培養(yǎng)基中的濃度為胎牛血清10％(體積分?jǐn)?shù))，l-谷氨酰胺1mm，甘氨酸7.5mg/l,l-丙氨酸8.9mg/l，l-天冬酰胺13.2mg/l，l-天冬氨酸13.3mg/l，l-谷氨酸14.7mg/l，l-脯氨酸11.5mg/l，l-絲氨酸10.5mg/l(是在293ft培養(yǎng)基中的終濃度)，青霉素100i.u.，鏈霉素100μg/ml。4、無(wú)抗生素和遺傳霉素的293ft細(xì)胞培養(yǎng)液是將dmem、胎牛血清(fbs)、l-谷氨酰胺、甘氨酸、l-丙氨酸、l-天冬酰胺、l-天冬氨酸、l-谷氨酸、l-脯氨酸、l-絲氨酸、丙酮酸鈉混勻得到的培養(yǎng)基，溶劑為dmem，其余為溶質(zhì)，其中各溶質(zhì)在分化培養(yǎng)基中的濃度為胎牛血清10％(體積分?jǐn)?shù))，l-谷氨酰胺1mm，甘氨酸7.5mg/l,l-丙氨酸8.9mg/l，l-天冬酰胺13.2mg/l，l-天冬氨酸13.3mg/l，l-谷氨酸14.7mg/l，l-脯氨酸11.5mg/l，l-絲氨酸10.5mg/l，丙酮酸鈉1mm。下述實(shí)施例中的如下細(xì)胞因子：骨形態(tài)發(fā)生蛋白4(bmp4)、骨形態(tài)發(fā)生蛋白8a(bmp8a)、人表皮生長(zhǎng)因子(egf)、生長(zhǎng)分化因子9(gdf9)和骨形態(tài)發(fā)生蛋白15(bmp15)均是r&dsystems的產(chǎn)品。下述實(shí)施例中的基質(zhì)膠(matrigel)是corning公司的產(chǎn)品，貨號(hào)為356234。下述實(shí)施例中的p2k7病毒載體在文獻(xiàn)“suter,d.m.etal.rapidgenerationofstabletransgenicembryonicstemcelllinesusingmodularlentivectors.stemcells24,615–623，2006”中公開過(guò)，公眾可從申請(qǐng)人處獲得，該生物材料只為重復(fù)本發(fā)明的相關(guān)實(shí)驗(yàn)所用，不可作為其它用途使用。下述實(shí)施例中的免疫熒光檢測(cè)中所使用的抗體及貨號(hào)如表1所示。表1、免疫熒光檢測(cè)中所使用的抗體及貨號(hào)實(shí)施例1、人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)卵泡的方法一、人源胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)及傳代將未分化的人源胚胎干細(xì)胞h9(xx)傳代到含有滋養(yǎng)層細(xì)胞的六孔板中，每個(gè)孔中加入3ml胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基，在37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。每天換液，直到細(xì)胞克隆長(zhǎng)到合適大小時(shí)繼續(xù)傳代。二、人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)卵泡1、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基的制備(1)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1是將分化培養(yǎng)基、bmp4和bmp8a混勻得到的培養(yǎng)基。其中，bmp4在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1中的濃度為150ng/ml，bmp8a在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1中的濃度為50ng/ml。(2)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基2誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基2是將分化培養(yǎng)基、gdf9:bmp15二聚體蛋白和人源egf混勻得到的培養(yǎng)基。其中，gdf9:bmp15二聚體蛋白在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基2中的濃度為0.35ng/ml，人源egf在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基2中的濃度為10ng/ml。(3)誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基3誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基3是將分化培養(yǎng)基、gdf9和bmp15混勻得到的培養(yǎng)基。其中，gdf9在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基3中的濃度為50ng/ml，bmp15在誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基3中的濃度為25ng/ml。(4)預(yù)處理胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基1預(yù)處理胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基是將滋養(yǎng)層細(xì)胞在胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基中培養(yǎng)24小時(shí)后，去除滋養(yǎng)層細(xì)胞，得到的培養(yǎng)基。(5)預(yù)處理胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基2預(yù)處理胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基2是將殺稻瘟菌素(blasticidin)(invitrogen，貨號(hào)為r21001)混勻得到的培養(yǎng)基。其中，殺稻瘟菌素在預(yù)處理胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基2中的濃度為2μg/ml。2、表達(dá)dazl和boule慢病毒的制備(1)慢病毒載體的構(gòu)建將序列1所示的dazl基因插入到pentrtmdirectional載體(公司為invitrogen，貨號(hào)為k2400-20)的not1和asc1酶切位點(diǎn)間，然后用lr酶(cat.no.11791-020)將序列1所示的dazl基因重組到p2k7病毒載體(文獻(xiàn)“suter,d.m.etal.rapidgenerationofstabletransgenicembryonicstemcelllinesusingmodularlentivectors.stemcells24,615–623，2006”中公開過(guò)，公眾可從清華大學(xué)獲得)的attl1(caactttgtacaaaaaagcag)和attl2(cagctttcttgtacaaagttg)位點(diǎn)間，得到慢病毒載體dazl。慢病毒載體dazl表達(dá)dazl蛋白。dazl蛋白的氨基酸序列為序列9。將序列2所示的boule基因插入到pentrtmdirectional載體的not1和asc1酶切位點(diǎn)間，然后用lr酶(cat.no.11791-020)將序列2所示的boule基因重組到p2k7病毒載體的attl1(caactttgtacaaaaaagcag)和attl2(cagctttcttgtacaaagttg)位點(diǎn)間，得到慢病毒載體boule。慢病毒載體boule表達(dá)boule蛋白。boule蛋白的氨基酸序列為序列10。(2)慢病毒載體的包裝使用293ft細(xì)胞(invitrogen，貨號(hào)為r70007)分別對(duì)步驟(1)中構(gòu)建的慢病毒載體進(jìn)行包裝，分別得到表達(dá)dazl的慢病毒的病毒液和表達(dá)boule的慢病毒的病毒液。具體步驟如下：在包裝前一天或兩天傳代293ft細(xì)胞，然后將該細(xì)胞傳入鋪有明膠包被的t175細(xì)胞培養(yǎng)瓶，加入293ft細(xì)胞培養(yǎng)液。待細(xì)胞生長(zhǎng)至密度為80-90％時(shí)，將15ml的轉(zhuǎn)染混合液加入至已經(jīng)吸走培養(yǎng)液的t175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于細(xì)胞培養(yǎng)箱中靜置6小時(shí)。然后吸走轉(zhuǎn)染混合液，加入無(wú)抗生素和遺傳霉素的293ft細(xì)胞培養(yǎng)液25-30ml。于細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)3天。最后將t175細(xì)胞培養(yǎng)瓶中的培養(yǎng)液轉(zhuǎn)移到50ml離心管，2000rpm離心5分鐘，使細(xì)胞碎片沉在底部，保留上清液并使用0.45μm規(guī)格的濾膜過(guò)濾病毒，得到病毒液。之后分裝入細(xì)胞凍存管，-80℃保存。所述轉(zhuǎn)染混合液的制備方法如下：將15ml的減血清培養(yǎng)基(貨號(hào)為31985070，購(gòu)買于thermofish公司)分為a液和b液兩部分，其中，a液10ml，b液5ml。向a液中加入10μg的無(wú)內(nèi)毒素病毒載體質(zhì)粒(慢病毒載體)、10μg的vsvg質(zhì)粒和15μg的δ8.9質(zhì)粒(vsvg質(zhì)粒和δ8.9質(zhì)粒均在文獻(xiàn)“suter,d.m.etal.rapidgenerationofstabletransgenicembryonicstemcelllinesusingmodularlentivectors.stemcells24,615–623，2006”中公開過(guò)，公眾可從清華大學(xué)獲得)，得到混合a液；b液中加入120μl的lipofectamine2000(invitrogen，貨號(hào)為11668019)，得到混合b液。然后將混合a液和混合b液分別溫柔混勻，室溫靜置5分鐘。再將混合a液與混合b液溫柔混勻，室溫靜置20分鐘，得到15ml的轉(zhuǎn)染混合液。3、gdf9:bmp15二聚體蛋白的制備(1)將序列3所示的dna片段(序列3第1-54位為信號(hào)肽序列，787-1218位為成熟bmp15基因序列)用無(wú)縫克隆試劑盒(clonesmaster公司，貨號(hào)為c5891-50)并按照試劑盒中的說(shuō)明書插入piggybac載體(piggybac載體在文獻(xiàn)“guo,jianying,etal.aninduciblecrispr-onsystemforcontrollablegeneactivationinhumanpluripotentstemcells.protein&cell(2017):1-15.”中公開過(guò)，公眾可從清華大學(xué)獲得)，且將序列4所示的dna片段(序列4第1-72位為信號(hào)肽序列，943-1461位為成熟gdf9基因序列)用無(wú)縫克隆試劑盒插入piggybac載體，且保持piggybac載體的其他序列不變，得到piggybac-gdf9-bmp15質(zhì)粒，該質(zhì)粒同時(shí)表達(dá)gdf9蛋白和bmp15蛋白。bmp15蛋白的氨基酸序列為序列11；gdf9蛋白的氨基酸序列為序列12。(2)將1mg的piggybac-gdf9-bmp15質(zhì)粒和4ml濃度為1mg/ml的聚醚酰亞胺溶液(polyetherimide，pei，貨號(hào)23966-2，polyscience公司)共同轉(zhuǎn)染1l密度為(1.5-2)×106的293t懸浮細(xì)胞中，轉(zhuǎn)染5天后收集1l上清液。用minipellicon超濾系統(tǒng)將1l上清液置換成6-9ml蛋白濃縮液(蛋白濃縮液為將gdf9蛋白和bmp15蛋白溶解在緩沖液中得到的溶液，緩沖液配方為10nmhepes，150mmnacl，ph7.4)。(3)向步驟(2)中的蛋白濃縮液中加入250ul抗c-myc瓊脂糖耦聯(lián)抗體(antic-mycbeads)溶液，4℃孵育過(guò)夜，然后2000g離心3min，棄上清液，收集瓊脂糖耦聯(lián)抗體?？筩-myc瓊脂糖耦聯(lián)抗體溶液是用緩沖液對(duì)瓊脂糖耦聯(lián)抗體進(jìn)行預(yù)處理得到的。預(yù)處理的具體方法如下：用1ml緩沖液重懸300μl的瓊脂糖耦聯(lián)抗體(abmart，m200125)，然后2000g離心3min，棄上清液，洗3次，再用400μl緩沖液進(jìn)行重懸，得到抗c-myc瓊脂糖耦聯(lián)抗體溶液。(4)清洗2次步驟(3)獲得的瓊脂糖耦聯(lián)抗體，每次用1ml緩沖液重懸，然后2000g離心3min，棄上清液，再用400μl緩沖液重懸。(5)向步驟(4)中重懸獲得的蛋白濃縮液中加入tev蛋白酶(sigma，貨號(hào)為t4455-1mg)進(jìn)行消化處理，tev蛋白酶與蛋白濃縮液中蛋白的質(zhì)量比(bca測(cè)蛋白濃度試劑盒，貨號(hào)：23225，piercetm)為1：50-1：200，4℃孵育16小時(shí)。然后2000g離心3min，轉(zhuǎn)移上清液至新管。(6)向步驟(5)中獲得的400ul上清液中加入150ul抗flag瓊脂糖耦聯(lián)抗體(abmart，m20008，預(yù)處理步驟同上)，4℃孵育5h30min。然后2000g離心3min，棄上清液，收集瓊脂糖耦聯(lián)抗體。(7)清洗2次步驟(6)獲得的瓊脂糖耦聯(lián)抗體，每次用1ml緩沖液重懸，2000g離心3min，棄上清液，收集瓊脂糖耦聯(lián)抗體。然后用400μl3xflag-peptide(sigma,400ug/ml)重懸瓊脂糖耦聯(lián)抗體。4℃孵育45min，2000g離心3min，轉(zhuǎn)移上清液(含有g(shù)df9:bmp15二聚體蛋白)至新管，調(diào)整濃度為0.35μg/ml。4、人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)卵泡的方法(1)將步驟一中大約為5×104個(gè)未分化的胚胎干細(xì)胞傳代到基質(zhì)膠(matrigel)(基質(zhì)膠與knockouttmd-mem培養(yǎng)基的體積比為1:100)包被的六孔板中(覆蓋面積約占一個(gè)孔的50％)，得到含有胚胎干細(xì)胞的六孔板。(2)向步驟(1)中的含有胚胎干細(xì)胞的六孔板中加入2ml誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1，在37℃，5％co2條件下培養(yǎng)1小時(shí)，得到第一次分化培養(yǎng)后細(xì)胞。(3)吸走誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1，將表達(dá)dazl的慢病毒的病毒液和表達(dá)boule的慢病毒的病毒液各0.5ml共同轉(zhuǎn)染步驟(2)獲得的第一次分化培養(yǎng)后細(xì)胞，在37℃，5％co2條件下處理1天。(4)吸走病毒液，向六孔板中加入2ml預(yù)處理胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基1，恢復(fù)培養(yǎng)1天。(5)吸走預(yù)處理胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基1，向六孔板中加入2ml預(yù)處理胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基2，培養(yǎng)3天，然后在預(yù)處理胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基1中恢復(fù)培養(yǎng)1天。(6)從加入病毒液起第七天時(shí)，吸走預(yù)處理胚胎干細(xì)胞培養(yǎng)基1，向六孔板中加入2ml誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基2培養(yǎng)1天。(7)吸去誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基2，向六孔板中加入3ml誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基3繼續(xù)培養(yǎng)，每三天換液，在相差顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)，當(dāng)觀察到顯微鏡下出現(xiàn)如下描述的細(xì)胞群：中間一個(gè)可見(jiàn)的卵母細(xì)胞及周圍有大量顆粒細(xì)胞圍繞的三維結(jié)構(gòu)，即獲得卵泡。實(shí)施例2、驗(yàn)證卵泡的成功分化一、dna含量分析證明體外誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂1、對(duì)照組質(zhì)粒的制備(1)egfp/mcherry質(zhì)粒的制備按照實(shí)施例1步驟二的2中的慢病毒載體的構(gòu)建方法，將序列1所示的dazl基因替換為序列5所示的egfp基因，構(gòu)建得到表達(dá)egfp的慢病毒載體egfp；按照實(shí)施例1步驟二的2中的慢病毒載體的構(gòu)建方法，將序列1所示的dazl基因替換為序列6所示的mcherry基因，構(gòu)建得到表達(dá)mcherry的慢病毒載體mcherry。2、誘導(dǎo)組質(zhì)粒的制備(1)dazl-ires-egfp質(zhì)粒的制備按照實(shí)施例1步驟二的2中的慢病毒載體的構(gòu)建方法，將序列1所示的dazl基因替換為序列7所示的dazl-ires-egfp基因，構(gòu)建得到同時(shí)表達(dá)dazl和egfp的慢病毒載體dazl-ires-egfp；按照實(shí)施例1步驟二的2中的慢病毒載體的構(gòu)建方法，將序列1所示的dazl基因替換為序列8所示的boule-ires-mchery，構(gòu)建得到同時(shí)表達(dá)boule和mchery的慢病毒載體boule-ires-mchery。3、人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)卵泡按照實(shí)施例1步驟二的2中的慢病毒載體的包裝方法，分別獲得表達(dá)egfp的慢病毒的病毒液、表達(dá)mchery的慢病毒的病毒液、表達(dá)dazl和egfp的慢病毒的病毒液、表達(dá)boule和mchery的慢病毒的病毒液。(1)將實(shí)施例1步驟二的4(3)中的表達(dá)dazl的慢病毒的病毒液和表達(dá)boule的慢病毒的病毒液替換為表達(dá)egfp的慢病毒的病毒液，并按照實(shí)施例1中將人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的方法，對(duì)人源胚胎干細(xì)胞h9細(xì)胞系進(jìn)行體外誘導(dǎo)，得到只表達(dá)egfp的細(xì)胞。(2)將實(shí)施例1步驟二的4(3)中的表達(dá)dazl的慢病毒的病毒液和表達(dá)boule的慢病毒的病毒液替換為表達(dá)mcherry的慢病毒的病毒液，并按照實(shí)施例1中將人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的方法，對(duì)人源胚胎干細(xì)胞h9細(xì)胞系進(jìn)行體外誘導(dǎo)，得到只表達(dá)mcherry的細(xì)胞。(3)將實(shí)施例1步驟二的4(3)中的表達(dá)dazl的慢病毒的病毒液和表達(dá)boule的慢病毒的病毒液分別替換為表達(dá)egfp的慢病毒的病毒液和表達(dá)mcherry的慢病毒的病毒液，并按照實(shí)施例1中將人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的方法，對(duì)人源胚胎干細(xì)胞h9細(xì)胞系進(jìn)行體外誘導(dǎo)，得到同時(shí)表達(dá)mcherry和egfp的細(xì)胞。(4)將實(shí)施例1步驟二的4(3)中的表達(dá)dazl的慢病毒的病毒液和表達(dá)boule的慢病毒的病毒液替換為表達(dá)dazl和egfp的慢病毒的病毒液，并按照實(shí)施例1中將人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的方法，對(duì)人源胚胎干細(xì)胞h9細(xì)胞系進(jìn)行體外誘導(dǎo)，得到同時(shí)表達(dá)dazl和egfp的細(xì)胞。(5)將實(shí)施例1步驟二的4(3)中的表達(dá)dazl的慢病毒的病毒液和表達(dá)boule的慢病毒的病毒液替換為表達(dá)boule和mcherry的慢病毒的病毒液，并按照實(shí)施例1中將人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的方法，對(duì)人源胚胎干細(xì)胞h9細(xì)胞系進(jìn)行體外誘導(dǎo)，得到同時(shí)表達(dá)boule和mcherry的細(xì)胞。(6)將實(shí)施例1步驟二的4(3)中的表達(dá)dazl的慢病毒的病毒液和表達(dá)boule的慢病毒的病毒液分別替換為表達(dá)dazl和egfp的慢病毒的病毒液、表達(dá)boule和mchery的慢病毒的病毒液，并按照實(shí)施例1中將人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的方法，對(duì)人源胚胎干細(xì)胞h9細(xì)胞系進(jìn)行體外誘導(dǎo)，得到同時(shí)表達(dá)dazl、boule、mcherry和egfp的細(xì)胞。4、dna含量分析分別取自加入病毒液時(shí)起第5、6、7、8天后誘導(dǎo)得到的細(xì)胞，并對(duì)自加入病毒液時(shí)起第5、6、7、8天后誘導(dǎo)得到的細(xì)胞的dna含量進(jìn)行分析。dna含量分析方法參考hoechst33342說(shuō)明書(thermofish公司，貨號(hào)為62249)中的方法。每組實(shí)驗(yàn)分析超過(guò)500,000個(gè)細(xì)胞，均有3次生物學(xué)重復(fù)。結(jié)果如圖1a和圖1c所示。其中，空心線代表對(duì)照組(只轉(zhuǎn)染egfp和mcherry熒光蛋白的質(zhì)粒)；實(shí)心線代表誘導(dǎo)組(轉(zhuǎn)染dazl-ires-egfp和boule-ires-mcherry質(zhì)粒；d5：對(duì)照組第5天結(jié)果；d5’：誘導(dǎo)組第5天結(jié)果；d6：對(duì)照組第6天結(jié)果；d6’：誘導(dǎo)組第6天結(jié)果；d7：對(duì)照組第7天結(jié)果；d7’：誘導(dǎo)組第7天結(jié)果；d8：對(duì)照組第8天結(jié)果；d8’：誘導(dǎo)組第8天結(jié)果。由于細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂會(huì)有dna復(fù)制過(guò)程,細(xì)胞dna含量會(huì)翻倍，由原來(lái)的2n變?yōu)?n，圖中熒光強(qiáng)度與dna含量成正比，2n代表細(xì)胞處于未開始dna復(fù)制時(shí)期，s代表dna開始復(fù)制但沒(méi)有完成復(fù)制的時(shí)期，4n代表細(xì)胞完成dna復(fù)制準(zhǔn)備進(jìn)入減數(shù)分裂。結(jié)果表明：誘導(dǎo)組中，從第五天(d5)4n細(xì)胞比例上升，第6天最大，到第八天(d8)下降到與對(duì)照組持平，說(shuō)明誘導(dǎo)組出現(xiàn)細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂前dna復(fù)制的動(dòng)態(tài)過(guò)程。第六天對(duì)照組(單獨(dú)轉(zhuǎn)染egfp或mcherry及一起轉(zhuǎn)染egfp和mcherry熒光蛋白的質(zhì)粒)(cg)和誘導(dǎo)組(ig)的dna含量分析結(jié)果表明：同時(shí)高表達(dá)dazl和boule的細(xì)胞群中處于s期和4n期細(xì)胞是最多的，說(shuō)明dazl和boule同時(shí)表達(dá)能促進(jìn)細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂前期的dna復(fù)制過(guò)程。5、流式細(xì)胞分析采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)加入自加入病毒液時(shí)起第6天后誘導(dǎo)得到的細(xì)胞。流式細(xì)胞點(diǎn)狀圖(facsplots)如圖1b所示。圖中從左至右分別顯示胚胎干細(xì)胞h9細(xì)胞系、對(duì)照組(cg，只轉(zhuǎn)染egfp和mcherry熒光蛋白的質(zhì)粒)和誘導(dǎo)組(ig)中egfp單熒光、mcherry單熒光以及egfp和mcherry雙熒光細(xì)胞群，用以區(qū)分表達(dá)不同基因的細(xì)胞群。其中，nc:不表達(dá)任何熒光的對(duì)照組細(xì)胞；c:只表達(dá)mcherry細(xì)胞；g:只表達(dá)egfp細(xì)胞；c+g:同時(shí)表達(dá)mcherry和egfp細(xì)胞；ni:不表達(dá)任何熒光的實(shí)驗(yàn)組細(xì)胞；b:只表達(dá)boule-ires-mcherry(同時(shí)表達(dá)boule和mcherry)的細(xì)胞；d:只表達(dá)dazl-ires-egfp(同時(shí)表達(dá)dazl和egfp)的細(xì)胞；b+d:同時(shí)表達(dá)boule-ires-mcherry和dazl-ires-egfp的細(xì)胞。從圖中可以看出：?jiǎn)为?dú)表達(dá)egfp，單獨(dú)表達(dá)mcherry和同時(shí)表達(dá)egfp及mcherry的細(xì)胞可以清楚的被流式細(xì)胞儀分群，結(jié)合圖1c說(shuō)明了同時(shí)表達(dá)dazl-ires-egfp及boule-ires-mcherry的細(xì)胞具有最多比例的細(xì)胞處在s及4n期。二、蛋白染色分析證明體外誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂1、供試細(xì)胞的制備(1)誘導(dǎo)組細(xì)胞實(shí)施例1中的方法誘導(dǎo)得到的卵泡。(2)對(duì)照組細(xì)胞將人源胚胎干細(xì)胞h9細(xì)胞系按照實(shí)施例1步驟二的4中的方法進(jìn)行誘導(dǎo)培養(yǎng)，培養(yǎng)中，將誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基1、誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基2和誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基3均替換為分化培養(yǎng)基，且將步驟(3)中的表達(dá)dazl的慢病毒的病毒液和表達(dá)boule的慢病毒的病毒液替換為p2k7病毒載體，且其他步驟不變，得到對(duì)照組細(xì)胞。2、免疫熒光染色借助減數(shù)分裂鋪展技術(shù)(meioticspread)分別對(duì)誘導(dǎo)組和對(duì)照組細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞鋪展，并進(jìn)行免疫熒光染色(prdm9和γh2ax的熒光染色、sycp3和γh2ax熒光染色、sycp3和mlh1熒光染色)，每組分析超過(guò)200個(gè)細(xì)胞核，誤差線代表標(biāo)準(zhǔn)差，以上所有實(shí)驗(yàn)均有三次生物學(xué)重復(fù)。試驗(yàn)方法參考文獻(xiàn)“kee,k.,angeles,v.t.,flores,m.,nguyen,h.n.,andreijopera,r.a.(2009).humandazl,dazandboulegenesmodulateprimordialgerm-cellandhaploidgameteformation.nature462,222–225.”中的方法。其中，免疫熒光染色步驟簡(jiǎn)述如下：收集細(xì)胞加入4％多聚甲醛固定15分鐘后吸棄，加入含有0.25％tritonx-100的pbs透膜10分鐘，之后吸棄，室溫使用含有10％驢血清的pbs封閉1小時(shí)，之后按照1:10，100的比例加入一抗，室溫1小時(shí)或4℃過(guò)夜。然后吸走含有一抗的封閉液(保存留下次使用)，加入pbs清洗3遍，每次5分鐘。接下來(lái)操作需要嚴(yán)格避光：按照1:1000比例加入熒光二抗，室溫1小時(shí)，吸走，加入pbs清洗3遍，每次5分鐘。加入終濃度100ng/mldapi染料，室溫10分鐘，吸走，加入pbs清洗3遍，每次5分鐘。置于熒光顯微鏡下觀察并拍照。細(xì)胞鋪展簡(jiǎn)述如下：細(xì)胞用trypletmexpress(貨號(hào)12605010)消化離心，500g離心5min，用pbs清洗一次，500g離心5min，1mlheb1(30mmtrisph8.2，50mm蔗糖，17mm檸檬酸，5mmedta，2.5mmdtt，1mmpmsf，ddh2o為溶劑，最后調(diào)ph8.2-8.4)重懸，避光冰上孵育30min。500g離心5min，然后用heb2(heb1+蔗糖0.1m)100μl重懸細(xì)胞，然后1000rpm離心三分鐘將細(xì)胞甩到載玻片上。接著4％多聚甲醛固定15分鐘后吸棄，加入含有0.1％tritonx-100的pbs透膜10分鐘，吸去，接著0.04％photo-flo(kodak，貨號(hào)1464510)處理5min，接著孵育抗體方法同蛋白熒光染色。熒光染色結(jié)果如圖2所示。圖2a和圖2c為prdm9和γh2ax的熒光染色結(jié)果，從圖中可以看出：誘導(dǎo)組細(xì)胞表達(dá)減數(shù)分裂特異表達(dá)的蛋白prdm9及dna雙鏈斷裂蛋白γh2ax。圖2b和圖2d為sycp3和γh2ax的熒光染色結(jié)果，從圖中可以看出：誘導(dǎo)組細(xì)胞表達(dá)減數(shù)分裂聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白sycp3及dna雙鏈斷裂蛋白γh2ax。圖2e為sycp3和mlh1的熒光染色高倍鏡結(jié)果，從圖中可以看出：誘導(dǎo)組細(xì)胞表達(dá)減數(shù)分裂特異蛋白，指示細(xì)胞進(jìn)入減數(shù)分裂。圖2f為誘導(dǎo)第6天到第9天體外誘導(dǎo)減數(shù)分裂中同時(shí)表達(dá)prdm9和γh2ax的陽(yáng)性細(xì)胞百分比圖，從圖中可以看出：體外誘導(dǎo)的細(xì)胞分化過(guò)程中有一個(gè)減數(shù)分裂瞬時(shí)發(fā)生的動(dòng)態(tài)過(guò)程。每個(gè)時(shí)間點(diǎn)分析超過(guò)200個(gè)細(xì)胞核。圖2g為誘導(dǎo)第7天細(xì)胞核的sycp3表達(dá)百分比堆砌條形圖，其中，n代表沒(méi)有sycp3表達(dá)，p代表點(diǎn)狀sycp3表達(dá)，e代表?xiàng)l狀sycp3表達(dá)，從圖中可以看出：約20-30％體外誘導(dǎo)的細(xì)胞表達(dá)減數(shù)分裂聯(lián)會(huì)復(fù)合體蛋白sycp3。三、從形態(tài)學(xué)和特異蛋白表達(dá)染色水平上證明卵泡的成功分化使用相差顯微鏡觀察胚胎干細(xì)胞(h9)和按照實(shí)施例1中的方法自加入病毒液時(shí)起誘導(dǎo)11天后的已出現(xiàn)的卵泡的形態(tài)。結(jié)果如圖3所示。圖3b為第十一天誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞在相差顯微鏡下結(jié)果，形態(tài)學(xué)上與卵泡類似。圖3c為第十一天誘導(dǎo)的胚胎干細(xì)胞在相差顯微鏡下結(jié)果，形態(tài)學(xué)上與卵泡類似。圖3d為第十一天四個(gè)不同的誘導(dǎo)的卵泡在相差顯微鏡高倍鏡下結(jié)果，形態(tài)學(xué)上與卵泡類似。圖3e為第十一天誘導(dǎo)的人卵泡在體式鏡下結(jié)果，形態(tài)學(xué)上與卵泡類似。圖3f為第十一天收集卵泡在體式鏡下結(jié)果。所有的卵泡改為卵泡上述結(jié)果表明：從形態(tài)學(xué)上鑒定從胚胎干細(xì)胞體外成功分化出卵泡。四、從特異蛋白表達(dá)染色水平上證明卵泡的成功分化對(duì)實(shí)施例1中誘導(dǎo)得到的卵泡中的特異蛋白zp2、卵細(xì)胞特異蛋白nobox、顆粒細(xì)胞特異蛋白amh按照上述步驟二中的方法進(jìn)行免疫熒光染色。結(jié)果如圖3所示。圖3g為zp2熒光染色結(jié)果，從圖中可以看出：在蛋白水平上證明分化的卵泡表達(dá)卵細(xì)胞特異蛋白zp2；圖3h為nobox熒光染色結(jié)果。從圖中可以看出：在蛋白水平上證明分化的卵泡表達(dá)卵細(xì)胞特異蛋白nobox。圖3i為amh熒光染色結(jié)果，從圖中可以看出：在蛋白水平上證明分化的卵泡含有顆粒細(xì)胞特異蛋白amh。五、從轉(zhuǎn)錄水平上證明體外成功分化出卵泡1、供試細(xì)胞的制備(1)對(duì)照組細(xì)胞隨機(jī)選取兩個(gè)人源胚胎干細(xì)胞h9，分別將其記作es1和es2。隨機(jī)選取兩個(gè)步驟二的1中的(2)的對(duì)照組細(xì)胞，分別將其記作sde1和sde2。(2)人源卵泡按照實(shí)施例1中的方法，將胚胎干細(xì)胞hsf6細(xì)胞系誘導(dǎo)為卵泡，將得到的卵泡記作flc_1；按照實(shí)施例1中的方法，將胚胎干細(xì)胞h9細(xì)胞系誘導(dǎo)為卵泡，將得到的卵泡記作flc_2。2、轉(zhuǎn)錄組測(cè)序委托北京諾禾致源科技股份有限公司公司分別對(duì)步驟1中的供試細(xì)胞進(jìn)行轉(zhuǎn)錄組測(cè)序，序列分析參考文獻(xiàn)“trapnell,c.,pachter,l.,andsalzberg,s.l.(2009).tophat:discoveringsplicejunctionswithrna-seq.bioinformatics25,1105–1111.”中方法。圖4a為供試細(xì)胞的全基因組rna測(cè)序結(jié)果的非監(jiān)督聚圖(unsupervisedhierarchicalclustering)，從圖中可以看出：在全基因組轉(zhuǎn)錄水平上卵泡單獨(dú)聚類不與自發(fā)分化的細(xì)胞和胚胎干細(xì)胞聚類。圖4b為人源胚胎干細(xì)胞(es)、自發(fā)分化的人源胚胎干細(xì)胞(sde)和人源卵泡(flc_1和flc_2的熱圖(heatmap)與基因本體(geneontology)分析。左圖是熱圖結(jié)果，顯示出不同組的細(xì)胞有不同的基因表達(dá)譜；右圖是基因本體分析，顯示不同組細(xì)胞參與不同的生物學(xué)過(guò)程。從圖中可以看出：卵泡在轉(zhuǎn)錄組水平上表達(dá)多個(gè)生殖進(jìn)程的基因。圖4c為自發(fā)分化的人源胚胎干細(xì)胞(sde)和人源卵泡(flc)的轉(zhuǎn)錄組散點(diǎn)圖。紅色的點(diǎn)指示出在人源生殖組織(如卵子和顆粒細(xì)胞)中特異表達(dá)的基因會(huì)在卵泡樣本中富集表達(dá)，說(shuō)明體外分化的卵泡表達(dá)卵細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的特異基因。3、反轉(zhuǎn)錄熒光定量pcr分別以30個(gè)卵泡(實(shí)施例1中制備得到的卵泡，30個(gè)重復(fù))的rna為模板進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄熒光定量pcr，分別檢測(cè)sohlh2、zp2、nobox、h1foo、cyp19a和rspo1的轉(zhuǎn)錄水平。以gapdh為內(nèi)參基因，將上述步驟二的1中的(2)的對(duì)照組細(xì)胞作為對(duì)照。每組至少有三個(gè)生物學(xué)重復(fù)，誤差線顯示的是標(biāo)準(zhǔn)差。表2、引物序列基因前引物后引物gapdhtgttgccatcaatgaccccttctccacgacgtactcagcgcyp19agtggacgtgttgacccttctcaactcagtggcaaagtccasohlh2ggttgtatttcagggcatggcgaactctgacaacgaagcazp2tcttcttcgcccttgtgactctcagggtgagcttttctggnoboxgccagaaagctggagagaagcagttcctcactctgagtgtrspo1aagtgctcacccaagctgttttcacattgcgcaggactach1foogtgaaaaaggcagccaagagctgtaggcctcagcatctcc圖4d為30個(gè)卵泡的反轉(zhuǎn)錄熒光定量pcr結(jié)果。結(jié)果表明：sohlh2、zp2、nobox、h1foo、cyp19a和rspo1的轉(zhuǎn)錄水平明顯高于等量細(xì)胞的對(duì)照組，說(shuō)明體外分化的卵泡表達(dá)卵細(xì)胞和顆粒細(xì)胞的特異基因。六、人源卵泡的小鼠腎包囊移植進(jìn)一步證明體外分化的卵泡具有人卵泡的發(fā)育特性1、腎包囊移植將小鼠(icr品系)腹腔打開，將人源卵泡(實(shí)施例1中制備得到的卵泡)注射到小鼠腎包囊部位，然后收集移植后的腎包囊組織(圖5a)。并且以步驟二的1中的(2)的對(duì)照組細(xì)胞作為對(duì)照。腎包囊移植步驟具體參考文獻(xiàn)“chen,b.etal.recoveryoffunctionaloocytesfromculturedpremeioticgermcellsafterkidneycapsuletransplantation.stemcellsdev.22,567–580(2013).”中的方法。2、蘇木精-伊紅(h&estaining)染色取移植后的腎包囊組織進(jìn)行蘇木精-伊紅(h&estaining)染色，染色的具體步驟參考文獻(xiàn)“chen,b.etal.recoveryoffunctionaloocytesfromculturedpremeioticgermcellsafterkidneycapsuletransplantation.stemcellsdev.22,567–580(2013).”中的方法。圖5b為移植點(diǎn)附近的腎臟蘇木精-伊紅(h&estaining)染色結(jié)果。圖5c和圖5d分別為對(duì)照組(自發(fā)分化細(xì)胞的腎包囊移植)和實(shí)驗(yàn)組(人源卵泡腎包囊移植)的蘇木精-伊紅(h&estaining)染色結(jié)果。箭頭指示初級(jí)卵泡結(jié)構(gòu)。圖5e為實(shí)驗(yàn)組的蘇木精-伊紅(h&estaining)染色高倍鏡結(jié)果。雙箭頭指示gv(germinalvesicle)期卵泡樣結(jié)構(gòu)。以上所有的蘇木精-伊紅(h&estaining)染色從形態(tài)學(xué)上證明體外分化的卵泡移植入體內(nèi)之后依然維持卵泡的結(jié)構(gòu)與發(fā)育特性。3、nobox和amh的熒光染色分別取移植后的腎包囊組織進(jìn)行nobox和amh的免疫熒光染色，免疫熒光的具體步驟同上。每個(gè)移植實(shí)驗(yàn)有三次生物學(xué)重復(fù)。圖5f為nobox的熒光染色結(jié)果。從圖中可以看出：nobox熒光與卵泡樣結(jié)構(gòu)的細(xì)胞核共定位。圖5g為amh的熒光染色結(jié)果。從圖中可以看出：amh熒光圍繞在卵泡樣結(jié)構(gòu)周圍，與顆粒細(xì)胞共定位。以上熒光染色結(jié)果從蛋白水平上證明卵泡移植入體內(nèi)之后依然維持卵泡的結(jié)構(gòu)與發(fā)育特性。序列表<110>清華大學(xué)<120>將人源胚胎干細(xì)胞體外誘導(dǎo)為卵泡的方法及其所用培養(yǎng)基<160>12<210>1<211>948bp<212>dna<213>人工序列<220><223><400>1atggcggctccctcgtgtggcggcgacagaaaagctcgcctgacgccatctttgccgcac60gagtctactgcaaatcctgaaactccaaactcaaccatctccagagaggccagcacccag120tcctcatcagctgcaaccagccaaggctatattttaccagaaggcaaaatcatgccaaac180actgtttttgttggaggaattgatgttaggatggatgaaactgagattagaagcttcttt240gctagatatggttcagtgaaagaagtgaagataatcactgatcgaactggtgtgtccaaa300ggctatggatttgtttcattttttaatgacgtggatgtgcagaagatagtagaatcacag360ataaatttccatggtaaaaagctgaagctgggccctgcaatcaggaaacaaaatttatgt420gcttatcatgtgcagccacgtcctttggtttttaatcatcctcctccaccacagtttcag480aatgtctggactaatccaaacactgaaacttatatgcagcccacaaccacgatgaatcct540ataactcagtatgttcaggcatatcctacttacccaaattcaccagttcaggtcatcact600ggatatcagttgcctgtatataatta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