本發(fā)明屬于細(xì)小病毒檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，尤其涉及用于檢測(cè)竹鼠細(xì)小病毒的pcr引物及其試劑盒。

背景技術(shù)：

細(xì)小病毒屬于無(wú)囊膜單鏈dna病毒，病毒基因組大約5kb。其主要成員包括豬細(xì)小病毒、犬細(xì)小病毒、阿留申病毒、貂腸炎病毒、貓泛白細(xì)胞減少癥病毒等。細(xì)小病毒是廣泛的病原體，在動(dòng)物中會(huì)引起一系列的疾病。

申請(qǐng)人課題組前期的竹鼠病毒宏基因組學(xué)研究發(fā)現(xiàn)竹鼠細(xì)小病毒有很高的感染率，并首次用細(xì)胞成功分離到三株竹鼠細(xì)小病毒，首次完成其全基因測(cè)序。目前申請(qǐng)人分離到的竹鼠細(xì)小病毒是一種完全沒(méi)有報(bào)道的新的細(xì)小病毒。該病毒粒子無(wú)囊膜，不含脂質(zhì)和糖類，結(jié)構(gòu)堅(jiān)實(shí)致密，對(duì)外界環(huán)境有強(qiáng)大的抵抗力。60℃加熱30min不能使病毒完全滅活，在50％的甘油生理鹽水中能在普通冰箱4℃中最長(zhǎng)可保存4個(gè)月，在25℃保存5d的含毒臟器，病毒滴度不降低；在糞便和固體污染物上的病毒可存活數(shù)月至數(shù)年。因此，動(dòng)物養(yǎng)殖場(chǎng)一但發(fā)生本病毒感染很難通過(guò)消毒徹底殺滅。細(xì)小病毒對(duì)乙醚、氯仿和丙酮等脂溶性溶劑和酸、堿、酚(0.5％)及胰蛋白酶有抵抗力，但0.5％福爾馬林和0.175％次氯酸鈉能有效地殺滅病毒，可用作細(xì)小病毒的消毒劑。

隨著我國(guó)特種動(dòng)物養(yǎng)殖業(yè)的迅速發(fā)展，竹鼠養(yǎng)殖業(yè)得以不斷壯大，而目前國(guó)內(nèi)外在竹鼠細(xì)小病毒性疾病領(lǐng)域的研究和報(bào)道還處于空白狀態(tài)，臨床上針對(duì)竹鼠細(xì)小病毒病及由此引起的繼發(fā)性疾病的防治也處于被動(dòng)甚至空白狀態(tài)。迄今，國(guó)內(nèi)外沒(méi)有任何關(guān)于該病毒的基因參考序列。因此，急需一種快速檢測(cè)竹鼠細(xì)小病毒病的方法，來(lái)對(duì)發(fā)病竹鼠進(jìn)行及時(shí)診治。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問(wèn)題是提供一種特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便的用于檢測(cè)竹鼠細(xì)小病毒的pcr引物及其試劑盒。

為解決上述技術(shù)問(wèn)題，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：

用于檢測(cè)竹鼠細(xì)小病毒的pcr引物，包括引物p1-f和引物p1-r，它們分別具有以下堿基序列：

引物p1-f5′-ggcagtcacacgtcactagc-3′，

引物p1-r5′-ttactcttttatgcaccaactc-3′。

用于檢測(cè)竹鼠細(xì)小病毒的pcr試劑盒，該試劑盒含有引物p1-f和引物p1-r，它們分別具有以下堿基序列：

引物p1-f5′-ggcagtcacacgtcactagc-3′，

引物p1-r5′-ttactcttttatgcaccaactc-3′。

引物p1-f和引物p1-r的摩爾比為1∶1。

引物p1-f和引物p1-r的濃度均為20μm。

該試劑盒還含有以下試劑：dna提取試劑、pcr擴(kuò)增試劑、竹鼠細(xì)小病毒陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。

dna提取試劑為axygen體液病毒dna/rna小量試劑盒，pcr擴(kuò)增試劑為2×estaqmastermix。

竹鼠細(xì)小病毒陽(yáng)性對(duì)照為竹鼠細(xì)小病毒ns1蛋白基因片段cdna的質(zhì)粒，陰性對(duì)照為竹鼠細(xì)小病毒陰性的昆明小鼠血清。

針對(duì)竹鼠細(xì)小病毒檢測(cè)和診斷的缺乏有效可靠技術(shù)的問(wèn)題，發(fā)明人設(shè)計(jì)并制備了用于檢測(cè)竹鼠細(xì)小病毒的pcr引物，包括引物p1-f和引物p1-r，它們分別具有序列表中seq.id.no.1和seq.id.no.2的堿基序列。據(jù)此，發(fā)明人還制備了相應(yīng)的pcr試劑盒并建立相應(yīng)的pcr檢測(cè)方法，該試劑盒含有引物p1-f和引物p1-r、dna提取試劑、pcr擴(kuò)增試劑、竹鼠細(xì)小病毒陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照。實(shí)驗(yàn)表明，本發(fā)明具有特異、敏感、快速、簡(jiǎn)便的特點(diǎn)，彌補(bǔ)了目前臨床上檢測(cè)該病毒的技術(shù)空缺，可作為養(yǎng)殖場(chǎng)、基層實(shí)驗(yàn)室等場(chǎng)所開(kāi)展快速檢測(cè)的良好方法。

附圖說(shuō)明

圖1是本發(fā)明pcr檢測(cè)方法退火溫度檢測(cè)結(jié)果圖，圖中：1.ddh2o；2.陰性樣品；3.53℃；4.56℃；5.60℃；m：dl2000dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖2是本發(fā)明pcr檢測(cè)方法特異性試驗(yàn)結(jié)果圖，圖中：1.竹鼠細(xì)小病毒；2.ddh2o；3.竹鼠內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒；4.竹鼠圓環(huán)病毒；m：dl2000dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖3是本發(fā)明pcr檢測(cè)方法敏感性試驗(yàn)結(jié)果圖，圖中：1.dna濃度為125ng/μl2-5.10^-1～10^-4倍比稀釋模板；m：dl2000dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

圖4是本發(fā)明pcr檢測(cè)方法的臨床檢測(cè)結(jié)果圖，圖中：1.陽(yáng)性對(duì)照；2.陰性對(duì)照；3-4.可疑樣品；dl2000dna分子質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例1引物設(shè)計(jì)

根據(jù)前期病毒宏基因組學(xué)測(cè)序結(jié)果得到的竹鼠細(xì)小病毒基因序列(其全長(zhǎng)序列見(jiàn)seq.id.no.4)的保守區(qū)域設(shè)計(jì)引物，得到一對(duì)位于ns1蛋白基因的引物p1-f和p1-r(見(jiàn)表1)，送深圳華大基因合成，用depc處理水溶解，-20℃保存。

表1引物序列

實(shí)施例2pcr反應(yīng)體系與反應(yīng)程序的建立

1、dna模板制備

均勻剪取發(fā)病竹鼠的心、肝、脾、肺、腎等組織與抽濾除菌dmem按體積比1∶5的比例研磨制成病料懸液，分裝到1.5mlep管內(nèi)，經(jīng)3次凍融后，將病料懸液8000rpm4℃離心5min，取上清200μl，同時(shí)等量吸取陽(yáng)性對(duì)照與陰性對(duì)照(見(jiàn)實(shí)施例6)并編號(hào)。按照axygen體液病毒dna/rna小量試劑盒提取模板dna，產(chǎn)物直接用于pcr反應(yīng)或置于-20℃保存。

2、pcr擴(kuò)增反應(yīng)

按pcr反應(yīng)體系(見(jiàn)表2)配制反應(yīng)混合物放入takarapcr儀，pcr反應(yīng)程序：預(yù)變性：95℃5min；擴(kuò)增32個(gè)循環(huán)(包括：變性：94℃30sec；退火：56℃45sec；延伸：72℃90sec)；最后延伸：72℃7min。反應(yīng)結(jié)束后，取pcr產(chǎn)物5μl點(diǎn)樣于1％瓊脂糖凝膠加樣孔內(nèi)(含0.5μg/ml溴化乙錠)電泳進(jìn)行鑒定，如電泳結(jié)果在1086bp處出現(xiàn)擴(kuò)增條帶，同時(shí)陰、陽(yáng)性成立，即表明待檢樣品中有竹鼠細(xì)小病毒。

表2pcr反應(yīng)液組份

實(shí)施例3pcr檢測(cè)方法退火溫度確定

用提取好的樣品dna做模板，設(shè)置不同的退火溫度，然后其他條件均設(shè)置成相同進(jìn)行pcr，pcr完成后取產(chǎn)物5μl點(diǎn)樣于1％瓊脂糖凝膠加樣孔內(nèi)(含0.5μg/ml溴化乙錠)。電泳后的凝膠于紫外分析儀下觀察結(jié)果，以確定其最佳退火溫度，結(jié)果顯示退火溫度從53℃-60℃，pcr產(chǎn)物結(jié)果均很特異(圖1)，最終確定檢測(cè)方法的退火溫度設(shè)為56℃。

實(shí)施例4特異性實(shí)驗(yàn)

用前述已建立的pcr方法，分別以竹鼠細(xì)小病毒、竹鼠圓環(huán)病毒、竹鼠內(nèi)源性反轉(zhuǎn)錄病毒、ddh2o分別為病毒核酸模板進(jìn)行pcr試驗(yàn)，按表2的體系配制反應(yīng)液，按照實(shí)施例2的方法進(jìn)行特異性試驗(yàn)。結(jié)果顯示只有竹鼠細(xì)小病毒能進(jìn)行特異性擴(kuò)增，其它病毒不能擴(kuò)增出目的條帶(圖2)。結(jié)果表明，本發(fā)明檢測(cè)方法具有很高的特異性。

實(shí)施例5靈敏度實(shí)驗(yàn)

用蛋白質(zhì)核酸測(cè)定儀測(cè)定了模板dna濃度為125ng/μl，對(duì)模板dna進(jìn)行10倍倍比稀釋然后進(jìn)行pcr，32個(gè)pcr循環(huán)后，檢測(cè)該方法的敏感性，最終測(cè)定該方法的最低檢測(cè)量為125pg(圖3)。

實(shí)施例6試劑盒組裝

根據(jù)以上實(shí)施例的研究結(jié)果，組裝檢測(cè)試劑盒以方便使用。

1、引物為p1-f和p1-r，濃度均為20μm。

2、dna提取試劑：使用總dna純化試劑為axygen體液病毒dna/rna小量試劑盒。

3、pcr擴(kuò)增試劑：普通的2×estaqmastermix(天根生物公司生產(chǎn))

4、竹鼠細(xì)小病毒陽(yáng)性對(duì)照和陰性對(duì)照

陽(yáng)性對(duì)照：將需擴(kuò)增的ns1蛋白基因的目的序列(seq.id.no.3)經(jīng)pcr擴(kuò)增并克隆進(jìn)pmd-18t，構(gòu)成并測(cè)序驗(yàn)證100％同源，最后制備目的片段重組質(zhì)粒pmd-ns1，在含氨芐青霉素的lb細(xì)菌培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)，收獲菌液提取質(zhì)粒作為陽(yáng)性對(duì)照。

陰性對(duì)照：無(wú)菌采集的竹鼠細(xì)小病毒陰性的昆明小鼠血清。

實(shí)施例7臨床應(yīng)用

對(duì)臨床上疑似患竹鼠細(xì)小病毒病的病鼠進(jìn)行解剖采樣檢測(cè)，使用前述試劑盒按照本發(fā)明的pcr檢測(cè)方法進(jìn)行。結(jié)果顯示，臨床檢測(cè)樣品擴(kuò)增出1086bp的特異性帶，為竹鼠細(xì)小病毒陽(yáng)性(圖4)。

sequencelisting

<110>廣西壯族自治區(qū)獸醫(yī)研究所

<120>用于檢測(cè)竹鼠細(xì)小病毒的引物及其試劑盒

<130>用于檢測(cè)竹鼠細(xì)小病毒的引物及其試劑盒

<160>4

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