本發(fā)明涉及有機(jī)高分子化合物，具體涉及具有共軛主鏈結(jié)構(gòu)的聚芴。

背景技術(shù)：

分子影像學(xué)是運(yùn)用影像學(xué)手段，在組織水平、細(xì)胞水平甚至分子水平對(duì)特定分子進(jìn)行活體顯像，以顯示其生物學(xué)行為，并對(duì)特定分子進(jìn)行定性、定量研究的學(xué)科。目前常用的分子影像技術(shù)主要有pet分子成像、ct分子成像、超聲分子成像、mr分子成像和光學(xué)分子成像。由于自身靈敏度、選擇性、分辨率及安全性等方面的缺陷，單一的分子影像技術(shù)不能滿足臨床診斷需求，亟需發(fā)展雙模態(tài)甚至多模態(tài)分子影像技術(shù)。雙模態(tài)分子影像技術(shù)融合了兩種分子影像技術(shù)，克服了單一分子影像技術(shù)的局限性，使不同分子影像技術(shù)的優(yōu)勢(shì)得到互補(bǔ)，拓寬了分子影像技術(shù)的研究范圍與應(yīng)用前景。mr成像技術(shù)能提供高分辨率的組織信息和三維結(jié)構(gòu)成像，具有安全無創(chuàng)、無放射性、高空間分辨率、多方位及多參數(shù)成像等特點(diǎn)；但是靶向性差、靈敏度低。光學(xué)成像技術(shù)具有操作簡(jiǎn)便、安全無創(chuàng)、靈敏度高、時(shí)間分辨率高、無射線輻射、可重復(fù)曝光等優(yōu)點(diǎn)；但是存在空間分辨率較差，背景噪聲高等缺點(diǎn)。因此，mr/光學(xué)雙模態(tài)影像技術(shù)將mr成像技術(shù)和光學(xué)成像技術(shù)進(jìn)行融合，即能提供高分辨率的結(jié)構(gòu)組織學(xué)信息，同時(shí)又能實(shí)現(xiàn)高靈敏的功能學(xué)顯像，最終達(dá)到功能學(xué)顯像與結(jié)構(gòu)組織顯像的統(tǒng)一。

發(fā)展和應(yīng)用mr/光學(xué)雙模態(tài)分子影像技術(shù)的基礎(chǔ)是構(gòu)建mr/光學(xué)雙模態(tài)探針。mr/光學(xué)雙模態(tài)探針可以分為兩類。(1)基于釓的mr/光學(xué)雙模態(tài)探針。釓螯合物具有高t1弛豫率，是臨床常用的mr探針。將熒光小分子染料和釓螯合物通過化學(xué)鍵結(jié)合可以制備出mr/光學(xué)雙模態(tài)探針。如harrison等將gd(ⅲ)螯合物直接與近紅外熒光染料ir-783化學(xué)偶聯(lián)構(gòu)建mr/光學(xué)雙模態(tài)探針(j.am.chem.soc.,2015,137(28),9108～9116)。(2)基于納米氧化鐵的mr/光學(xué)雙模態(tài)探針。納米氧化鐵具有較好的t2弛豫率，是獲得臨床應(yīng)用的mr探針。與釓螯合物存在潛在腎毒性相比，納米氧化鐵具有更好的安全性。yen,s.k.等首先用兩親性聚乙烯馬來酸酐共聚物改性近紅外熒光染料ir-820，然后將其對(duì)納米氧化鐵表面進(jìn)行修飾得到mr/光學(xué)雙模態(tài)探針(acsnano,2013,7(8),6796～6805)。用于光學(xué)成像的探針以熒光小分子染料居多，存在熒光量子效率低、光穩(wěn)定性差等缺點(diǎn)，影響其應(yīng)用。

以2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(2，2，6，6-tetramethylpiperidinooxy，tempo)為代表的穩(wěn)定有機(jī)自由基含有自旋單電子，具有超磁性，氧化還原性能、良好的光熱穩(wěn)定劑和生物活性，廣泛應(yīng)用在已應(yīng)用為蛋白質(zhì)、核酸類酯和藥物分子的新型自旋標(biāo)記物、不穩(wěn)定自由基的俘獲劑、醇類氧化劑和生物探針[anal.chem.1996，68(21)，3815～3821]。因其自旋單電子生產(chǎn)的超磁性，tempo等有機(jī)自由基具有高t1弛豫性能，可以作為mri造影劑應(yīng)用在細(xì)胞及分子水平的mri成像。如用tempo修飾多肽和dna，發(fā)現(xiàn)該類含有機(jī)自由基大分子顯示出高的水質(zhì)子弛豫時(shí)間[magn.reson.chem.2008，46(11)，1055～1058]。許乙凱等設(shè)計(jì)合成了含tempo的丙炔胺衍生物和含聚乙二醇的丙炔胺衍生物，反應(yīng)得到含tempo聚合物pa-tempo；采用葉酸和熒光素化學(xué)修飾含tempo聚合物，構(gòu)建得到可視化含tempo聚炔衍生物，將其應(yīng)用為mr/光學(xué)雙模態(tài)探針(zl201410548407)。但是采用熒光素作為光學(xué)報(bào)告基團(tuán)，存在光穩(wěn)定差的缺點(diǎn)。

具有共軛主鏈結(jié)構(gòu)的聚芴得到了廣泛關(guān)注。聚芴顯示出高熒光量子效應(yīng)，良好的光穩(wěn)定性，低細(xì)胞毒性和生物相容性好的優(yōu)點(diǎn)，廣泛應(yīng)用為熒光探針和光學(xué)傳感器.但是未見含有機(jī)自由基聚芴的設(shè)計(jì)合成及其mri/光學(xué)成像的報(bào)道。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是提供一種離子化的含有機(jī)自由基聚芴，該聚芴具有良好的生物相容性和光穩(wěn)定性，可作為熒光/mri雙模態(tài)探針用于mr分子成像和光學(xué)分子成像。

本發(fā)明解決上述問題的技術(shù)方案是：

一種離子化的含有機(jī)自由基聚芴，該聚芴是由化學(xué)式(i)所示的重復(fù)結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成的聚合物，其數(shù)均分子量(簡(jiǎn)稱mn)為8000～17000，分散性指數(shù)(簡(jiǎn)稱pdi)為2.00～3.00，

上述離子化的含有機(jī)自由基聚芴，其數(shù)均分子量較好為9000～11000，分散性指數(shù)較好為2.16～2.24。

一種離子化的含有機(jī)自由基聚芴的制備方法，該方法包括以下步驟：

(1)將化學(xué)式(ii)所示化合物和化學(xué)式(iii)所示的化合物進(jìn)行suzuki偶合反應(yīng)得含有機(jī)自由基聚芴，

(2)將含有機(jī)自由基聚芴在四氫呋喃︰三甲胺＝7︰3體積比的混合溶液中離子化得到所述離子化的含有機(jī)自由基聚芴。

上述方法中，所述化學(xué)式(ii)所示化合物為已知化合物，其具體制備方法是將4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基和2,5-二碘苯甲酸反應(yīng)得到的。

上述方法中，所述化學(xué)式(iii)所示化合物為已知化合物，其具體制備方法是可按文獻(xiàn)(acsmacrolett.2015,4,453～457)所述方法合成。

上述方法中，所述的suzuki偶合反應(yīng)具體是，將1摩爾量的化學(xué)式(ii)所示化合物，1摩爾量的化學(xué)式(iii)所示化合物和適量pd(pph3)4，在適量甲苯和k2co3水溶液中，80℃下反應(yīng)12～24h。

上述suzuki偶合反應(yīng)的反應(yīng)式如下述化學(xué)式(iv)所示，

上述離子化的反應(yīng)式如下述化學(xué)式(v)所示，

上述方法中，步驟(2)所述離子化的反應(yīng)條件為，室溫反應(yīng)3～7天。

本發(fā)明所述的離子化的含有機(jī)自由基聚芴可作為熒光/mri雙模態(tài)探針用于mr分子成像和光學(xué)分子成像。

本發(fā)明所述離子化的含有機(jī)自由基聚芴具有π-π共軛主鏈，顯示出良好的熒光特性和光穩(wěn)定性，可以應(yīng)用為光學(xué)成像；同時(shí)含有2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基，該2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基具有超順磁性，因此可以應(yīng)用為mri對(duì)比劑；本發(fā)明所述離子化的含有機(jī)自由基聚芴還具有良好的光穩(wěn)定性和光學(xué)活性，低細(xì)胞毒性，高生物相容性和良好的t1弛豫率，可以應(yīng)用為光學(xué)/mri雙模態(tài)對(duì)比劑，對(duì)細(xì)胞和活體動(dòng)物內(nèi)進(jìn)行熒光/mri雙模態(tài)成像。

附圖說明

圖1為離子化的含有機(jī)自由基聚芴的熒光光譜和uv-vis光譜圖。

圖2為離子化的含有機(jī)自由基聚芴的t1wi圖像(左圖)及擬合的t1弛豫率曲線(右圖)。

圖3為離子化的含有機(jī)自由基聚芴作用于a549細(xì)胞24h存活率直方圖。

圖4為離子化的含有機(jī)自由基聚芴作用于a549細(xì)胞隨時(shí)間變化的標(biāo)準(zhǔn)化熒光強(qiáng)度圖。

圖5為流式細(xì)胞儀檢測(cè)離子化的含有機(jī)自由基聚芴作用于a549細(xì)胞的熒光強(qiáng)度對(duì)比圖，其中左邊空白組，右邊為實(shí)驗(yàn)組。

圖6為離子化的含有機(jī)自由基聚芴作用于a549細(xì)胞的t1wimr圖像。

圖7為離子化的含有機(jī)自由基聚芴作用于a549細(xì)胞的t1wimr的信號(hào)直方圖。

圖8為荷瘤裸鼠注射離子化的含有機(jī)自由基聚芴前后的mri成像效果圖，其中，左邊為t1wimr圖像，右邊為信號(hào)直方圖。

具體實(shí)施方式

下面用具體實(shí)施例來進(jìn)一步詳細(xì)描述本發(fā)明的制備方法及其效果。

實(shí)施例1

(1)化學(xué)式(ii)所示化合物的制備

取4-氨基-2,2,6,6-四甲基哌啶-1-氧自由基(氨基tempo)(1.71g，10mmol)，2,5-二碘苯甲酸(3.73g，10mmol)和nhs(1.15g，10mmol)加入50ml二氯甲烷中，攪拌均勻后加入edc.hcl(1.91g，10mmol)，室溫下反應(yīng)過夜。有機(jī)溶劑相分別用酸、nahco3和鹽水洗滌。干燥后過硅膠柱(etoac/hexane＝2/1,v/v)得到紅色固體3.16g。

化合物的表征

¹hnmr(400mhz,dmso-d6)δ(ppm):8.29～8.31(d,1h),7.50(s,1h),7.48～7.49(d,1h),7.03～7.12(d,1h),1.81～1.84(d,1h),1.43～1.49(t,1h),1.13～1.15(t,12h).

¹³cnmr(100mhz,dmso-d6)δ(ppm):166.67,152.49,145.14,140.85,139.11,135.95,128.52,116.79,111.58,94.08,93.26,57.91,44.58,32.66,19.68.

hr-ms(esi):c16h21i2n2o2m/z,526.9692for[m+na]⁺:549.9581.

核磁測(cè)量條件為：加入2倍的苯肼，反應(yīng)0.5h后測(cè)量。

以上數(shù)據(jù)證明上述制備的化合物為化學(xué)式(ii)所示化合物。

(2)含有機(jī)自由基聚芴的合成

在schlenk管中，將化學(xué)式(ii)所示化合物與化學(xué)式(iii)所示化合物(按acsmacrolett.2015,4,453～457所述方法合成)suzukicoupling反應(yīng)。具體步驟如下：取1mmol化學(xué)式(ii)所示化合物、1mmol化學(xué)式(iii)所示化合物和適量pd(pph3)4加入schlenk管中，加入5ml甲苯和3mlk2co3水溶液(1m)，80℃下反應(yīng)16小時(shí)，反應(yīng)液倒入甲醇中，沉淀過濾干燥至恒重。

¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)＝7.26～8.54(m，9h)，3.64～4.15(m，5h),1.78～1.97(m，10h)，1.07～1.66(m，28h).

ir：3439.12,2975.86,2929.37,2854.23,1716.98,625.56，1462.10,1424.92,1362.97,1315.68,1232.02,1177.79,1140.61,1077.86,1002.71,885.73,822.98,785.02,751.71,685.09,634.73,563.46.核磁測(cè)量條件為：加入2倍的苯肼，反應(yīng)0.5h后測(cè)量。

(3)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的合成

取500mg含有機(jī)自由基聚芴溶解在14ml四氫呋喃中，室溫?cái)嚢杌旌暇鶆?，加?ml三甲胺，室溫?cái)嚢?天。反應(yīng)后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，最后冷凍干燥得到如化學(xué)式(i)所示的離子化的含有機(jī)自由基聚芴，該化合物的核磁數(shù)據(jù)如下：

¹hnmr(400mhz，dmso-d6)δ(ppm)＝7.12～8.62(m,9h),3.51～4.33(m,23h),1.77～2.21(m,10h),0.98～1.63(m,28h)。

離子化的含有機(jī)自由基聚芴的重均分子量和數(shù)均分子量使用jascogulliversystem(pu-980,co-965,ri-930,anduv-1570)凝膠滲透色譜儀進(jìn)行測(cè)定。配備聚苯乙烯凝膠柱(shodexcolumnsk804,k805,andj806)，用thf作為洗脫劑，聚苯乙烯作為標(biāo)準(zhǔn)校正，30℃下測(cè)定。檢測(cè)發(fā)現(xiàn)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的mw＝21312,mn＝9867,pdi＝2.16。

(4)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的熒光發(fā)射光譜和紫外吸收光譜

在10ml容量瓶中將離子化的含有機(jī)自由基聚芴配置約成100μmol/l的儲(chǔ)備液，并用移液槍取1ml轉(zhuǎn)移至10ml燒瓶中，使用雙蒸水稀釋至刻度，得到樣品溶液。制備后室溫下放置8min后進(jìn)行測(cè)定。紫外吸收光譜使用島津uv-2450分光光度計(jì)于室溫下進(jìn)行檢測(cè)；熒光發(fā)射光譜使用帶有氙燈和1.0cm石英池的日立f-4500熒光分光光度計(jì)進(jìn)行，選擇365nm激發(fā)波長(zhǎng)，激發(fā)和發(fā)射狹縫寬度均為1nm。

離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光學(xué)特性如圖1所示。從圖1中可看出離子化的含有機(jī)自由基聚芴在420nm處顯示出一強(qiáng)熒光發(fā)射峰，在365nm紫外光激發(fā)下顯示藍(lán)色熒光。

(5)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的t1弛豫率

用超純水將離子化的含有機(jī)自由基聚芴配成濃度分別為0、0.625、1.25、2.5、5.0、10.0mg/ml的溶液，分裝在7個(gè)5ml的ep管中，每管2ml，采用philipsachieva3.0t磁共振，8通道頭線圈進(jìn)行掃描，掃描參數(shù)為：ir＝50,75,100,150,200,250,300,400,500,600,700,800,900,1000ms,te＝10ms，tr＝3000ms，層厚：3mm，層間距：0.5mm，fov＝120×100×60mm，nsa＝2。

不同濃度離子化的含有機(jī)自由基聚芴溶液在tr＝600ms時(shí)的t1wi圖像和后處理偽彩圖tempo如圖2所示，隨著離子化的含有機(jī)自由基聚芴溶液濃度升高，t1信號(hào)逐漸增強(qiáng)。結(jié)果顯示含有機(jī)自由基聚芴具有良好的t1弛豫性能。

(6)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的體外細(xì)胞毒性實(shí)驗(yàn)

采用標(biāo)準(zhǔn)的mtt法和a549細(xì)胞檢測(cè)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的體外細(xì)胞毒性。將離子化的含有機(jī)自由基聚芴溶于無菌pbs緩沖液中，并稀釋得到6個(gè)濃度分別為0、0.355、0.71、1.42、2.84、5.68mmol/l的培養(yǎng)基懸液，每組設(shè)6個(gè)復(fù)孔；將a549細(xì)胞按6000個(gè)/孔接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24h后吸去培養(yǎng)液，加入上述不同濃度的培養(yǎng)基懸液，僅含完全培養(yǎng)基而無細(xì)胞孔作為調(diào)零孔。共培養(yǎng)24h后，加入mtt(5mg/ml)溶液10μl，繼續(xù)培養(yǎng)4h后，吸去培養(yǎng)液，每孔加入150uldmso，置于平板震蕩儀震蕩15min，在酶標(biāo)儀中測(cè)定波長(zhǎng)為490nm的吸光度值(od值)，并按照以下公式計(jì)算細(xì)胞存活率：細(xì)胞存活率(％)＝(實(shí)驗(yàn)孔o(hù)d值-調(diào)零孔o(hù)d值)/(對(duì)照孔o(hù)d值-調(diào)零孔o(hù)d值)×100％。

離子化的含有機(jī)自由基聚芴溶液與a549細(xì)胞共孵育24h，細(xì)胞存活率如圖3所示，隨著聚合物濃度的增大，a549細(xì)胞的存活率有所下降，但在濃度高達(dá)5.68mmol/l的情況下，細(xì)胞存活率仍有80％以上，說明離子化的含有機(jī)自由基聚芴的細(xì)胞毒性低，生物安全性較好。

(7)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的體外熒光成像

a549細(xì)胞和mg63細(xì)胞分別按1.5×10⁵和1×10⁵個(gè)/孔接種于共聚焦皿中，置于5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。分為2組，分別為實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組加入離子化的含有機(jī)自由基聚芴的培養(yǎng)基懸液濃度為0.71mmol/l，各組加入液體1ml。共孵育4h后，吸去上清并用pbs緩沖液洗滌2遍，4％多聚甲醛1ml固定15min。固定結(jié)束后，用pbs緩沖液洗滌2遍置于共聚焦顯微鏡下觀察。

離子化的含有機(jī)自由基聚芴溶液與a549、mg63細(xì)胞共孵育4h后的共聚焦顯微鏡圖像顯示與離子化的含有機(jī)自由基聚芴共孵育后的a549、mg63細(xì)胞形態(tài)正常，胞質(zhì)內(nèi)可見明顯的藍(lán)色熒光，而細(xì)胞核未見染色顆粒進(jìn)入，核完整且形態(tài)良好。細(xì)胞的熒光成像結(jié)果表明離子化的含有機(jī)自由基聚芴具有良好的細(xì)胞穿透性和熒光成像效果。

(8)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的體外熒光光穩(wěn)定性檢測(cè)

a549細(xì)胞按1.5×10⁵個(gè)/孔接種于共聚焦皿中，置于5％co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期。加入濃度為0.71mmol/l的離子化的含有機(jī)自由基聚芴培養(yǎng)基懸液，共孵育4h后，吸去上清并用pbs緩沖液洗滌2遍后置于共聚焦顯微鏡下，激發(fā)波長(zhǎng)和發(fā)射波長(zhǎng)分別設(shè)置為：ex＝405nm，em＝570nm，對(duì)同一層面的細(xì)胞持續(xù)照射并每間隔60s拍攝1次，總照射時(shí)間為15min。獲取圖片后使用imagej軟件對(duì)各個(gè)時(shí)間點(diǎn)拍攝的圖片的熒光強(qiáng)度進(jìn)行半定量分析。

離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光穩(wěn)定性使用共聚焦顯微鏡對(duì)染色細(xì)胞進(jìn)行連續(xù)15min的照射來評(píng)價(jià)，如圖4所示，經(jīng)過15min的連續(xù)照射，熒光強(qiáng)度仍有75％以上，說明離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光穩(wěn)定性較好。

(9)流式細(xì)胞儀評(píng)價(jià)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的體外細(xì)胞攝取

將a549細(xì)胞的單細(xì)胞懸液按2×10⁵個(gè)/孔接種于6孔細(xì)胞培養(yǎng)板上，培養(yǎng)24h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。分為2組，分別為實(shí)驗(yàn)組和空白組。實(shí)驗(yàn)組每孔加入濃度為0.71mmol/l的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的培養(yǎng)基懸液1ml，空白組加入dmem完全培養(yǎng)液1ml，共孵育4h后，吸去上清并用pbs緩沖液洗滌2遍，加入胰酶消化3min左右至70～80％的細(xì)胞變圓時(shí)終止消化，分組離心收集細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀再用pbs重懸洗滌2遍，最后加入500μlpbs重懸細(xì)胞置于流式細(xì)胞儀下檢測(cè)。

離子化的含有機(jī)自由基聚芴與a549細(xì)胞共孵育4h后流式細(xì)胞儀檢測(cè)結(jié)果如圖5所示，以細(xì)胞熒光強(qiáng)度來評(píng)價(jià)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的標(biāo)記成功率?？瞻捉M的熒光強(qiáng)度為119，實(shí)驗(yàn)組的熒光強(qiáng)度為6561，標(biāo)記率約為98％，進(jìn)一步證實(shí)了離子化的含有機(jī)自由基聚芴可被a549細(xì)胞攝取。

(10)磁共振評(píng)價(jià)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的體外細(xì)胞磁共振成像效果

將a549細(xì)胞的單細(xì)胞懸液按1×10⁶個(gè)/孔接種于大培養(yǎng)皿上，培養(yǎng)24h至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期備用。分為2組，分別為實(shí)驗(yàn)組和空白組，每組設(shè)3個(gè)復(fù)孔。實(shí)驗(yàn)組每孔加入濃度為1.42mmol/l的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的培養(yǎng)基懸液6ml，空白組加入dmem完全培養(yǎng)液6ml，共孵育4h后，吸去上清并用pbs緩沖液洗滌2遍，加入胰酶消化，分組離心收集細(xì)胞沉淀，細(xì)胞沉淀再用pbs重懸洗滌3遍，最后將細(xì)胞沉淀轉(zhuǎn)移至1.5ml的ep管中，快速、均勻加入150μl濃度為1％的瓊脂糖凝膠，并制備僅含有1％的瓊脂糖凝膠的對(duì)照組以備用。

將上述制備好的ep管置于試管架中，并放在裝有與ep管中瓊脂糖液面水平的水槽中，使用philipsachieva3.0t磁共振、頭顱8通道線圈進(jìn)行掃描，掃描序列、方位以及參數(shù)如下：t1witse序列；冠狀位；翻轉(zhuǎn)角90°，tr＝500ms，te＝10ms，層厚4mm，層間距0，nsa＝8。測(cè)量三個(gè)ep管同一層面中央?yún)^(qū)域的信號(hào)強(qiáng)度和背景噪聲，按以下公式計(jì)算信噪比：

snr＝si/noise，重復(fù)3次。使用spss20.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用one-wayanova進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，兩兩比較根據(jù)方差齊性結(jié)果分別采用lsd法(方差齊)或snk法(方差不齊)進(jìn)行比較。p＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

各組的t1wi圖像及信號(hào)強(qiáng)度統(tǒng)計(jì)圖如圖6和7所示，可以看出，空白組的snr低于純瓊脂糖組，而實(shí)驗(yàn)組的snr明顯高于空白組及純瓊脂糖組，實(shí)驗(yàn)組與另外兩組的差異存在統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。說明離子化的含有機(jī)自由基聚芴可以使被攝取的細(xì)胞的t1wi信號(hào)增強(qiáng)。上述結(jié)果說明離子化的含有機(jī)自由基聚芴在細(xì)胞內(nèi)顯示良好的mri成像性能。

(11)a549肺癌荷瘤裸鼠模型的建立

將含有1×10⁷個(gè)/150μl的a549細(xì)胞懸液接種于4～6周齡的scid雄性裸鼠右側(cè)肩背部皮下，共接種6只。正常飼養(yǎng)約30天待腫瘤最大直徑達(dá)到1.0～1.5cm時(shí)，隨機(jī)分為體內(nèi)熒光實(shí)驗(yàn)組和體內(nèi)mri成像組，每組3只，備用。

(12)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的體內(nèi)急性毒性實(shí)驗(yàn)

取4～6周齡的scid磁性裸鼠3只，將0.4～0.5ml濃度為2.84mmol/l的離子化的含有機(jī)自由基聚芴與生理鹽水混合液經(jīng)裸鼠尾靜脈注入，隨后正常喂養(yǎng)飼養(yǎng)1周，期間觀察其皮毛、活動(dòng)狀態(tài)等健康狀況是否存在異常。1周后，行頸椎脫臼法處死裸鼠，快速取出其主要臟器，如心、肺、肝、脾、腎，經(jīng)he染色置于正置顯微鏡下觀察各器官細(xì)胞的形態(tài)變化。

一般狀態(tài)觀察：注射離子化的含有機(jī)自由基聚芴的裸鼠健康狀況良好，活動(dòng)、進(jìn)食正常，體重?zé)o減輕。

he染色觀察：與空白組相比，注射離子化的含有機(jī)自由基聚芴的裸鼠各主要臟器(心、肝、脾、肺、腎)無明顯損害，細(xì)胞形態(tài)基本正常，無明顯變性、壞死，基本同空白組，說明離子化的含有機(jī)自由基聚芴對(duì)正常裸鼠無明顯急性毒副作用。

(13)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的瘤內(nèi)熒光成像及熒光免疫病理學(xué)檢測(cè)

取4～6周齡的scid雌性裸鼠3只，腹腔注射0.3～0.45ml0.3％的戊巴比妥鈉溶液，待裸鼠麻醉后，行活體熒光成像掃描，掃描完成后快速用胰島素針從裸鼠瘤內(nèi)注入100～150μl濃度為2.84mmol/l的離子化的含有機(jī)自由基聚芴與生理鹽水混懸液，并在注射后的60、120min行活體熒光成像掃描，以觀察瘤內(nèi)熒光強(qiáng)度的變化?；铙w熒光掃描部分參數(shù)設(shè)置如下：白光：曝光時(shí)間＝0.175s，fov＝138.0mm，ex＝em＝0；熒光：曝光時(shí)間＝30s，fov＝138.0mm，ex＝410nm，em＝523nm。

活體熒光實(shí)驗(yàn)后行頸椎脫臼法處死裸鼠，快速取出其腫瘤組織，放入-80℃冰箱進(jìn)行速凍，并在適當(dāng)避光的前提下行冰凍切片制片后置于正置熒光顯微鏡下觀察。

荷瘤裸鼠經(jīng)瘤內(nèi)注射離子化的含有機(jī)自由基聚芴后，瘤內(nèi)熒光信號(hào)逐漸增強(qiáng)，打藥后熒光信號(hào)明顯高于打藥前，且冰凍切片亦見注射了離子化的含有機(jī)自由基聚芴的腫瘤區(qū)域內(nèi)顯著的藍(lán)色熒光，而注射了生理鹽水組幾乎無藍(lán)色熒光，說明離子化的含有機(jī)自由基聚芴在活體瘤內(nèi)聚集時(shí)可在活體成像儀上顯示差異。

(14)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的瘤內(nèi)mr成像

取4～6周齡的scid雌性裸鼠3只，腹腔注射0.3～0.45ml0.3％的戊巴比妥鈉溶液，待裸鼠麻醉后，固定于磁共振上行mr掃描，掃描完成后快速用胰島素針從裸鼠瘤內(nèi)注入100～150μl濃度為2.84mmol/l的離子化的含有機(jī)自由基聚芴與生理鹽水混懸液，并在注射后120min再次行mri掃描，以觀察瘤內(nèi)t1wi信號(hào)強(qiáng)度的變化?；铙wmr掃描部分參數(shù)設(shè)置如下：tr＝500ms，te＝10ms，fov＝120×80×17mm，層數(shù)＝8，層厚＝2mm，層間距＝0，nsa＝3。掃描結(jié)束后，選擇合適層面，使用imagej軟件進(jìn)行偽彩后處理，選取適宜中心部位畫出roi，并測(cè)量腫瘤平掃和增強(qiáng)后同一層面roi的信號(hào)強(qiáng)度，使用spss20.0統(tǒng)計(jì)軟件，采用兩樣本t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，p＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異。

離子化的含有機(jī)自由基聚芴作用于荷瘤裸鼠的mri結(jié)果如圖8所示，瘤內(nèi)注射離子化的含有機(jī)自由基聚芴后，瘤內(nèi)mrt1wi信號(hào)逐漸增強(qiáng)，經(jīng)偽彩后處理的結(jié)果亦顯示打藥后瘤內(nèi)信號(hào)高于打藥前，兩者差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)差異(p＜0.05)。說明離子化的含有機(jī)自由基聚芴在活體瘤內(nèi)聚集時(shí)可在磁共振上顯示差異。

實(shí)施例2

(1)化學(xué)式(ii)所示化合物的制備

依據(jù)實(shí)施例1步驟1所述方法制備

(2)含有機(jī)自由基聚芴的合成

在schlenk管中，將化學(xué)式(ii)所示化合物與化學(xué)式(iii)所示化合物suzukicoupling反應(yīng)。具體步驟如下：取1mmol化學(xué)式(ii)所示化合物、1mmol化學(xué)式(ii)所示化合物和適量pd(pph3)4加入schlenk管中，加入5ml甲苯和3mlk2co3水溶液(1m)，80℃下反應(yīng)20小時(shí)，反應(yīng)液倒入甲醇中，沉淀過濾干燥至恒重。

(3)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的合成

取200mg含有機(jī)自由基聚芴溶解在7ml四氫呋喃中，室溫?cái)嚢杌旌暇鶆颍尤?ml三甲胺，室溫?cái)嚢?天。反應(yīng)后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，最后冷凍干燥得到如化學(xué)式(i)所示的離子化的含有機(jī)自由基聚芴。

采用實(shí)施例1步驟(3)所述方法檢測(cè)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的分子量，其結(jié)果是離子化的含有機(jī)自由基聚芴的mw是36412,mn是12687,pdi是2.87。

(4)mtt法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性

以hela細(xì)胞作為模型細(xì)胞，采用mtt法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性。其步驟同實(shí)施例1步驟6。結(jié)果顯示其細(xì)胞毒性低，生物相容性好。

(5)細(xì)胞培養(yǎng)和成像

以hela細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的熒光成像性能。其步驟同實(shí)施例1步驟7。細(xì)胞的熒光成像結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)離子化的含有機(jī)自由基聚芴具有良好的細(xì)胞穿透性和熒光成像效果.

(6)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光穩(wěn)定性

以hela細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光穩(wěn)定性。其步驟同實(shí)施例1步驟8。光穩(wěn)定性結(jié)果顯示離子化的含有機(jī)自由基聚芴具有較好的光穩(wěn)定性。

(7)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的hela細(xì)胞體外mr成像實(shí)驗(yàn)

以hela細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的mri成像性能。其步驟同實(shí)施例1步驟10。細(xì)胞的mri成像結(jié)果表明離子化的含有機(jī)自由基聚芴在細(xì)胞內(nèi)顯示良好的mri成像性能。

實(shí)施例3

(1)化學(xué)式(ii)所示化合物的制備

依據(jù)實(shí)施例1步驟1所述方法制備

(2)含有機(jī)自由基聚芴的合成

在schlenk管中，將化學(xué)式(ii)所示化合物與化學(xué)式(iii)所示化合物suzukicoupling反應(yīng)。具體步驟如下：取1mmol化學(xué)式(ii)所示化合物、1mmol化學(xué)式(iii)所示化合物和適量pd(pph3)4加入schlenk管中，加入5ml甲苯和3mlk2co3水溶液(1m)，80℃下反應(yīng)18小時(shí)，反應(yīng)液倒入甲醇中，沉淀過濾干燥至恒重。

(3)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的合成

取200mg含有機(jī)自由基聚芴溶解在7ml四氫呋喃中，室溫?cái)嚢杌旌暇鶆颍尤?ml三甲胺，室溫?cái)嚢?天。反應(yīng)后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，最后冷凍干燥得到如化學(xué)式(i)所示的離子化的含有機(jī)自由基聚芴。

采用實(shí)施例1步驟3所述方法檢測(cè)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的分子量，其結(jié)果是離子化的含有機(jī)自由基聚芴的mw＝24385,mn＝10886,pdi＝2.24。

(4)mtt法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性

以pc3細(xì)胞作為模型細(xì)胞，采用mtt法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性。其步驟同實(shí)施例1步驟6。結(jié)果顯示其細(xì)胞毒性低，生物相容性好。

(5)細(xì)胞培養(yǎng)和成像

以pc3細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的熒光成像性能。其步驟同實(shí)施例1步驟7。細(xì)胞的熒光成像結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)離子化的含有機(jī)自由基聚芴具有良好的細(xì)胞穿透性和熒光成像效果.

(6)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光穩(wěn)定性

以pc3細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光穩(wěn)定性。其步驟同實(shí)施例1步驟8。光穩(wěn)定性結(jié)果顯示離子化的含有機(jī)自由基聚芴具有較好的光穩(wěn)定性。

(7)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的hela細(xì)胞體外mr成像實(shí)驗(yàn)

以pc3細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的mri成像性能。其步驟同實(shí)施例1步驟10。細(xì)胞的mri成像結(jié)果表明離子化的含有機(jī)自由基聚芴在細(xì)胞內(nèi)顯示良好的mri成像性能。

實(shí)施例4

(1)化學(xué)式(ii)所示化合物的制備

依據(jù)實(shí)施例1步驟1所述方法制備

(2)含有機(jī)自由基聚芴的合成

在schlenk管中，將化學(xué)式(ii)所示化合物與化學(xué)式(iii)所示化合物suzukicoupling反應(yīng)。具體步驟如下：取1mmol化學(xué)式(ii)所示化合物、1mmol化學(xué)式(iii)所示化合物和適量pd(pph3)4加入schlenk管中，加入5ml甲苯和3mlk2co3水溶液(1m)，80℃下反應(yīng)24小時(shí)，反應(yīng)液倒入甲醇中，沉淀過濾干燥至恒重。

(3)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的合成

取200mg含有機(jī)自由基聚芴溶解在7ml四氫呋喃中，室溫?cái)嚢杌旌暇鶆?，加?ml三甲胺，室溫?cái)嚢?天。反應(yīng)后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，最后冷凍干燥得到如化學(xué)式(i)所示的離子化的含有機(jī)自由基聚芴。

采用實(shí)施例1步驟3所述方法檢測(cè)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的分子量，其結(jié)果是離子化的含有機(jī)自由基聚芴的mw＝50806,mn＝16879,pdi＝3.01。

(4)mtt法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性

以ht55細(xì)胞作為模型細(xì)胞，采用mtt法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性。其步驟同實(shí)施例1步驟6。結(jié)果顯示其細(xì)胞毒性低，生物相容性好。

(5)細(xì)胞培養(yǎng)和成像

以ht55細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的熒光成像性能。其步驟同實(shí)施例1步驟7。細(xì)胞的熒光成像結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)離子化的含有機(jī)自由基聚芴具有良好的細(xì)胞穿透性和熒光成像效果.

(6)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光穩(wěn)定性

以ht55細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光穩(wěn)定性。其步驟同實(shí)施例1步驟8。光穩(wěn)定性結(jié)果顯示離子化的含有機(jī)自由基聚芴具有較好的光穩(wěn)定性。

(7)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的hela細(xì)胞體外mr成像實(shí)驗(yàn)

以ht55細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的mri成像性能。其步驟同實(shí)施例1步驟10。細(xì)胞的mri成像結(jié)果表明離子化的含有機(jī)自由基聚芴在細(xì)胞內(nèi)顯示良好的mri成像性能。

實(shí)施例5

(1)化學(xué)式(i)所示化合物的制備

依據(jù)實(shí)施例1步驟1所述方法制備

(2)含有機(jī)自由基聚芴的合成

在schlenk管中，將化學(xué)式(ii)所示化合物與化學(xué)式(iii)所示化合物suzukicoupling反應(yīng)。具體步驟如下：取1mmol化學(xué)式(i)所示化合物、1mmol化學(xué)式(ii)所示化合物和適量pd(pph3)4加入schlenk管中，加入5ml甲苯和3mlk2co3水溶液(1m)，80℃下反應(yīng)12小時(shí)，反應(yīng)液倒入甲醇中，沉淀過濾干燥至恒重。

(3)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的合成

取200mg含有機(jī)自由基聚芴溶解在7ml四氫呋喃中，室溫?cái)嚢杌旌暇鶆颍尤?ml三甲胺，室溫?cái)嚢?天。反應(yīng)后旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)除去溶劑，最后冷凍干燥得到如化學(xué)式(i)所示的離子化的含有機(jī)自由基聚芴。

采用實(shí)施例1步驟3所述方法檢測(cè)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的分子量，其結(jié)果是離子化的含有機(jī)自由基聚芴的mw＝16549,mn＝8152,pdi＝2.03。

(4)mtt法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性

以lovo細(xì)胞作為模型細(xì)胞，采用mtt法檢測(cè)細(xì)胞生長(zhǎng)活性。其步驟同實(shí)施例1步驟6。結(jié)果顯示其細(xì)胞毒性低，生物相容性好。

(5)細(xì)胞培養(yǎng)和成像

以lovo細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的熒光成像性能。其步驟同實(shí)施例1步驟7。細(xì)胞的熒光成像結(jié)果表明發(fā)現(xiàn)離子化的含有機(jī)自由基聚芴具有良好的細(xì)胞穿透性和熒光成像效果.

(6)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光穩(wěn)定性

以lovo細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的光穩(wěn)定性。其步驟同實(shí)施例1步驟8。光穩(wěn)定性結(jié)果顯示離子化的含有機(jī)自由基聚芴具有較好的光穩(wěn)定性。

(7)離子化的含有機(jī)自由基聚芴的hela細(xì)胞體外mr成像實(shí)驗(yàn)

以lovo細(xì)胞作為模型細(xì)胞,考察步驟3制備的離子化的含有機(jī)自由基聚芴的mri成像性能。其步驟同實(shí)施例1步驟10。細(xì)胞的mri成像結(jié)果表明離子化的含有機(jī)自由基聚芴在細(xì)胞內(nèi)顯示良好的mri成像性能。