本發(fā)明涉及一種制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法，具體涉及一種采用二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法。

背景技術(shù)：

兩親性嵌段共聚物是既含有親水基團又含有疏水基團的一類聚合物，其在選擇性溶劑中通過自組裝可以自發(fā)形成由疏水性內(nèi)核及親水性外殼所組成的高分子膠束。兩親嵌段共聚物憑借其獨特的結(jié)構(gòu)特點及潛在的應(yīng)用性能日益成為高分子科學(xué)領(lǐng)域研究的熱點，所制備的膠束在醫(yī)藥、生物、化工、材料等領(lǐng)域有著廣泛的應(yīng)用前景。

兩親嵌段共聚物體系包括合成的高分子和天然的高分子體系。目前實際應(yīng)用中所使用的兩親共聚物嵌段多為人工合成材料，乳酸-羥基乙酸共聚物、聚乳酸、聚芐基谷氨酸、聚ε–己內(nèi)酯等作為疏水片段，另外，聚氧乙烯、聚乙烯吡咯烷酮、聚乙二醇等可做為親水片段。其主要可通過光交聯(lián)、戊二醛，雙重氮聯(lián)苯胺、甲苯二異氰酸酯，酶交聯(lián)方式對所形成的膠束進行固定制備。人工合成的兩親嵌段共聚物在生物體代謝速率慢，會蓄積，部分對生物體還有一定的毒性，其中部分固定方式也會有一定的毒性。因此需要進行深入研究及交叉學(xué)科引入新材料進行改良。

天然高分子體系包括各種可作為應(yīng)用膠束的蛋白，主要包括絲素蛋白、絲膠蛋白、各種角蛋白、膠原蛋白、明膠、酪蛋白、白蛋白、清蛋白等等。這些蛋白質(zhì)本身就是兩親嵌段共聚物，每一種蛋白質(zhì)因為所含親水及疏水性氨基酸的種類及比例的不同而呈現(xiàn)出一定的嵌段特性。但目前天然高分子體系所涉及到的各種蛋白作為應(yīng)用型膠束，基本上都是某種蛋白單一作為應(yīng)用膠束，其缺點是形貌不可控，粒徑及分布不均一，功能有限。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題是人工合成高分子膠束的兩親嵌段共聚物在生物體代謝速率慢，會蓄積，部分對生物體還有一定的毒性，其中部分固定方式也會有一定的毒性；某種天然高分子蛋白單一作為應(yīng)用膠束，形貌不可控，粒徑及分布不均一，功能有限，提供一種安全無毒、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容好、產(chǎn)物可代謝、價格低廉的二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用下述技術(shù)方案：一種二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法，包括以下步驟：①制備質(zhì)量濃度為0.5-5%角蛋白溶液；②制備質(zhì)量分數(shù)為0.2-5%的天然高分子蛋白溶液；③二硫鍵重建法制備復(fù)合膠束：a、蛋白混合溶液的制備，將步驟①制備的角蛋白溶液和步驟②制備的天然高分子蛋白溶液混合制得蛋白混合溶液，使角蛋白達到混合后總蛋白質(zhì)量的10%以上，同時將溶液的ph值調(diào)節(jié)至兩種蛋白的等電點之間；b、二硫鍵的定量重建：將兩種蛋白的混合溶液置于15-25℃的恒溫中靜置3-12小時；使用巰基試劑dtnb通過分光光度法測定兩種蛋白的混合溶液中巰基含量的具體數(shù)值；c、通過得到的巰基含量的具體數(shù)值計算應(yīng)加入的氧化劑的量；氧化劑加入后得到經(jīng)過二硫鍵重建固定好的復(fù)合蛋白膠束。

所述的角蛋白為動物毛發(fā)或動物蹄角水解制備的角蛋白，所述的天然高分子蛋白為絲素蛋白、絲膠蛋白、膠原蛋白、酪蛋白、白蛋白、清蛋白、大豆蛋白中的任意一種。

步驟①所述的角蛋白通過na2s還原、酸沉淀法制備的，方法為：a、將動物毛發(fā)或動物蹄角粉末與na2s按照質(zhì)量比4:3加入密閉玻璃容器中，加入動物毛發(fā)或蹄角粉末質(zhì)量20倍的水，避光放置7-10天得到角蛋白溶液；b、在角蛋白溶液中20秒內(nèi)加入濃鹽酸，使角蛋白溶液的ph值在30-60秒間內(nèi)達到2.0-2.5，使角蛋白迅速沉淀；c、待角蛋白沉淀后收集下層的角蛋白沉淀，并用無氧水洗滌2-4次，5-20℃真空干燥得到白色角蛋白固體粉末。使用na2s還原法制備角蛋白溶液的原理如下：

采用na2s還原法制備角蛋白溶液時，na2s在溶液中發(fā)生水解會生成naoh和sh^―，在堿性條件下，角蛋白雙硫鍵發(fā)生斷裂，生成過硫半胱氨酸殘基和脫氫丙氨酸殘基，sh^―會與脫氫丙氨酸殘基發(fā)生加成反應(yīng)，將其轉(zhuǎn)化為半光氨酸，從而得到帶有巰基的可溶性角蛋白溶液。

所述的角蛋白沉淀后收集下層的角蛋白沉淀時：先將角蛋白溶液上層所漂浮的色素蛋白取出，棄去上層液體，離心收集下層的角蛋白沉淀，離心轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/min。

步驟①所述的制備質(zhì)量濃度為0.5-5%角蛋白溶液的方法為：將角蛋白固體粉末加入水中，逐漸加入固體naoh，加入量為蛋白質(zhì)量的5%，并磁力攪拌直至角蛋白完全溶解。

所述步驟①制備質(zhì)量濃度為0.5-5%角蛋白溶液時加入溶液總質(zhì)量0.1%的十二烷基苯磺酸鈉用于防止角蛋白自身因二硫鍵引起的交聯(lián)。

步驟②所述的制備任意一種質(zhì)量分數(shù)為0.2-5%的天然高分子蛋白溶液的方法為：采取堿溶解法進行溶解，制備天然高分子蛋白溶液。

步驟⑤中加入的氧化劑為h202或nab03?4h20，加入氧化劑的量為通過分光光度法測定的兩種蛋白的混合溶液中所含巰基等摩爾的量，得到二硫鍵重建后的復(fù)合膠束溶液，加入后穩(wěn)定30min；氧化劑可以將巰基氧化成雙硫鍵，反應(yīng)式如下：

r-sh+r'-sh=r-s-s-r'

最后將二硫鍵重建后的復(fù)合膠束溶液置在去離子水中進行透析以除去多余的氧化劑，最后得到經(jīng)過二硫鍵重建固定好的復(fù)合蛋白膠束。

本發(fā)明所述二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法主要利用了還原法制備的角蛋白中的巰基，而角蛋白是制備此種復(fù)合膠束必須具備的蛋白。另外的一種蛋白可隨意選擇，只要混合時不發(fā)生聚沉。其中二硫鍵重建的模式模型如圖1所示。從圖1可以可出，角蛋白組分通過二硫鍵重建形成了一個空間共價鍵網(wǎng)絡(luò)將其它蛋白質(zhì)穿插固定在網(wǎng)絡(luò)之中，從而形成了一個新型蛋白復(fù)合體膠束的聚集體。

采用上述技術(shù)方案的本發(fā)明主要利用可作為應(yīng)用膠束的各種蛋白與含有巰基的角蛋白通過二硫鍵重建的方法，定量化二硫鍵重建，在蛋白質(zhì)組裝的基礎(chǔ)上制備二硫鍵固定的各種混合蛋白膠束。通過二硫鍵重建的方法制備的天然蛋白復(fù)合膠束具有粒徑一致、形貌可控、功能多樣化的優(yōu)點，具有潛在的科研及應(yīng)用價值。另外，還可以通過進一步控制組裝濃度、溫度、調(diào)節(jié)組裝ph值及蛋白質(zhì)鏈段比例等手段，進一步制備出粒徑一致，具有統(tǒng)一形貌的球形、柱形、梭形的納米及非納米應(yīng)用型復(fù)合膠束，此種方法具有安全無毒、結(jié)構(gòu)穩(wěn)定、生物相容好、產(chǎn)物可代謝、價格低廉等突出優(yōu)點，可以應(yīng)用于藥物緩釋，高分子生物涂膜制備，環(huán)境保護等眾多領(lǐng)域。

附圖說明

圖1：二硫鍵重建法固定復(fù)合膠束的原理圖；

圖2：二硫鍵重建法制備的角蛋白與絲膠蛋白復(fù)合膠束顯微圖。

具體實施方式

下面通過具體實施例對本發(fā)明作詳細說明。

本發(fā)明所有實施例中所涉及的角蛋白及其溶液的制備方法都是相同的，其它各種蛋白的蛋白溶液根據(jù)其特點制備方法都有所不同，具體操作步驟見以下實施例：

實施例1

一種二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法，包括下述步驟：

①制備質(zhì)量濃度為0.5%角蛋白溶液；角蛋白通過na2s還原、酸沉淀法制備的，方法為：a、將脫脂洗凈的羊毛或動物蹄角粉末與na2s按照質(zhì)量比4:3加入密閉玻璃容器中，加入羊毛或蹄角粉末質(zhì)量20倍的水，避光放置10天得到角蛋白溶液；b、在角蛋白溶液中20秒內(nèi)加入濃鹽酸，使角蛋白溶液的ph值在30秒內(nèi)達到2.0-2.5，使角蛋白迅速沉淀；c、待角蛋白沉淀后收集下層的角蛋白沉淀，并用無氧水洗滌2次，5℃真空干燥得到白色角蛋白固體粉末；角蛋白沉淀后收集下層的角蛋白沉淀時：先將角蛋白溶液上層所漂浮的色素蛋白取出，棄去上層液體，離心收集下層的角蛋白沉淀，離心轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/min。制備質(zhì)量濃度為0.5%角蛋白溶液的方法為：將角蛋白固體粉末加入水中，逐漸加入固體naoh，加入量為蛋白質(zhì)量的5%，并磁力攪拌直至角蛋白完全溶解，加入溶液總質(zhì)量0.1%的十二烷基苯磺酸鈉用于防止角蛋白自身因二硫鍵引起的交聯(lián)。

②制備質(zhì)量分數(shù)為0.2-5%的白蛋白溶液；白蛋白采取堿溶解法進行溶解。

③二硫鍵重建法制備復(fù)合膠束：a、蛋白混合溶液的制備，將步驟①制備的角蛋白溶液和步驟②制備的任意一種天然高分子蛋白溶液混合制得蛋白混合溶液，使角蛋白達到混合后總蛋白質(zhì)量的10%以上，同時將溶液的ph值調(diào)節(jié)至兩種蛋白的等電點之間，整個過程不能產(chǎn)生蛋白沉淀；b、二硫鍵的定量重建：將兩種蛋白的混合溶液置于15℃的恒溫中靜置3小時；使用巰基試劑dtnb通過分光光度法測定兩種蛋白的混合溶液中巰基含量的具體數(shù)值；c、通過得到的巰基含量的具體數(shù)值計算應(yīng)加入的氧化劑的量；氧化劑加入后得到經(jīng)過二硫鍵重建固定好的復(fù)合蛋白膠束。加入的氧化劑為nab03?4h20，加入氧化劑的量為通過分光光度法測定的兩種蛋白的混合溶液中所含巰基等摩爾的量，得到二硫鍵重建后的復(fù)合膠束溶液，加入后穩(wěn)定30min；最后將二硫鍵重建后的復(fù)合膠束溶液置在去離子水中進行透析以除去多余的氧化劑，最后得到經(jīng)過二硫鍵重建固定好的復(fù)合蛋白膠束。

實施例2

一種二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法，包括下述步驟：

①制備質(zhì)量濃度為5%角蛋白溶液；角蛋白通過na2s還原、酸沉淀法制備的，方法為：a、將脫脂洗凈的羊毛或動物蹄角粉末與na2s按照質(zhì)量比4:3加入密閉玻璃容器中，加入羊毛或蹄角粉末質(zhì)量20倍的水，避光放置7-10天得到角蛋白溶液；b、在角蛋白溶液中20秒內(nèi)加入濃鹽酸，使角蛋白溶液的ph值在60秒內(nèi)達到2.0-2.5，使角蛋白迅速沉淀；c、待角蛋白沉淀后收集下層的角蛋白沉淀，并用無氧水洗滌4次，20℃真空干燥得到白色角蛋白固體粉末；角蛋白沉淀后收集下層的角蛋白沉淀時：先將角蛋白溶液上層所漂浮的色素蛋白取出，棄去上層液體，離心收集下層的角蛋白沉淀，離心轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/min。制備質(zhì)量濃度為5%角蛋白溶液的方法為：將角蛋白固體粉末加入水中，逐漸加入固體naoh，加入量為蛋白質(zhì)量的5%，并磁力攪拌直至角蛋白完全溶解，加入溶液總質(zhì)量0.1%的十二烷基苯磺酸鈉用于防止角蛋白自身因二硫鍵引起的交聯(lián)。

②制備質(zhì)量分數(shù)為0.2-5%的酪蛋白溶液；酪蛋白采取堿溶解法進行溶解。

③二硫鍵重建法制備復(fù)合膠束：a、蛋白混合溶液的制備，將步驟①制備的角蛋白溶液和步驟②制備的酪蛋白溶液混合制得蛋白混合溶液，使角蛋白達到混合后總蛋白質(zhì)量的10%以上，同時將溶液的ph值調(diào)節(jié)至兩種蛋白的等電點之間，整個過程不能產(chǎn)生蛋白沉淀；b、二硫鍵的定量重建：將兩種蛋白的混合溶液置于25℃的恒溫中靜置12小時；使用巰基試劑dtnb通過分光光度法測定兩種蛋白的混合溶液中巰基含量的具體數(shù)值；c、通過得到的巰基含量的具體數(shù)值計算應(yīng)加入的氧化劑的量；氧化劑加入后得到經(jīng)過二硫鍵重建固定好的復(fù)合蛋白膠束。加入的氧化劑為h202，加入氧化劑的量為通過分光光度法測定的兩種蛋白的混合溶液中所含巰基等摩爾的量，得到二硫鍵重建后的復(fù)合膠束溶液，加入后穩(wěn)定30min；最后將二硫鍵重建后的復(fù)合膠束溶液置在去離子水中進行透析以除去多余的氧化劑，最后得到經(jīng)過二硫鍵重建固定好的復(fù)合蛋白膠束。

實施例3

一種二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法，包括下述步驟：

①制備質(zhì)量濃度為2.5%角蛋白溶液；角蛋白通過na2s還原、酸沉淀法制備的，方法為：a、將脫脂洗凈的羊毛或動物蹄角粉末與na2s按照質(zhì)量比4:3加入密閉玻璃容器中，加入羊毛或蹄角粉末質(zhì)量18倍的水，避光放置8天得到角蛋白溶液；b、在角蛋白溶液中20秒內(nèi)加入濃鹽酸，使角蛋白溶液的ph值在40秒內(nèi)達到2.0-2.5，使角蛋白迅速沉淀；c、待角蛋白沉淀后收集下層的角蛋白沉淀，并用無氧水洗滌3次，20℃真空干燥得到白色角蛋白固體粉末；角蛋白沉淀后收集下層的角蛋白沉淀時：先將角蛋白溶液上層所漂浮的色素蛋白取出，棄去上層液體，離心收集下層的角蛋白沉淀，離心轉(zhuǎn)速為3000轉(zhuǎn)/min。制備質(zhì)量濃度為5%角蛋白溶液的方法為：將角蛋白固體粉末加入水中，逐漸加入固體naoh，加入量為蛋白質(zhì)量的5%，并磁力攪拌直至角蛋白完全溶解，加入溶液總質(zhì)量0.1%的十二烷基苯磺酸鈉用于防止角蛋白自身因二硫鍵引起的交聯(lián)。

②制備質(zhì)量分數(shù)為3%的清蛋白溶液；清蛋白采取堿溶解法進行溶解。

③二硫鍵重建法制備復(fù)合膠束：a、蛋白混合溶液的制備，將步驟①制備的角蛋白溶液和步驟②制備的清蛋白溶液混合制得蛋白混合溶液，使角蛋白達到混合后總蛋白質(zhì)量的10%以上，同時將溶液的ph值調(diào)節(jié)至兩種蛋白的等電點之間，整個過程不能產(chǎn)生蛋白沉淀；b、二硫鍵的定量重建：將兩種蛋白的混合溶液置于20℃的恒溫中靜置18小時；使用巰基試劑dtnb通過分光光度法測定兩種蛋白的混合溶液中巰基含量的具體數(shù)值；c、通過得到的巰基含量的具體數(shù)值計算應(yīng)加入的氧化劑的量；氧化劑加入后得到經(jīng)過二硫鍵重建固定好的復(fù)合蛋白膠束。加入的氧化劑為h202，加入氧化劑的量為通過分光光度法測定的兩種蛋白的混合溶液中所含巰基等摩爾的量，得到二硫鍵重建后的復(fù)合膠束溶液，加入后穩(wěn)定30min；最后將二硫鍵重建后的復(fù)合膠束溶液置在去離子水中進行透析以除去多余的氧化劑，最后得到經(jīng)過二硫鍵重建固定好的復(fù)合蛋白膠束。

實施例4

一種二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法，包括下述步驟：

①備料：準備角蛋白和大豆蛋白。

②制備角蛋白溶液：制備濃度為1%的角蛋白溶液，具體方法為將角蛋白加入水中，加入固體naoh并磁力攪拌直至角蛋白完全溶解，加入0.1%的十二烷基苯磺酸鈉用于防止角蛋白自身的因二硫鍵引起的交聯(lián)。

③制備大豆蛋白溶液：制備濃度為0.2%的大豆蛋白溶液，具體方法為將脫脂大豆蛋白加入水中，將水溫逐漸升高至80℃，逐漸加入固體氫氧化鈉直至大豆蛋白完全溶解，將溶液使用濾紙進行過濾除去不溶成分。

④蛋白混合液的制備：將制備好的兩種蛋白溶液按照等體積進行混合，將溶液的ph值調(diào)節(jié)至4.5，均勻攪拌靜置5小時。

⑤二硫鍵重建法制備角蛋白/大豆蛋白復(fù)合膠束：將兩種蛋白的混合溶液在25℃中靜置5小時后取出，加入h2o2促使二硫鍵進行重建，加入與角蛋白所含巰基等摩爾量的雙氧水或nab03?4h2o。最后將二硫鍵重建過的復(fù)合膠束溶液置于截留分子量為1kd的透析袋中進行透析以除去多于的氧化劑，得到經(jīng)過二硫鍵重建的角蛋白/大豆蛋白復(fù)合膠束。

實施例5

一種二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法，包括下述步驟：

①備料：準備角蛋白和絲膠蛋白。

②制備角蛋白溶液：制備濃度為0.5%的角蛋白溶液，具體方法為將角蛋白加入水中，加入固體naoh并磁力攪拌直至角蛋白完全溶解，加入0.05%的十二烷基苯磺酸鈉用于防止角蛋白自身的因二硫鍵引起的交聯(lián)。

③絲膠蛋白的提取:將蠶繭剪碎，用蒸餾水將清洗晾干，按浴比為1:20用500ml乙醚浸泡24h(每隔6小時攪拌一次)以除蠟質(zhì)物，接著用水洗凈，加入無水乙醇浸泡24h除去部分有機物，洗凈后晾干。按照質(zhì)量比1:40的比例將蠶繭放入蒸餾水中煮沸2小時脫膠，脫膠溶液經(jīng)濃縮干燥后即為絲膠蛋白粉末。

④絲膠蛋白溶液的制備：制備濃度為0.5%的絲膠蛋白溶液，具體方法為將絲膠蛋白粉末加入水中，加入固體naoh并磁力攪拌直至絲素蛋白完全溶解。

⑤蛋白混合液的制備：將制備好的兩種蛋白溶液按照等體積進行混合，將溶液的ph值調(diào)節(jié)至5.0，均勻攪拌靜置6小時。

⑥二硫鍵重建法制備角蛋白/絲膠蛋白復(fù)合膠束：將混合蛋白溶液在25℃中靜置2小時后取出，加入角蛋白中巰基等摩爾量的雙氧水或nab03?4h20。最后將二硫鍵重建過的復(fù)合膠束溶液至于截留分子量為1kd的透析袋中進行透析以除去多于的氧化劑，得到經(jīng)過二硫鍵重建的角蛋白與絲膠蛋白復(fù)合膠束，如圖2所示：圖中顯示的角蛋白與絲膠蛋白復(fù)合膠束的組裝條件為：角蛋白與絲素蛋白質(zhì)量比為2:1，溫度25℃，組裝完后ph值調(diào)節(jié)至7.0。

實施例6

本發(fā)明所述的通過二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束（角蛋白/絲素蛋白復(fù)合膠束）的方法包括下述步驟：

一種二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法，包括下述步驟：

①備料：準備角蛋白和絲素蛋白。

②制備角蛋白溶液：制備濃度為1%的角蛋白溶液，具體方法為將角蛋白加入水中，加入固體naoh并磁力攪拌直至角蛋白完全溶解，加入0.1%的十二烷基苯磺酸鈉用于防止角蛋白自身的因二硫鍵引起的交聯(lián)。

③絲素蛋白的提取:將蠶繭打開剪碎用蒸餾水將清洗干凈，放入0.5%的nahco3溶液中，加入100倍質(zhì)量的水，在100℃的條件下沸煮60分鐘后去離子水沖洗3次，目的是去除絲膠蛋白，將去除絲膠蛋白的蠶絲取出放入恒溫干燥箱中在40℃下烘干備用。

④絲素蛋白的溶解：按照cacl2:ch3ch2oh:h2o摩爾比為1:2:8的比例配置絲素蛋白溶解液，將脫膠后的絲素蛋白加入配置好的溶解液中完全淹沒，在70℃的水浴中持續(xù)溶解3小時。將溶解得到的絲素蛋白溶液使用濾紙過濾以去沒有溶解的絲素蛋白及雜質(zhì)，再將過濾后的絲素蛋白溶液裝入透析袋中（截留分子量為8000）在去離子水中透析48小時以上，持續(xù)透析直到透析液的電導(dǎo)率不在變化為止，將絲素蛋白溶液低溫真空干燥，得到絲素蛋白固體。

⑤制備濃度為1%的絲素蛋白溶液：具體方法為將絲素蛋白固體加入水中，逐漸加入固體naoh并磁力攪拌直至絲素蛋白完全溶解。

⑥蛋白混合液的制備：將制備好的兩種蛋白溶液按照等體積進行混合，將溶液的ph值調(diào)節(jié)至4.2，均勻攪拌,靜置10小時。

⑦二硫鍵重建法制備角蛋白/絲素蛋白復(fù)合膠束：將混合蛋白溶液在25℃中靜置5小時后取出，加入與角蛋白中所含巰基等摩爾量的h202或nab03?4h20促使二硫鍵進行重建。最后將二硫鍵重建過的復(fù)合膠束溶液至于截留分子量為3kd的透析袋中進行透析以除去多于的氧化劑，得到經(jīng)過二硫鍵重建的角蛋白/絲素蛋白復(fù)合膠束。

實施例7

一種二硫鍵重建法制備天然蛋白復(fù)合膠束的方法，包括下述步驟：

①備料：準備角蛋白和膠原蛋白。

②制備角蛋白溶液：制備濃度為2%的角蛋白溶液，具體方法為將角蛋白加入水中，加入固體naoh并磁力攪拌直至角蛋白完全溶解，加入0.1%的十二烷基苯磺酸鈉用于防止角蛋白自身的因二硫鍵引起的交聯(lián)。

③膠原蛋白蛋白的選取:本實例選取的膠原蛋白為膠原蛋白的水解物酸性明膠，其等電點為8.5。

④制備濃度為0.5%的膠原蛋白蛋白溶液：具體方法為將酸性明膠固體加入水中，在50℃的水浴中加熱并攪拌直至其溶解。

⑤蛋白混合液的制備：將兩種蛋白制備好的蛋白溶液按照等體積進行混合，將溶液的ph值調(diào)節(jié)至7.0，均勻攪拌后靜置12小時。

⑥二硫鍵重建法制備角蛋白/膠原蛋白復(fù)合膠束：將混合蛋白溶液在25℃中靜置6小時后取出，加入角蛋白中所含巰基等摩爾量的h202或nab03?4h20促使二硫鍵進行重建。最后將二硫鍵重建過的復(fù)合膠束溶液至于截留分子量為1kd的透析袋中進行透析以除去多于的氧化劑，得到經(jīng)過二硫鍵重建的角蛋白/膠原蛋白復(fù)合膠束。