本發(fā)明屬于藥物化學領(lǐng)域，具體涉及一種1,3,5-三取代吡唑化合物及其制備方法和應用。
背景技術(shù)：
淋巴瘤（lymphoma）是淋巴結(jié)或結(jié)外淋巴組織的惡性腫瘤，一般可分為霍奇金淋巴瘤（hl）和非霍奇金淋巴瘤（nhl）兩大類，nhl是成人淋巴瘤的主要類型，占世界上常見惡性腫瘤的第七位。彌漫性大b細胞淋巴瘤（dlbcl）是其中最為常見的一種亞型，而其又可分為三種亞型，分別是活化b細胞樣型（abc）、生發(fā)中心b細胞樣型（gcb）和原發(fā)性縱隔b細胞淋巴瘤（pmbl）。目前治療淋巴瘤的主要手段是通過單克隆抗體的靶向治療，但是這種治療方式對于活化b細胞樣型彌漫性大b細胞淋巴瘤預后較差。
根據(jù)目前的研究表明，黏膜相關(guān)型淋巴組織淋巴瘤易位蛋白1（malt1）是abc型淋巴瘤的有效靶分子，它可以切割多種底物，以促進淋巴細胞增殖，提高淋巴瘤細胞的存活率?；趍alt1在淋巴瘤細胞中潛在的靶點作用進行藥物的開發(fā)與設計，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)一系列先導化合物如下所示：
本發(fā)明通過六步反應得到1,3,5-三取代吡唑化合物，其制備方法簡單，反應條件溫和，能耗低，收率高，產(chǎn)品純度高，實用性強，且所合成的1,3,5-三取代吡唑化合物是一類靶向malt1的小分子化合物，其相對分子質(zhì)量在500以下，具有較高的體外抗癌活性，有望用于制備淋巴癌的靶向治療藥物。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明的目的在于提供一種1,3,5-三取代吡唑化合物及其制備方法和應用，該化合物能夠選擇性的抑制toledo細胞（abc型彌漫性大b細胞淋巴瘤細胞）以及su-dhl細胞（gcb型彌漫性大b細胞淋巴瘤細胞）的生長，具有一定的藥理活性，且其制備方法簡單，實驗條件溫和，不要求高溫高壓、強酸強堿等苛刻條件，反應收率高。
為實現(xiàn)上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：
一種1,3,5-三取代吡唑化合物，其具體為5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-(2-氯乙酰胺基)苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑，其結(jié)構(gòu)式如下：
所述化合物的制備途徑如下：
其具體制備步驟包括：
1）在冰浴條件下，將10mmol3,4-二氯苯乙酮溶于5ml四氫呋喃（thf）中，然后分批加入20mmolnah，攪拌混勻后移至室溫、氮氣氣氛中，繼續(xù)攪拌2h，然后逐滴加入50mmol碳酸二甲酯，攪拌混勻后回流反應1h，經(jīng)tlc檢測體系中無原料后停止反應，經(jīng)純化獲得3,4-二氯苯甲?；宜峒柞ィɑ衔?）；
2）取10.0mmol步驟1）所得3,4-二氯苯甲?；宜峒柞?，加13ml無水乙醇混合溶解，然后加入15.0mmol水合肼，于100℃下攪拌反應1h，得黃色澄清溶液，經(jīng)tlc檢測體系中無原料后停止反應，經(jīng)純化獲得5-(3,4-二氯苯)-3-羥基吡唑（化合物2）；
3）將0.3mmol步驟2）所得5-(3,4-二氯苯)-3-羥基吡唑與0.36mmol1-溴-4-硝基苯、0.003mmolnicl2(pph3)2、0.45mmolkhco3混合，加入1ml二甲基亞砜（dmso）搖勻，將反應瓶中充滿氬氣后密封，于90℃反應16h，經(jīng)tlc檢測體系中無原料后停止反應，經(jīng)純化獲得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)吡唑（化合物3）；
4）在冰浴條件下，將0.18mmol步驟3）所得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)吡唑與0.36mmolpph3于1ml四氫呋喃（thf）中溶解混勻，然后依次加入0.36mmol乙二醇單甲醚、0.27mmol偶氮二甲酸二異丙酯（diad），然后于室溫下攪拌反應4h，經(jīng)tlc檢測體系中無原料后停止反應，經(jīng)純化獲得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑（化合物4）；
5）取0.06mmol步驟4）所得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑，加入0.6mmolzn及2ml甲醇，然后在攪拌條件下加入0.5ml冰醋酸，繼續(xù)室溫攪拌反應6h，經(jīng)tlc檢測體系中無原料后停止反應，經(jīng)純化獲得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氨基苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑（化合物5）；
6）取0.06mmol步驟5）所得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-氨基苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑，加入1ml二氯甲烷，然后在攪拌條件下加入0.09mmol氯乙酸、0.12mmol1-(3-二甲氨基丙基)-3-乙基碳二亞胺鹽酸鹽（edci），常溫攪拌反應0.5h，經(jīng)tlc檢測體系中無原料后停止反應，經(jīng)純化獲得5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-(2-氯乙酰胺基)苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑。
所得化合物與mi-2藥物分子具有相近的藥物活性，其對于toledo細胞（abc型彌漫性大b細胞淋巴瘤細胞）以及su-dhl細胞（gcb型彌漫性大b細胞淋巴瘤細胞）具有較好的選擇抑制性，對兩種細胞株的ic50值均可達到1μm以下，有望用于淋巴癌的靶向治療藥物。
本發(fā)明的顯著優(yōu)點在于：
（1）本發(fā)明經(jīng)過酮酯縮合、吡唑環(huán)的環(huán)化、buchwald反應、mitsunobu反應、硝基還原、酰胺化反應等六步，高效合成目標化合物，其合成方法簡單，實驗條件溫和，不要求高溫高壓等苛刻條件，且反應時間短，收率一般可達到60%以上，部分反應的收率可達到90%以上。
（2）本發(fā)明所得1，3，5-三取代吡唑化合物的相對分子質(zhì)量小于500，屬于小分子化合物，其脂水分配系數(shù)（clogp）小于5，且生物細胞實驗證實該化合物具有一定的抗癌活性，因此該化合物具有用于制備抗癌藥物的前景。
具體實施方式
為了使本發(fā)明所述的內(nèi)容更加便于理解，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明所述的技術(shù)方案做進一步的說明，但是本發(fā)明不僅限于此。
實施例1
（1）3,4-二氯苯甲?；宜峒柞ィɑ衔?）的制備
1.反應：取一個干燥潔凈的100ml茄形燒瓶，在冰浴條件下，將3,4-二氯苯乙酮（1.89g，10mmol）溶于5mlthf之中，再用藥匙將純度60%的nah（800mg，20mmol）分批加入到反應體系中（加入應盡可能迅速，防止體系接觸過多的空氣），加完后移到室溫下，在氮氣氛圍中攪拌反應2h，然后逐滴加入碳酸二甲酯（4.2ml，50mmol），在室溫條件下攪拌、回流反應1h，tlc（展開體系：pe:ch2cl2=1:1）檢測體系中無原料3,4-二氯苯乙酮后停止反應。
2.純化：a）將反應液用40ml乙酸乙酯稀釋，再用飽和氯化銨水溶液萃取洗滌三次，每次20ml，飽和食鹽水洗滌兩次，分液得到有機層；有機層加適量無水硫酸鈉，攪拌2-3分鐘除水干燥，然后過濾，用少量乙酸乙酯（3×2ml）洗滌硫酸鈉；濾液經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸干后得到粗產(chǎn)物；b）先用pe（石油醚）：ch2cl2=1：1為洗脫劑沖洗，然后用純ch2cl2洗脫并收集目標產(chǎn)物，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸除去溶劑，再用油泵抽去少量殘留溶劑，最終得到約2.0g淺黃色固體，收率85%。
產(chǎn)物性狀：淺黃色固體（常溫下）。熔點：52.3-52.7℃。
：rf=0.50（pe:ch2cl2=1:1）。
1（400mhz，cdcl3）δ：12.49（s，1h），8.05（d，j=2.1hz，2h），7.89（d，j=2.1hz，1h），7.79（dd，j=8.4，2.1hz，2h），7.62-7.57（m，3h），7.51（d，j=8.4hz，1h），5.67（s，1h），3.99（s，4h），3.84（s，3h），3.78（s，6h）。
13（101mhz，cdcl3）δ：190.33，173.32，168.92，167.42，138.69，135.57，135.55，133.78，133.43，133.24，131.09，130.72，130.62，128.17，127.67，125.25，88.23，52.83，51.81，45.70。
（esi）：calcdforc10h8cl2o3[m+h]+m/z246.9923，found246.9939。
（2）5-(3,4-二氯苯)-3-羥基吡唑（化合物2）的制備
1.反應：向反應瓶中加入化合物1（2.47g，10.0mmol），用注射器量取13ml無水乙醇，將其加入到反應瓶中，常溫下攪拌或者超聲使其混合均勻，然后將水合肼（910μl，15.0mmol）加入到反應體系中，此時溶液中有大量的固體未溶解，將反應瓶放置于100℃下反應，隨著溫度的上升，固體全部溶解，1h后反應瓶內(nèi)得到黃色澄清液，取出冷卻，取少量液體用tlc（展開體系：pe:etoac=1:1）檢測體系中無原料后停止反應。
2.純化：將反應液在減壓條件下旋蒸除去少量乙醇，然后取下反應瓶；在一個200ml的錐形瓶中裝入適量h2o，用滴管逐次移取反應濃縮液滴加至勻速攪拌的h2o中，有大量白色固體析出，將渾濁液進行減壓抽濾，以抽干固體表面的水分，然后將得到的較干燥的白色固體放入真空干燥器中干燥2h，取出稱重，得到2.1g白色固體，產(chǎn)率92%。
產(chǎn)物性狀：白色固體（常溫下）。熔點：201.9-202.5℃。
：rf=0.50（pe:etoac=1:1）。
1（400mhz，dmso-d6）δ：12.24（s，1h），10.16（s，1h），7.96（s，1h），7.67（d，j=2.8hz，2h），6.00（s，1h）。
13（101mhz，dmso-d6）δ：131.68，130.97，129.89，126.35，124.90。
（esi）:calcdforc9h6cl2n2o[m+h]+m/z228.9930，found228.9925.
（3）5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)吡唑（化合物3）的制備
1.反應：將化合物2（69mg，0.3mmol）、1-溴-4硝基苯（73mg，0.36mmol）、nicl2(pph3)2（2mg，0.003mmol）、khco3（45mg，0.45mmol）裝入反應瓶中，然后加入1mldmso，適當搖勻，充入氬氣使反應瓶中的氣體排除后密封，置于90℃的攪拌器中進行反應，16h后用tlc（展開體系：ch2cl2:etoac=30:1）檢測體系中原料基本反應完全后停止反應。
2.純化：a）將反應液用40ml乙酸乙酯稀釋，再依次用0.5mol/l的hcl溶液萃取洗滌3次、去離子水洗滌2次、飽和食鹽水洗滌1次，每次20ml，分液得到有機層，有機層加適量無水硫酸鈉，攪拌2-3分鐘除水，然后對反應液進行過濾，用少量乙酸乙酯（3×2ml）洗滌硫酸鈉，收集洗滌液和濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀旋蒸后得到粗產(chǎn)物；b）取適量粗產(chǎn)物于1ml離心管中，用乙酸乙酯溶解，上樣，先用純ch2cl2作為洗脫劑沖洗除去雜質(zhì)，然后用ch2cl2：etoac=20:1為洗脫劑沖洗，合并含有產(chǎn)物的洗脫液，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀除去溶劑，再用油泵抽去少量殘留溶劑，最終得到約88mg白色固體，收率為84%。
產(chǎn)物性狀：淺黃色固體（常溫下）。熔點：170.2-171.0℃。
：rf=0.60（ch2cl2:etoac=30:1）。
1（400mhz，dmso-d6）δ：13.27（s，1h），8.26（d，j=9.2hz，2h），8.17–7.86（m，1h），7.89–7.51（m，2h），7.31（d，j=9.2hz，2h），6.73（d，j=2.1hz，1h）。
13（101mhz，dmso-d6）δ：161.90，159.06，142.56，141.47，131.95，131.25，130.97，129.39，126.81，126.01，125.14，117.22，92.77。
（esi）：calcdforc15h9cl2n3o3[m+h]+m/z350.0094，found350.0077。
（4）5-(3,4-二氯苯基)-3-(4-硝基苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑（化合物4）的制備
1.反應：向反應瓶中加入化合物3（84.7mg，0.18mmol），pph3（94.3mg，0.36mmol），在冰浴條件下加入1mlthf使固體混合均勻，用移液槍迅速移取乙二醇單甲醚（28μl，0.36mmol）、diad（49μl，0.27mmol），依次加入到反應瓶中，待添加完后觸摸瓶壁接近室溫后移去冰浴，室溫下攪拌反應4小時后用tlc（展開體系：pe:etoac=4:1）檢測體系中無原料時停止反應。
2.純化：將反應液轉(zhuǎn)移至100ml的茄形燒瓶中，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓旋蒸，用ch2cl2：meoh=10：1溶解旋干后的固體，取少量溶解后的樣品留樣，剩余的溶液均勻的涂布在新的薄層色譜硅膠板上，選擇pe:etoac:ch2cl2=4:1:1作為展開劑進行薄層色譜分離，選擇中間含有目標產(chǎn)物的色譜帶刮下，用ch2cl2:meoh=10:1洗脫，用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀進行減壓旋蒸除去溶劑，最終得到35mg淺黃色固體，收率為47%。
產(chǎn)物性狀：黃色固體（常溫下）。熔點：83.6-84.0℃。
：rf=0.45（pe:etoac=4:1）。
1（400mhz，cdcl3）δ：8.26（d，j=9.3hz，1h），7.86（d，j=2.0hz，1h），7.57（dd，j=8.4，2.1hz，1h），7.44（d，j=8.4hz，1h），7.25（d，j=9.3hz，1h），6.08（s，1h），4.23（t，j=5.4hz，2h），3.77（t，j=5.4hz，2h），3.24（s，3h）。
13（101mhz，cdcl3）δ：161.40，150.21，148.16，144.05，133.41，132.94，131.88，130.68，127.19，126.04，124.60，117.33，89.57，70.54，58.87，47.65。
（esi）：calcdforc18h15cl2n3o4[m+h]+m/z408.0512，found408.0509。
（5）5-(3，4-二氯苯基）-3-(4-氨基苯氧基）-1-（2-甲氧基乙基）吡唑（化合物5）的制備
1.反應：向反應瓶中加入化合物4（25mg，0.06mmol）和zn（39mg，0.6mmol），用注射器量取2ml甲醇加入到反應瓶中，在攪拌條件下逐滴加入0.5ml冰醋酸，室溫下攪拌6h后用tlc（展開體系：pe:etoac=2:1）檢測體系中無原料時停止反應。
2.純化：將反應液轉(zhuǎn)移至分液漏斗中，加入15ml乙酸乙酯稀釋，用飽和nahco3溶液萃取洗滌3次（3×5ml），用水洗滌1次（1×5ml），用飽和nacl洗滌1次（1×5ml），水相再用乙酸乙酯反萃2次（2×5ml），所得乙酸乙酯層用水洗滌1次（1×5ml），用飽和nacl洗滌1次（1×5ml），然后將有機相用無水na2so4干燥，過濾，壓旋蒸條件下旋干，得到黃色油狀物22.2mg，收率96%。
產(chǎn)物性狀：黃色油狀物（常溫下）。
：rf=0.75（pe:etoac=2:1）。
1（400mhz，cdcl3）δ：7.80（d，j=2.0hz，1h），7.51（dd，j=8.3，2.0hz，1h），7.39（d，j=8.3hz，1h），6.99（d，j=8.8hz，2h），6.71（d，j=8.8hz，2h），5.70（s，1h），4.27（t，j=5.8hz，2h），3.82（t，j=5.8hz，3h），3.36（s，3h）。
13（101mhz，cdcl3）δ：154.61，148.89，147.58，143.09，133.97，132.73，131.37，130.51，127.15，124.59，119.96，116.50，86.21，70.70，58.97，47.01。
（6）5-(3，4-二氯苯基)-3-(4-(2-氯乙酰胺基)苯氧基)-1-(2-甲氧基乙基)吡唑（1，3，5-三取代吡唑化合物的合成）
1.反應：向反應瓶中加入化合物5（23mg，0.06mmol），用注射器量取1ml二氯甲烷，加入到反應瓶中，然后在攪拌條件下加入氯乙酸（9mg，0.09mmol）、edci（23mg，0.12mmol），常溫下攪拌反應0.5h后，用tlc（展開體系：pe:etoac=2:1）檢測體系中無原料時停止反應。
2.純化：將反應液經(jīng)硅膠板進行色譜分離（展開劑pe:etoac=4:1），選出所需色帶，刮下，用ch2cl2:meoh=10:1進行淋洗，淋洗液在減壓旋蒸條件下旋干，油泵抽干并稱重，得到淺黃色固體22mg，收率80%。
產(chǎn)物性狀:淺黃色固體（常溫下）。熔點：109.1-109.8℃。
rf=0.45（pe:etoac=2:1）。
1（400mhz，cdcl3）δ：8.27（s，1h），7.82（d，j=2.0hz，1h），7.63–7.51（m，3h），7.42（d，j=8.4hz，1h），7.17（d，j=9.0hz，2h），5.84（s，1h），4.27（t，j=5.7hz，2h），4.21（s，2h），3.81（t，j=5.6hz，2h），3.33（s，3h）。
13（101mhz，cdcl3）δ：163.88，153.31，152.82，147.67，133.60，133.33，132.71，131.47，130.47，127.07，124.49，121.89，118.74，87.37，70.54，58.86，47.10，42.83.
hrms（esi）：calcdforc20h18cl3n3o3[m+h]+m/z454.0487，found454.0478。
實施例2活性測試
（1）化合物對toledo腫瘤細胞增殖和存活的抑制作用
材料：abc型彌漫性大b細胞淋巴瘤細胞株toledo；
受試藥物：實施例1所得最終化合物fm；
細胞培養(yǎng)方法：取出液氮中凍存的toledo細胞，在37℃的溫水中解凍，將細胞懸液移入1.5ml離心管中，置于離心機中，1500rpm離心5min，棄去上清液，加入1mlrpmi1640完全培養(yǎng)液，輕輕吹打均勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)皿中，補加3mlrpmi1640完全培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置于5%co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細胞毒性實驗：將toledo細胞以2×104個細胞/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，加入10μμ/l的化合物，將其置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。取出培養(yǎng)板，每孔加入10μlcck-8試劑，將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2小時后，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150μldmso，避光振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解；以酶標儀檢測450nm處的吸收度od450，并按照以下公式計算細胞存活率：
細胞存活率%=（處理組od450/對照組od450）×100%，
然后使用spss13.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，并計算癌細胞增殖的半數(shù)抑制濃度（ic50）。
（2）化合物對su-dhl-6腫瘤細胞增殖和存活的抑制作用
材料：gcb型彌漫性大b細胞淋巴瘤細胞株su-dhl-6；
受試藥物：實施例1所得最終化合物fm；
細胞培養(yǎng)方法：取出液氮中凍存的su-dhl-6細胞，在37℃的溫水中解凍，將細胞懸液移入1.5ml離心管中，置于離心機中，1500rpm離心5min，棄去上清液，加入1mlrpmi1640完全培養(yǎng)液，輕輕吹打均勻，將細胞懸液加入培養(yǎng)皿中，補加3mlrpmi1640完全培養(yǎng)液，將培養(yǎng)皿置于5%co2、37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。
細胞毒性實驗：將su-dhl-6細胞以2×104個細胞/孔的密度接種到96孔培養(yǎng)板中，加入10μμ/l的化合物，將其置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48小時。取出培養(yǎng)板，每孔加入10μlcck-8試劑，將培養(yǎng)板繼續(xù)置于37℃、5%二氧化碳培養(yǎng)箱中孵育2小時后，終止培養(yǎng)，小心吸棄上清液，每孔加入150μldmso，避光振蕩10min使結(jié)晶物充分溶解；以酶標儀檢測450nm處的吸收度od450，并按照以下公式計算細胞存活率：
細胞存活率%=（處理組od450/對照組od450）×100%，
然后使用spss13.0軟件對數(shù)據(jù)進行處理，并計算癌細胞增殖的半數(shù)抑制濃度（ic50）。
實施例1所得化合物fm的活性參數(shù)如表1所示，表中m.w.為對應化合物的相對分子質(zhì)量，tpsa為拓撲極性表面積參數(shù)，clogp為計算脂水分配系數(shù)，ic50值為化合物fm作用于淋巴瘤細胞48小時后對應淋巴瘤細胞半數(shù)有效抑制濃度。
表1所得化合物的活性參數(shù)
由表1可見，所得化合物可有效抑制abc型彌漫性大b細胞淋巴瘤細胞及gcb型彌漫性大b細胞淋巴瘤細胞的生長增殖，其半數(shù)有效抑制濃度ic50均小于1μm。
以上所述僅為本發(fā)明的較佳實施例，凡依本發(fā)明申請專利范圍所做的均等變化與修飾，皆應屬本發(fā)明的涵蓋范圍。