本發(fā)明涉及醫(yī)藥，特別是一種從北葶藶子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
植物雌激素是來(lái)源于植物，與哺乳動(dòng)物的類固醇激素—17β-雌二醇有相似結(jié)構(gòu)的多羥基化合物。天然的植物雌激素相比于合成的雌激素，其雌激素樣活性要低，但是所引起的乳腺癌、子宮內(nèi)膜癌等副作用也更少，使用會(huì)更安全。因此對(duì)含有植物雌激素的研究逐漸成為熱點(diǎn)。
葶藶子為常用中藥材，始載于《神農(nóng)本草經(jīng)》，列為下品，該藥味辛、苦，性大寒，歸肺與膀胱經(jīng)，具有宣泄平喘、行水消腫的功效。2015版《中國(guó)藥典》收錄的“葶藶子”有南北之分，其中十字花科植物獨(dú)行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟種子習(xí)稱“北葶藶子”，而播娘蒿descurainiasophia(l.)webbexprantl.的干燥成熟種子習(xí)稱“南葶藶子”。雖然南北葶藶子都做正品葶藶子用，但其植物來(lái)源、外觀性狀和藥理活性均有所差異。更未有關(guān)于從北葶藶子中提取2-苯乙酰胺化合物及其在制備雌激素藥物中應(yīng)用的公開(kāi)報(bào)導(dǎo)。
技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：
針對(duì)上述情況，為克服現(xiàn)有技術(shù)之缺陷，本發(fā)明之目的就是提供一種從北葶藶子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法及其應(yīng)用，可有效解決從北葶藶子中提取2-苯乙酰胺化合物及其在制備治療雌激素缺乏癥的藥物問(wèn)題。
本發(fā)明解決的技術(shù)方案是，一種從北葶藶子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是，將炒北葶藶子7.5-8.5kg，每次加10倍重量的水提取三次，每次1.5h，合并三次提取液，減壓濃縮至260-280g的浸膏，浸膏用體積濃度為80％的乙醇19-21l醇沉2h，棄沉淀，將上清液離心過(guò)濾，濃縮至無(wú)醇味(約1000ml)，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹(shù)脂)，依次用水20l、20％乙醇60l、40％乙醇60l洗脫，流速20l/24h，收集40％乙醇洗脫部位，用水離散溶解，離心過(guò)濾，濃縮至30-40ml，過(guò)toyopearlhw-40色譜柱，依次用水3l和體積濃度10％甲醇水溶液3l洗脫，流速8ml/min，收集體積濃度10％甲醇水溶液洗脫部分，用甲醇溶解，靜置24h，析出無(wú)色結(jié)晶，將上層溶液吸出，無(wú)色結(jié)晶干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，如此反復(fù)5次，得無(wú)色結(jié)晶即為2-苯乙酰胺，質(zhì)量含量達(dá)到95％以上。
該制備物2-苯乙酰胺可有效用于制備治療雌激素缺乏癥的藥物，實(shí)現(xiàn)2-苯乙酰胺作為唯一活性成分在制備治療雌激素缺乏癥藥物中的應(yīng)用。
本發(fā)明方法新穎獨(dú)特，易操作，可有效用于從北葶藶子中制備2-苯乙酰胺，并有效用于制備治療雌激素缺乏癥的藥物，開(kāi)拓了治療雌激素缺乏癥的新途徑，開(kāi)拓了北葶藶子的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。
具體實(shí)施方式
以下結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的具體實(shí)施方式作詳細(xì)說(shuō)明。
實(shí)施例1
本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種從北葶藶子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是，將炒北葶藶子8kg，每次加10倍重量的水提取三次，每次1.5h，合并三次提取液，減壓濃縮至270g的浸膏，浸膏用體積濃度為80％的乙醇20l醇沉2h，棄沉淀，將上清液離心過(guò)濾，濃縮至1000ml(無(wú)醇味)，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹(shù)脂)，依次用水20l、20％乙醇60l、40％乙醇60l洗脫，流速20l/24h，收集40％乙醇洗脫部位，用水離散溶解，離心過(guò)濾，濃縮至35ml，過(guò)toyopearlhw-40色譜柱，依次用水3l和體積濃度10％甲醇水溶液3l洗脫，流速8ml/min，收集體積濃度10％甲醇水溶液洗脫部分，用甲醇溶解，靜置24h，析出無(wú)色結(jié)晶，將上層溶液吸出，無(wú)色結(jié)晶干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，如此反復(fù)5次，得無(wú)色結(jié)晶即為2-苯乙酰胺，質(zhì)量含量達(dá)到95％以上。
實(shí)施例2
本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種從北葶藶子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是，將炒北葶藶子7.5kg，每次加10倍重量的水提取三次，每次1.5h，合并三次提取液，減壓濃縮至260g的浸膏，浸膏用體積濃度為80％的乙醇19l醇沉2h，棄沉淀，將上清液離心過(guò)濾，濃縮至無(wú)醇味，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹(shù)脂)，依次用水20l、20％乙醇60l、40％乙醇60l洗脫，流速20l/24h，收集40％乙醇洗脫部位，用水離散溶解，離心過(guò)濾，濃縮至30ml，過(guò)toyopearlhw-40色譜柱，依次用水3l和體積濃度10％甲醇水溶液3l洗脫，流速8ml/min，收集體積濃度10％甲醇水溶液洗脫部分，用甲醇溶解，靜置24h，析出無(wú)色結(jié)晶，將上層溶液吸出，無(wú)色結(jié)晶干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，如此反復(fù)5次，得無(wú)色結(jié)晶即為2-苯乙酰胺，質(zhì)量含量達(dá)到95％以上。
實(shí)施例3
本發(fā)明在具體實(shí)施中，一種從北葶藶子中提取2-苯乙酰胺化合物的方法是，將炒北葶藶子8.5kg，每次加10倍重量的水提取三次，每次1.5h，合并三次提取液，減壓濃縮至280g的浸膏，浸膏用體積濃度為80％的乙醇21l醇沉2h，棄沉淀，將上清液離心過(guò)濾，濃縮至無(wú)醇味(約1000ml)，上dianionhp-20柱(高多孔性苯乙烯的吸附/脫附樹(shù)脂)，依次用水20l、20％乙醇60l、40％乙醇60l洗脫，流速20l/24h，收集40％乙醇洗脫部位，用水離散溶解，離心過(guò)濾，濃縮至40ml，過(guò)toyopearlhw-40色譜柱，依次用水3l和體積濃度10％甲醇水溶液3l洗脫，流速8ml/min，收集體積濃度10％甲醇水溶液洗脫部分，用甲醇溶解，靜置24h，析出無(wú)色結(jié)晶，將上層溶液吸出，無(wú)色結(jié)晶干燥，再次用甲醇溶解，靜置24h，如此反復(fù)5次，得無(wú)色結(jié)晶即為2-苯乙酰胺，質(zhì)量含量達(dá)到95％以上。
實(shí)施例1-3所制備的無(wú)色結(jié)晶，經(jīng)液相色譜法測(cè)定，鑒定為2-苯乙酰胺，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)，具有雌激素樣作用，有效用于制備治療雌激素缺乏癥藥物，并經(jīng)實(shí)驗(yàn)得到了充分證明，有關(guān)資料如下：
1儀器與材料
核磁共振用brukeravanceⅲ500核磁共振儀(tms內(nèi)標(biāo))(bruker)，紅外光譜用nicoletis10microscopespectrometer(thermoscientific,usa)，高分辨質(zhì)譜用brukermaxishdmassspectrometer，紫外光譜用shimadzuuv-2401pcapparatus，高效液相色譜用watersalliance系列2695高效液相系統(tǒng)，配備2998型二極管陣列檢測(cè)器，empower3色譜數(shù)據(jù)工作站，lc50型高壓制備液相色譜儀，uv200型紫外檢測(cè)器[賽譜銳思(北京)科技有限公司]，ymc-packods-a色譜柱(250×10mm.d.s-5mm,12mm)(ymc有限公司)，其余有n-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海愛(ài)朗儀器有限公司)，a-1000s型水流抽氣機(jī)(上海愛(ài)朗儀器有限公司)，n-1111型冷凍水循環(huán)裝置(上海愛(ài)朗儀器有限公司)，fdu-2110型冷凍干燥機(jī)(上海愛(ài)朗儀器有限公司)，dfz-60508型真空干燥箱(上海一恒科學(xué)儀器有限公司)，ab204-n萬(wàn)分之一精密分析天平(mettlertoledo)，imark型酶標(biāo)儀(美國(guó)bio-rad)，二氧化碳培養(yǎng)箱(上海stik)，超凈工作臺(tái)(蘇凈集團(tuán))，arium611vf超級(jí)組合型超純水器(sartorius)，倒置顯微鏡(nikon)，pb-10酸度計(jì)(德國(guó)賽多利斯集團(tuán))。
柱層析填料diaionhp-20、mcigelchp-20(日本三菱化學(xué)公司)，toyopearlhw-40(日本tosoh公司)，sephadexlh-20(parmaciabiotech公司)，柱層析所用硅膠h(160-200目)為青島海洋化工廠生產(chǎn)，培養(yǎng)皿、96孔培養(yǎng)板、細(xì)胞凍存管(corning公司)，所用色譜純?cè)噭┪惶旖蛩挠丫?xì)化學(xué)品有限公司生產(chǎn)，所用分析純?cè)噭楸本┗S和天津第三化學(xué)試劑廠生產(chǎn)。去雌激素胎牛血清(廣州四季青)；無(wú)酚紅dmem高糖培養(yǎng)基、葡聚糖-活性炭去激素胎牛血清(hyclone)；17β-雌二醇(17β-estrogen，e2)、氨芐青霉素、tris堿(sigma)；戊酸雌二醇片(拜耳醫(yī)藥)；edta、mtt及dmso(amresco)；e2、fsh、lhelisa試劑盒(r&d)。
清潔級(jí)昆明種小鼠，雌性，出生21天(剛斷乳)，體重9～12g，購(gòu)于北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司(許可證號(hào)：scxk(京)2016-0011)。人乳腺癌細(xì)胞(mcf-7)購(gòu)自中國(guó)醫(yī)學(xué)科學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)研究所細(xì)胞資源中心。
北葶藶子于2014年采自河南南陽(yáng)，經(jīng)河南中醫(yī)學(xué)院陳隨清教授及董誠(chéng)明教授鑒定為十字花科植物獨(dú)行菜lepidiumapetalumwilld.的干燥成熟種子。
2實(shí)驗(yàn)藥物
本發(fā)明方法從炒北葶藶子中制備的2-苯乙酰胺。
3實(shí)驗(yàn)方法
3.1小鼠子宮增重實(shí)驗(yàn)
將小鼠按體重均衡和隨機(jī)的原則分組，持續(xù)給藥7天。正常組每日蒸餾水0.02ml/g灌胃；陽(yáng)性對(duì)照組隔日灌胃戊酸雌二醇(0.33mg/kg/d)灌胃；北葶藶子中提取2-苯乙酰胺按0.5mg/10g/d，配成混懸液，每日按0.02ml/g灌胃。最后一次給藥24h后，摘眼球取血，脫頸椎處死小鼠，立即摘取子宮稱重，計(jì)算子宮系數(shù)(子宮濕重×(體重)-1×100％)。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。結(jié)果與正常組相比，計(jì)算p值，考察有無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
3.2mcf-7細(xì)胞增殖實(shí)驗(yàn)
mcf-7細(xì)胞經(jīng)含5％去雌激素胎牛血清的無(wú)酚紅dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)1周后，選取對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞，pbs洗兩次，用0.05％胰蛋白酶消化后，加入無(wú)酚紅dmem培養(yǎng)基吹打均勻，以2×104個(gè)/ml的濃度接種于96孔板內(nèi)，每孔培養(yǎng)總體積為200μl。培養(yǎng)24h待細(xì)胞貼壁后，換為含北葶藶子中提取2-苯乙酰胺培養(yǎng)液(10μm)繼續(xù)培養(yǎng)。37℃、5％co2培養(yǎng)48h后，每孔加入mtt溶液(5mg/ml)20μl，37℃繼續(xù)培養(yǎng)4h，小心吸凈培養(yǎng)液，每孔加入150μldmso，震蕩5-10min，使紫色結(jié)晶完全溶解。用酶標(biāo)儀在490nm下測(cè)定各孔吸光度值(a)，計(jì)算平均a值和細(xì)胞活力。實(shí)驗(yàn)平行重復(fù)三次。
細(xì)胞活力＝各組od值/正常組od值
3.3elisa法檢測(cè)血清e(cuò)2、lh、fsh
小鼠摘眼球取血，血液室溫靜置1h后，3000轉(zhuǎn)離心10min，取上清。按照elisa試劑盒說(shuō)明書仔細(xì)操作。
4統(tǒng)計(jì)處理
實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以
5實(shí)驗(yàn)結(jié)果
5.1北葶藶子中提取2-苯乙酰胺對(duì)性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響
與正常組相比，北葶藶子中提取2-苯乙酰胺能顯著誘導(dǎo)性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的增加(p<0.05)。提示北葶藶子中提取2-苯乙酰胺在體內(nèi)具有雌激素樣作用。見(jiàn)表1。
表1北葶藶子中提取2-苯乙酰胺對(duì)性未成熟雌性小鼠子宮系數(shù)的影響
注:與正常組比較，表示p<0.05，表示p<0.01。
5.2北葶藶子中提取2-苯乙酰胺對(duì)mcf-7細(xì)胞促增殖作用
北葶藶子中提取2-苯乙酰胺在10μm時(shí)與正常組比，對(duì)mcf-7細(xì)胞有顯著的促增殖作用(p<0.05)。提示北葶藶子中提取2-苯乙酰胺在體外具有雌激素樣作用。見(jiàn)表2。
表2北葶藶子中提取2-苯乙酰胺對(duì)mcf-7細(xì)胞增殖的影響
5.3北葶藶子中提取2-苯乙酰胺對(duì)血清e(cuò)2、lh、fsh的影響
與正常組相比，北葶藶子中提取2-苯乙酰胺能顯著增加小鼠血清e(cuò)2、lh的水平，但基本不影響血清fsh的水平(p<0.05)。提示北葶藶子中提取2-苯乙酰胺在體具有雌激素樣作用，可能與其增加體內(nèi)e2以及l(fā)h的水平有關(guān)。見(jiàn)表3。
表3北葶藶子中提取2-苯乙酰胺對(duì)血清e(cuò)2、lh、fsh的影響
注:與正常組比較，表示p<0.05，表示p<0.01。
子宮中含有大量的雌激素受體(ers)，雌激素類物質(zhì)通過(guò)與該受體結(jié)合，可誘導(dǎo)子宮靶蛋白(ips)含量增加，表現(xiàn)為子宮組織增生等，因此可以通過(guò)測(cè)定外源雌激素對(duì)性未成熟小鼠子宮促增長(zhǎng)作用來(lái)評(píng)價(jià)藥物的雌激素樣活性。本實(shí)驗(yàn)采用性未成熟雌性小鼠子宮濕重與體重之比(子宮系數(shù))作為評(píng)價(jià)雌激素樣活性的指標(biāo)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，從北葶藶子中提取2-苯乙酰胺化合物可顯著增加性未成熟小鼠子宮系數(shù)，而北葶藶子生品不能顯著增加性未成熟小鼠子宮系數(shù)。提示北葶藶子中提取2-苯乙酰胺在體內(nèi)具有雌激素樣作用。
mcf-7細(xì)胞是雌激素受體陽(yáng)性的人乳腺癌細(xì)胞株，能特異地受雌激素或雌激素樣活性物質(zhì)調(diào)節(jié)而增殖，是最常用的檢測(cè)雌激素樣活性的細(xì)胞株。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，北葶藶子中提取2-苯乙酰胺在濃度為10μm時(shí)對(duì)mcf-7細(xì)胞有顯著的促增殖作用。提示北葶藶子中提取2-苯乙酰胺在體內(nèi)、體外均有一定的雌激素樣作用。
雌二醇是體內(nèi)主要由卵巢成熟濾泡分泌的一種天然雌激素，能促進(jìn)和調(diào)節(jié)女性性器官及副性征的正常發(fā)育。促黃體生成素由垂體產(chǎn)生的一種激素在在女性中刺激卵巢分泌女性雌激素。卵泡刺激素是垂體前葉嗜堿性細(xì)胞分泌的一種激素，主要作用為促進(jìn)卵泡成熟，促進(jìn)整個(gè)卵巢長(zhǎng)大。研究發(fā)現(xiàn)，北葶藶子中提取2-苯乙酰胺可以顯著性增加未成熟雌性小鼠的血清e(cuò)2以及l(fā)h的水平，但對(duì)fsh的影響不大。推測(cè)北葶藶子中提取2-苯乙酰胺增加小鼠子宮系數(shù)發(fā)揮雌激素樣活性可能與其增加體內(nèi)e2以及l(fā)h的水平有關(guān)。
實(shí)驗(yàn)證明，從北葶藶子中提取2-苯乙酰胺化合物作為唯一活性成分有效用于制備雌激素藥物，實(shí)現(xiàn)2-苯乙酰胺作為唯一活性成分在制備雌激素藥物中的應(yīng)用，開(kāi)拓了制備雌激素類藥物的新途徑，提高了北葶藶子的藥用價(jià)值和商業(yè)價(jià)值，有良好的經(jīng)濟(jì)和社會(huì)效益。