本發(fā)明屬于生物醫(yī)藥領(lǐng)域，具體涉及一種青稞β-葡聚糖的制備工藝及其結(jié)構(gòu)序列。

背景技術(shù)：

青稞，大麥屬，是青藏高原地區(qū)人民的主食之一，也是家畜飼料和工業(yè)原料作物。據(jù)監(jiān)測，青稞中β-葡聚糖的含量是所有谷物中含量最高的農(nóng)作物。谷物中的β-葡聚糖是由吡喃型葡萄糖通過β-(1→3)或者β-(1→4)糖苷鍵連接而成的線型多糖。近年來，青稞β-葡聚糖在食品科學(xué)領(lǐng)域受到很大關(guān)注，β-葡聚糖的許多重要的生理學(xué)功能和生理活性逐漸被人認知，據(jù)報道，青稞β-葡聚糖可以作為固有免疫和獲得性免疫的調(diào)節(jié)劑，具有良好的降血糖降血脂功能，并在抗氧化、抗腫瘤等方面也顯示出良好的應(yīng)用前景。由于行業(yè)中對青稞β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)、活性研究較為有限，因而其在行業(yè)中的應(yīng)用也較為低端，多數(shù)將青稞打粉后制作面食、面餅等普通食品，未能充分發(fā)揮其降糖降血脂等作用。雖然目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)β-葡聚糖具有顯著的降血脂和降血糖作用，但由于其序列結(jié)構(gòu)復(fù)雜，絕大多數(shù)降血脂降血糖活性片段及其作用機理未能明確，阻礙了它們被開發(fā)成防治高血脂和糖尿病新藥的進程。

目前，也有一些關(guān)于谷物中β-葡聚糖的制備方法的專利或者文獻的公開，但是大多數(shù)方法一般是僅對其中β-葡聚糖進行粗提，得到樣品純度較低，色澤較差或者制備過程需借助色譜，如離子交換（deae等）或者分子篩（sephadex-g200等）對樣品進行純化，過程較為復(fù)雜，不適宜大批量制備進而工業(yè)化。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

本發(fā)明目的是提供一種青稞β-葡聚糖的制備工藝和青稞β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)序列，解決難以提取純度較高的青稞β-葡聚糖、青稞β-葡聚糖序列復(fù)雜、其藥用性能不明確等的問題。

本發(fā)明的技術(shù)方案是：

提供一種青稞β-葡聚糖的制備工藝，該方法包括如下步驟：

（1）青稞粉碎：將青稞磨成粉后，過40-80目篩，制得青稞粉；

（2）滅酶：在所述青稞粉中加入高濃度乙醇，加熱回流；

(3)提取并除淀粉：在經(jīng)步驟(2)加工后所得的青稞粉中加入水，調(diào)整ph值至7-11，然后加入高溫淀粉酶，混合均勻后于85-90℃條件下攪拌回流1-10h；

（4）除蛋白：調(diào)整步驟(3)所得的溶液的ph值至2-4.5，靜置后蛋白沉淀析出，離心去除沉淀，制得提取液；

（5）制備粗多糖：對所述提取液濃縮1-5倍后加入硫酸銨，靜置后粗多糖沉淀析出，離心后收集沉淀，得青稞β-葡聚糖粗品；

（6）除小分子：將所述青稞β-葡聚糖粗品加水復(fù)溶，然后去除小分子雜質(zhì)，制得青稞β-葡聚糖溶液；

（7）干燥：將所述青稞β-葡聚糖溶液進行干燥，得到精制的青稞β-葡聚糖。

進一步的，步驟(2)中所述料液比為1g:1ml-1g:20ml，所述乙醇的濃度>80%，所述加熱回流時間為1-5小時。

進一步的，步驟(3)中所述青稞粉與水的料水比為1g:5ml-1g:50ml，所述ph值采用20%的na2co3調(diào)整，所述高溫淀粉酶與所述青稞粉的比為10u：1g至1000u：1g。

進一步的，步驟(5)中所述硫酸銨與濃縮后的提取液的料液比為1g:2ml-1g:8ml。

進一步的，步驟(6)中所述去除小分子雜質(zhì)采用超濾膜過濾的方式，所述超濾膜為有機或者無機膜，所述超濾膜截留分子量為1000–5000da。

進一步的，步驟(7)中所述干燥的方式為噴霧、帶式、烘箱或冷凍中的任意一種。

本發(fā)明的另一技術(shù)方案是：

提供一種上述工藝所制備的青稞β-葡聚糖，所述青稞β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)中含有重復(fù)單元glc1→3glc1→4glc/glc1→3glc1→4glc1→4glc。

進一步的，所述青稞β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)中具有β-(1→3)和β-(1→4)兩種連接方式的直鏈葡聚糖。

進一步的，所述青稞β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)中dp3n、dp3n+1和dp3n+2組成一個周期循環(huán)，其中，所述dp3n具有兩種序列連接，分別為[glc1→4glc1→4glc]n和[glc1→3glc1→4glc]n；所述dp3n+1是每一個周期中豐度最高的寡糖，其表述為[glc1→3glc1→4glc]n→4glc；所述dp3n+2是每一個周期中含量較少的寡糖，其為均一的β-(1→4)連接葡萄糖片段。

進一步的，所述青稞β-葡聚糖中β-(1→3)與β-(1→4)糖苷鍵的比值為1:2至1:5。

本發(fā)明所述青稞β-葡聚糖的具體優(yōu)點如下：

（1）該青稞β-葡聚糖的制備工藝簡單，適合大規(guī)模生產(chǎn)；

（2）利用本發(fā)明所述的工藝制備的青稞β-葡聚糖純度高；

（3）該青稞β-葡聚糖結(jié)構(gòu)明確；

（4）該青稞β-葡聚糖具有良好的降血糖降血脂功能。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例的技術(shù)方案，下面將對實施例描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖僅僅是本發(fā)明的一些實施例，對于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動性的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其它的附圖。其中，

圖1為本發(fā)明中所述的一種青稞β-葡聚糖的制備工藝所制備的青稞β-葡聚糖的核磁共振譜圖；

圖2為本發(fā)明中β-葡聚糖單糖組成以及各標(biāo)準(zhǔn)品對比圖；

圖3為本發(fā)明中β-葡聚糖部分酶解產(chǎn)物中寡糖的分離分析圖；

圖4是本發(fā)明中6h、12h以及24h酶解產(chǎn)物中寡糖pad色譜圖及其對應(yīng)的提取離子流色譜圖(eic)；

圖5是本發(fā)明中dp2-dp4的二級質(zhì)譜圖；

圖6是本發(fā)明中dp5-dp7的二級質(zhì)譜圖；

表1是本發(fā)明中青稞β-葡聚糖的¹³cnmr峰位歸屬；

表2是本發(fā)明中青稞β-葡聚糖對高脂血癥小鼠血漿中血脂的影響(n=10)；

表3是本發(fā)明中青稞β-葡聚糖對高脂血癥小鼠肝脂以及肝重系數(shù)的影響(n=10)；

表4是本發(fā)明中青稞β-葡聚糖對高脂血癥小鼠肝組織mda含量，sod和gsh-px活性的影響(n=10)；

表5是本發(fā)明中青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠空腹血糖的影響(n=10)；

表6是本發(fā)明中青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠口服葡萄糖耐量的影響(n=10)；

表7是本發(fā)明中青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠糖原的影響(n=10)。

具體實施方式

本發(fā)明提供一種青稞β-葡聚糖的制備工藝，包括以下步驟：

（1）青稞粉碎：將青稞磨成粉后，過40-80目篩，制得青稞粉；

（2）滅酶：在所述青稞粉中加入高濃度乙醇，加熱回流；

(3)提取并除淀粉：在經(jīng)步驟(2)加工后所得的青稞粉中加入水，調(diào)整ph值至7-11，然后加入高溫淀粉酶，混合均勻后于85-90℃條件下攪拌回流1-10h；

（4）除蛋白：調(diào)整步驟(3)所得的溶液的ph值至2-4.5，靜置后蛋白沉淀析出，離心去除沉淀，制得提取液；

（5）制備粗多糖：對所述提取液濃縮1-5倍后加入硫酸銨，靜置后粗多糖沉淀析出，離心后收集沉淀，得青稞β-葡聚糖粗品；

（6）除小分子：將所述青稞β-葡聚糖粗品加水復(fù)溶，然后去除小分子雜質(zhì)，制得青稞β-葡聚糖溶液；

（7）干燥：將所述青稞β-葡聚糖溶液進行干燥，得到精制的青稞β-葡聚糖。

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細的說明。

一種青稞β-葡聚糖的制備工藝，包括：

步驟一：將青稞磨成粉后，過40-80目篩，制得青稞粉；

步驟二：在所述青稞粉中加入高濃度乙醇，加熱回流；

在一個實施例中，該步驟可以具體如下執(zhí)行：將青稞粉中加入高濃度乙醇，加熱回流。料液比為1:1-1:20(g:ml)；乙醇濃度>80%；回流時間1-5小時。該過程的目的在于除去脂溶性物質(zhì)、色素，并且抑制內(nèi)源性β-葡聚糖酶或生物酶在提取過程中降解目標(biāo)產(chǎn)物。

步驟三：在青稞粉中加入水，調(diào)整ph值至7-11，然后加入高溫淀粉酶，混合均勻后于85-90℃條件下攪拌回流1-10h；

在一個實施例中，該步驟可以具體如下執(zhí)行：按照1:5到1:50的料水比在處理后的青稞粉中加水，采用20%na2co3調(diào)整ph到7-11，并按照活力單位(u)與乙醇處理后青稞粉質(zhì)量(g)比為10：1至1000：1加入高溫淀粉酶，混合均勻后于85-90℃條件下攪拌回流1-10h。

步驟四：調(diào)整所得的溶液的ph值至2-4.5，靜置后蛋白沉淀析出，離心去除沉淀，制得提取液；

在一個實施例中，該步驟可以具體如下執(zhí)行：調(diào)整溶液ph至2-4.5，靜置后蛋白(淀粉酶以及青稞中固有蛋白)沉淀析出，離心去除沉淀。

步驟五：對所述提取液濃縮1-5倍后加入硫酸銨，靜置后粗多糖沉淀析出，離心后收集沉淀，得青稞β-葡聚糖粗品；

在一個實施例中，該步驟可以具體如下執(zhí)行：對提取液濃縮1-5倍后加入硫酸銨，硫酸銨質(zhì)量(g)與濃縮后的提取液(ml)料液比為1:2-1:8，靜置后粗多糖沉淀析出，離心后收集沉淀。該步驟是根據(jù)不同多糖在不同鹽溶液中溶解度不同，使β-葡聚糖在硫酸銨溶液中沉淀，而提取液中的阿拉伯木聚糖會在加入硫酸銨條件下不會析出，達到純化β-葡聚糖的目的。

步驟六：將所述青稞β-葡聚糖粗品加水復(fù)溶，然后去除小分子雜質(zhì)，制得青稞β-葡聚糖溶液；

在一個實施例中，該步驟可以具體如下執(zhí)行：將β-葡聚糖粗品加水復(fù)溶后，采用超濾膜過濾的方式取去除小分子雜質(zhì)。這個過程中選用截留分子量為1000–5000da的有機或者無機膜。

步驟七：將所述青稞β-葡聚糖溶液進行干燥，得到精制的青稞β-葡聚糖。

在一個實施例中，該步驟可以具體如下執(zhí)行：將經(jīng)過膜處理的溶液，以噴霧或帶式或烘箱或冷凍等方式進行干燥，得到精制β-葡聚糖產(chǎn)品。

上述工藝所制得的具有降血糖降血脂功能的青稞β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)特征為含有重復(fù)單元glc1→3glc1→4glc/glc1→3glc1→4glc1→4glc，且他們之間存在多個結(jié)構(gòu)序列均一但不同長度的β-(1→4)連接的葡萄糖片段。根據(jù)核磁共振結(jié)果，在上述條件下提取制備的樣品為具有β-(1→3)和β-(1→4)兩種連接方式的直鏈葡聚糖。根據(jù)hpaec-pad-ms/ms分析結(jié)果，組成該β-葡聚糖的片段存在一定重復(fù)規(guī)律，即不同聚合度的寡糖之間存在一定規(guī)律，dp3n，dp3n+1，dp3n+2，可組成一個周期循環(huán)，其中，dp3n具有兩種序列連接，它們是分別為[glc1→4glc1→4glc]n和[glc1→3glc1→4glc]n；dp3n+1是每一個周期中豐度最高的寡糖，它可以表述為[glc1→3glc1→4glc]n→4glc；dp3n+2含量較少，它為均一的β-(1→4)連接的葡萄糖片段。此外，制備所得葡聚糖中β-(1→3)與β-(1→4)糖苷鍵的比值確定為1:2至1:5。該青稞β-葡聚糖有較好的防治高血脂和糖尿病活性，并有潛在成藥性。

取上述工藝所得β-葡聚糖進行體內(nèi)降血脂和降血糖試驗，具體實驗條件以及實驗結(jié)果如下：

1）降血脂實驗：通過預(yù)防給藥的方式，進行判定，采取上午灌胃給藥(根據(jù)體重200mg/kg)，下午灌食高脂乳劑(乳劑由15%豬油和1.5%膽固醇等輔料制備而成)，在連續(xù)灌胃21天以后，發(fā)現(xiàn)該β-葡聚糖相對與模型組可以顯著降低實驗組小鼠的總膽固醇(tc)(*p<0.05)，低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)(*p<0.05)，以及改善小鼠體內(nèi)游離脂肪酸(ffa)(*p<0.05)的含量，具體機理可能是β-葡聚糖可以抑制肝腸循環(huán)過程中膽汁酸的重新收，從而促進肝臟中l(wèi)dl-c轉(zhuǎn)化為膽酸，從而達到降血脂的目的。

2）降血糖實驗：向建模組小鼠根據(jù)體重110mg/kg注射鏈脲佐菌素，特異性損傷小鼠胰腺，建立i型糖尿病模型，對實驗組小鼠體重采取灌胃給藥(200mg/kg)的方式給予β-葡聚糖。在連續(xù)灌胃給藥10天之后，β-葡聚糖與模型組對比可以顯著降低糖尿病小鼠的空腹血糖(*p<0.05)，改善小鼠口服葡萄糖耐量(*p<0.05)，促進肝糖原的合成(*p<0.05)以及肌糖原的合成(*p<0.05)，具體機理可能是β-葡聚糖通過保護小鼠胰島細胞，增加胰島素的分泌，促進肌糖原和肝糖原的合成，達到降低血糖的目的。

為使本發(fā)明的上述目的、特征和優(yōu)點能夠更加明顯易懂，下面結(jié)合附圖和實施例進一步說明本發(fā)明的技術(shù)方案。但是本發(fā)明不限于所列出的實施例，還應(yīng)包括在本發(fā)明所要求的權(quán)利范圍內(nèi)其他任何公知的改變。

首先，此處所稱的“一個實施例”或“實施例”是指可包含于本發(fā)明至少一個實現(xiàn)方式中的特定特征、結(jié)構(gòu)或特性。在本說明書中不同地方出現(xiàn)的“在一個實施例中”并非均指同一個實施例，也不是單獨的或選擇性的與其他實施例互相排斥的實施例。

其次，本發(fā)明利用結(jié)構(gòu)示意圖等進行詳細描述，在詳述本發(fā)明實施例時，為便于說明，示意圖會不依一般比例作局部放大，而且所述示意圖只是實例，其在此不應(yīng)限制本發(fā)明保護的范圍。此外，在實際制作中應(yīng)包含長度、寬度及深度的三維空間。

實施例一

本實施案例按如下步驟展示一種青稞β-葡聚糖的制備工藝：

將青稞連帶麩皮磨粉，過60目篩；將青稞粉收集后，稱取30g青稞粉，加入150ml80%乙醇溶液，置于75℃回流2h。離心，除去乙醇溶液和色素，將沉淀置于干燥箱烘干。加水?dāng)嚢?，按照料水比?:15，向30g青稞粉中加入450ml水溶液，使用20%na2co3調(diào)整ph至10，并加入4.5ml(約135u)耐高溫淀粉酶，在90℃(85-95℃均可)條件下攪拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷卻至室溫，4500r/min，15min，分離后收集上清液，再加入適量耐高溫淀粉酶，85℃保持1-2h，選用0.1mol/l碘液作為指示劑，直至碘液不再變色，確認淀粉降解為單糖或寡糖；冷卻至室溫后，用hcl調(diào)整溶液ph至2-4.5，攪拌，靜置，沉淀蛋白；4500r/min，15min，離心得上清液，調(diào)整ph至7.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將體積濃縮至1/3，并于每50ml濃縮液中加入14.5g(nh4)2so4固體，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液充分溶解后，置于4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入100ml純水，充分加熱溶解；冷卻至室溫，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，充分攪拌后，置于4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入100ml純水，邊加熱邊攪拌，直至沉淀完全溶解；采用孔徑為3500da的卷式有機膜進行脫鹽處理，每隔1h換水，透析24h，用0.5mbacl2進行監(jiān)測，直至樣品溶液與bacl2溶液混合時不再產(chǎn)生白色沉淀；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒，收集上清液，將溶液濃縮為原來體積的1/5，冷凍干燥，得到1gβ-葡聚糖產(chǎn)品。

1、青稞β-葡聚糖的結(jié)構(gòu)表征

對實施例1中所得的產(chǎn)品分別進行核磁共振分析、單糖組成分析和序列分析。

（1）核磁共振分析

¹³c-nmr分析結(jié)果所得譜圖如圖1所示，根據(jù)已有知識，異頭碳的化學(xué)位移大于103ppm的，則糖苷鍵類型為β型，可初步確定該糖鏈為β型。除此之外，根據(jù)文獻中已有的凝膠多糖(curdlan，由單一的β-(1→3)糖苷鍵連接而成的葡聚糖)的常規(guī)¹³c-nmr峰位歸屬以及纖維素(cellulose，由單一的β-(1→4)糖苷鍵連接而成的葡聚糖)的固態(tài)¹³c-nmr峰位歸屬特征，可對青稞β-葡聚糖的譜圖進行有效地歸屬。其中，104.03ppm與103.20ppm處的共振峰分別歸屬為β-(1→3)-d-glc的異頭碳c-1以及β-(1→4)-d-glc的異頭碳c-1，β-(1→3)-d-glc的c-3共振峰出現(xiàn)在87.71ppm處，將73.38，71.04，76.70以及61.24ppm的共振峰分別歸屬為β-(1→3)-d-glc的c-2，c-4，c-5andc-6，68.72，將72.63，80.74，75.37以及60.69ppm處的共振峰分別歸屬為c-2，c-3，c-4，c-5以及c-6，具體見下表1。

表1青稞β-葡聚糖的¹³c-nmr峰位歸屬

（2）單糖組成分析

通過hpaec-pad的方式對實施例1中制備所得青稞β-葡聚糖進行單糖組成分析。在分析之前，采用2m三氟乙酸(tfa)對實施例1中制備所得樣品進行降解，降解12h后，通過旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)的方式，將具有強腐蝕作用的tfa去除。分別配制阿拉伯糖、半乳糖、葡萄糖以木糖標(biāo)準(zhǔn)品溶液及其混合液，采用hpeac-pad對降解樣品以及標(biāo)準(zhǔn)品溶液進行分離分析，分析柱為carbopacpa-1column(4×250mm，dionex，sunnyvale，ca)，并選取15mmnaoh溶液為流動相，以1ml/min進行等度洗脫。根據(jù)降解后的樣品和標(biāo)準(zhǔn)單糖的pad色譜圖對比，樣品降解后只有葡萄糖被檢測到，葡萄糖色譜峰的純度超過95%。因此可確定制備所得β-葡聚糖純度較高(>95%)。如圖2所示。

（3）序列結(jié)構(gòu)分析

為了研究青稞β-葡聚糖的序列結(jié)構(gòu)特征，將β-葡聚糖溶于10mmpbs緩沖溶液中，樣品濃度3mg/ml，加入1uβ-葡聚糖酶，置于37℃恒溫水浴培養(yǎng)箱；分別于6h，12h，24h采集樣品；采集后溶液煮沸，使酶失活，并離心(15000r/min，10min)去除變性蛋白。采用離子色譜同時串聯(lián)pad和q-tof質(zhì)譜儀的方式，對不同時間酶解產(chǎn)物進行分離分析。分析柱為carbopacpa-200column(3×250mm，dionex，sunnyvale，ca)，流動相a為100mmnaoh，流動相b為1mnaoac以及100mmnaoh溶液，以0.8ml/min流速進行梯度洗脫，其中，b相在0-35min內(nèi)由0%洗脫至35%。

β-葡聚糖部分酶解產(chǎn)物中寡糖的分離分析流程具體見圖3，由于流動相中存在高濃度的非揮發(fā)性鹽，不可直接進入質(zhì)譜，因此需經(jīng)具有在線脫鹽功能的陽離子交換柱處理；圖4，分別為6h、12h以及24h酶解產(chǎn)物的pad色譜圖與其對應(yīng)的提取離子流色譜圖(eic)，如圖所示，eic與pad譜圖結(jié)果可互相對應(yīng)，在脫鹽過程中，可導(dǎo)致樣品的擴散，因而，eic中峰型比pad譜圖中峰型寬。其次，對圖中各峰進行歸屬，根據(jù)圖中6h酶解產(chǎn)物的分析結(jié)果可發(fā)現(xiàn)，不同聚合度的寡糖分布存在一定規(guī)律，dp3n，dp3n+1，dp3n+2，可組成一個周期循環(huán)，其中，dp3n具有兩種序列連接，dp3n+1是每一個周期中豐度最高的寡糖，dp3n+2含量較少。

對聚合度為dp2-7的寡糖分別進行二級質(zhì)譜分析，結(jié)果如圖5(a、b、c、d)及圖6(a、b、c、d)。圖5a為二糖二級質(zhì)譜結(jié)果，b1(m/z161)/c1(m/z179)是典型的糖苷鍵斷裂，據(jù)報道，^2,4a2(m/z221)/^2,5a2(m/z263)是1,4糖苷鍵連接二糖的特殊離子峰，因此該二糖的連接方式可以確認為glc1→4glc。圖5b和5c分別為dp3(a)以及dp3(b)的二級質(zhì)譜結(jié)果。在dp3(a)的二級質(zhì)譜圖中，除了典型的b和c糖苷鍵斷裂以外，還有^2,5a2(m/z263)和^2,5a3(m/z425)斷裂方式的存在，因此，可以確定dp3(a)的兩個糖苷鍵連接方式均為1，4連接。根據(jù)dp3(b)二級質(zhì)譜圖可知，在二級質(zhì)譜轟擊過程中，第二個糖環(huán)上未發(fā)生任何跨環(huán)斷裂，而這一特征可證明1→3糖苷鍵的存在，第三個糖環(huán)上出現(xiàn)了^2,4a3(m/z383)/^2,5a3(m/z425)/^0,2a3(m/z443)的斷裂方式，證明了1→4糖苷鍵的存在。因此，dp3(a)和dp3(b)的序列結(jié)構(gòu)可分別確認為glc1→4glc1→4glc以及glc1→3glc1→4glc。圖5d為dp4二級質(zhì)譜結(jié)果，由于^2,5a3(m/z425)和^2,5a4(m/z587)的存在，可確認，從非還原端處開始的第二個和第三個糖苷鍵均為1,4糖苷鍵;由于該譜圖中未找到第二個糖環(huán)上的任何跨環(huán)斷裂的碎片離子峰，因而該四糖中第一個糖苷鍵可確定為1,3糖苷鍵。dp4的序列結(jié)構(gòu)確認為glc1→3glc1→4glc1→4glc。同理可得，圖6(a、b、c、d)中dp5，dp6(a)，dp6(b)，dp7的序列結(jié)構(gòu)可分別確定為：

glc1→4glc1→4glc1→4glc1→4glc，

glc1→4glc1→4glc1→4glc1→4glc1→4glc，

glc1→3glc1→4glc1→4glc1→3glc1→4glc，

glc1→3glc1→4glc1→4glc1→3glc1→4glc1→4glc。

綜上所述，實施例1中制備所得的青稞β-葡聚糖具有如下結(jié)構(gòu)特征：存在重復(fù)單元glc1→3glc1→4glc/glc1→3glc1→4glc1→4glc，且存在多個β-(1→4)連接的片段。根據(jù)核磁共振結(jié)果，在上述條件下提取制備的樣品為具有β-(1→3)和β-(1→4)兩種連接方式的直鏈葡聚糖。根據(jù)hpaec-pad-ms/ms分析結(jié)果，組成該β-葡聚糖的片段存在一定重復(fù)規(guī)律，即，dp3n，dp3n+1，dp3n+2，可組成一個周期循環(huán)，其中，dp3n存在兩種序列連接，它們是分別為[glc1→4glc1→4glc]n和[glc1→3glc1→4glc]n；dp3n+1是每一個周期中豐度最高的寡糖，它可以表述為[glc1→3glc1→4glc]n→4glc；dp3n+2含量較少，它為均一的β-(1→4)連接的葡萄糖片段。此外，制備所得葡聚糖中β-(1→3)與β-(1→4)糖苷鍵的比值確定為1:3。

2、青稞β-葡聚糖的降血脂功能評價

對實施例1中制備所得青稞β-葡聚糖進行降血脂體內(nèi)活性評價。

選取40只雄性昆明小鼠，體重18-22g，通過預(yù)防給藥的方式，進行判定，采取上午灌胃給藥(根據(jù)體重200mg/kg)，下午灌食高脂乳劑(乳劑由15%豬油和1.5%膽固醇等輔料制備而成)的方式，連續(xù)灌胃21天，最后，眼球取血后處死。提取小鼠肝臟組織，稱重，按照不同試劑盒要求測定這40只小鼠體內(nèi)總膽固醇(tc)、甘油三酯(tg)、高密度脂蛋白膽固醇(hdl-c)、低密度脂蛋白膽固醇(ldl-c)、小鼠肝臟中總膽固醇、甘油三酯和肝重系數(shù)指標(biāo)以及游離脂肪酸(ffa)的結(jié)果以及肝臟內(nèi)多種酶活性進行評價。試驗中分為空白組、模型組、實驗組和陽性藥對照組，其中陽性藥為辛伐他汀(20mg/kg)。具體結(jié)果見表2、表3、表4。

表2青稞β-葡聚糖對高脂血癥小鼠血脂的影響(n=10)

注:與正常組比較，^##p?0.01，^#p?0.05；與模型組比較**p?0.01，*p?0.05。

表3青稞β-葡聚糖對高脂血癥小鼠肝脂以及肝重系數(shù)的影響(n=10)

注:與正常組比較，^##p?0.01，^#p?0.05；與模型組比較**p?0.01，*p?0.05。

表4青稞β-葡聚糖對高脂血癥小鼠肝組織mda含量，sod和gsh-px活性的影響(n=10)

注:與正常組比較，^##p?0.01，^#p?0.05；與模型組比較**p?0.01，*p?0.05。

表2、表3、表4中，與正常組小鼠對比，模型組小鼠體內(nèi)多項參數(shù)存在顯著差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(^##p?0.01或^#p?0.05)，說明模型建立成功。表2中，實驗組小鼠與模型組對比，血清中tc、ldl-c以及hdl-c等指標(biāo)均有顯著改善，且存在顯著差異，存在統(tǒng)計學(xué)意義(**p?0.01或*p?0.05)，表3和表4中，實驗組小鼠與模型組相比，實驗組小鼠肝臟系數(shù)具有顯著改善(**p?0.01)，且肝臟內(nèi)sod以及gsh-px活性增加，機體抗氧化能力增強。

高血脂小鼠體內(nèi)實驗結(jié)果表明，青稞β-葡聚糖可以有效降低血清中tc、ldl-c和ffa的濃度,并且可以適當(dāng)增加小鼠血清中hdl-c,此外，青稞β-葡聚糖可以有效地增加實驗組小鼠體內(nèi)抗氧化酶活性，因而可確定，采用該工藝生產(chǎn)的青稞β-葡聚糖具有良好的降血脂作用以及抗氧化作用。

3、青稞β-葡聚糖的降血糖活性評價

對實施例1中制備所得青稞β-葡聚糖進行降血糖體內(nèi)活性評價試驗。

選用雄性昆明小鼠，體重18-22g，適應(yīng)性培養(yǎng)后隨機分為兩組，空白組和建模組，向建模組小鼠根據(jù)體重110mg/kg注射鏈脲佐菌素，特異性損傷小鼠胰腺，建立i型糖尿病模型，并將建模成功的小鼠隨機分為三組：模型組、陽性對照組以及實驗組。對實驗組小鼠體重采取灌胃給藥(200mg/kg)的方式給予β-葡聚糖，分別于0day、10day、20day、30day取血，測量空腹血糖濃度，并于培養(yǎng)第30天后，禁食，分別取0h、0.5h、2h測定口服葡萄糖耐受量，并于眼球取血后處死，提取小鼠肝臟組織和肌肉組織，稱重，按照不同試劑盒要求測定這40只小鼠空腹血糖濃度、肝糖原、肌糖原、口服葡萄糖耐受量(ogtt)進行測量。試驗中共設(shè)置4組，分別為空白組、模型組、實驗組和陽性藥對照組，其中,陽性藥為二甲雙胍(20mg/kg)。具體結(jié)果見表5、表6、表7。

表5青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠空腹血糖的影響(n=10)

注:與正常組比較，^##p?0.01，^#p?0.05；與模型組比較**p?0.01，*p?0.05。

表6青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠口服葡萄糖耐量的影響(n=10)

注:與正常組比較，^##p?0.01，^#p?0.05；與模型組比較**p?0.01，*p?0.05。

表7青稞β-葡聚糖對高血糖小鼠糖原的影響(n=10)

注:與正常組比較，^##p?0.01，^#p?0.05;與模型組比較**p?0.01，*p?0.05.

表5、表6、表7中，與正常組小鼠對比，模型組小鼠體內(nèi)多項參數(shù)存在顯著差異，具有統(tǒng)計學(xué)意義(^##p?0.01或^#p?0.05)，說明模型建立成功。表5中，與模型組小鼠相比，實驗組小鼠空腹血糖濃度得到有效控制(**p?0.01)，血糖耐受量得到有效改善(**p?0.01)；表6中，實驗組小鼠體內(nèi)的肌糖原和肝糖原含量顯著增多(**p?0.01).

動物實驗結(jié)果表明，青稞β-葡聚糖可以有效地降低高血糖小鼠的空腹血糖，改善口服血糖耐受量，促進肝糖原以及肌糖原的合成，從而可以進一步確認，采用該工藝制備的β-葡聚糖具有良好的降血糖的作用。

根據(jù)上述數(shù)據(jù)，可以判斷采取該工藝制備的青稞β-葡聚糖具有較好的降血脂以及降血糖活性。

實施例二

本實施案例按如下步驟展示一種青稞β-葡聚糖的制備工藝：

將青稞連帶麩皮磨粉，過40目篩；將青稞粉收集后，稱取80g青稞粉，加入400ml80%乙醇溶液，置于75℃回流2h。離心，除去乙醇溶液和色素，將沉淀置于干燥箱烘干。加水?dāng)嚢?，按照料水比?:20，向80g青稞粉中加入1600ml水溶液，使用20%na2co3調(diào)整ph至10，并加入12ml(約359u)耐高溫淀粉酶，在85℃條件下攪拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷卻至室溫，4500r/min，15min，分離后收集上清液，再加入適量耐高溫淀粉酶，85℃保持1-2h，選用0.1mol/l碘液作為指示劑，直至碘液不再變色，確認淀粉降解為單糖或寡糖；冷卻至室溫后，用hcl調(diào)整溶液ph至3，攪拌，靜置，沉淀蛋白；4500r/min，15min，離心得上清液，調(diào)整ph至7.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將體積濃縮至1/3，并于每50ml濃縮液中加入16.5g(nh4)2so4固體，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液充分溶解后，置于4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入250ml純水，充分加熱溶解；冷卻至室溫，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，充分攪拌后，置于4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入250ml純水，邊加熱邊攪拌，直至沉淀完全溶解；采用孔徑為3500da的卷式有機膜進行脫鹽處理，每隔1h換水，透析24h，用0.5mbacl2進行監(jiān)測，直至樣品溶液與bacl2溶液混合時不再產(chǎn)生白色沉淀；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒，收集上清液，將溶液濃縮為原來體積的1/5，冷凍干燥，得到3.5gβ-葡聚糖產(chǎn)品。

實施例三

本實施案例按如下步驟展示一種青稞β-葡聚糖的制備工藝：

將青稞連帶麩皮磨粉，過40目篩；將青稞粉收集后，稱取120g青稞粉，加入600ml80%乙醇溶液，置于75℃回流2h。離心，除去乙醇溶液和色素，將沉淀置于干燥箱烘干。加水?dāng)嚢?，按照料水比?:15，向120g青稞粉中加入1800ml水溶液，使用20%na2co3調(diào)整ph至10，并加入14ml(約408u)耐高溫淀粉酶，在90℃條件下攪拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷卻至室溫，4500r/min，15min，分離后收集上清液，再加入適量耐高溫淀粉酶，85℃保持1-2h，選用0.1mol/l碘液作為指示劑，直至碘液不再變色，確認淀粉降解為單糖或寡糖；冷卻至室溫后，用hcl調(diào)整溶液ph至2.5，攪拌，靜置，沉淀蛋白；4500r/min，15min，離心得上清液，調(diào)整ph至7.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將體積濃縮至1/3，并于每50ml濃縮液中加入12.5g(nh4)2so4固體，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液充分溶解后，置于4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入400ml純水，充分加熱溶解；冷卻至室溫，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，充分攪拌后，置于4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入400ml純水，邊加熱邊攪拌，直至沉淀完全溶解；采用孔徑為3500da的卷式有機膜進行脫鹽處理，每隔1h換水，透析24h，用0.5mbacl2進行監(jiān)測，直至樣品溶液與bacl2溶液混合時不再產(chǎn)生白色沉淀；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒，收集上清液，將溶液濃縮為原來體積的1/5，冷凍干燥，得到4.8gβ-葡聚糖產(chǎn)品。

實施例四

本實施案例按如下步驟展示一種青稞β-葡聚糖的制備工藝：

將青稞連帶麩皮磨粉，過60目篩；將青稞粉收集后，稱取140g青稞粉，加入840ml80%乙醇溶液，置于75℃回流2h。離心，除去乙醇溶液和色素，將沉淀置于干燥箱烘干。加水?dāng)嚢?，按照料水比?:10，向140g青稞粉中加入1400ml水溶液，使用20%na2co3調(diào)整ph至10，并加入19ml(約600u)耐高溫淀粉酶，在85℃條件下攪拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷卻至室溫，4500r/min，15min，分離后收集上清液，再加入適量耐高溫淀粉酶，85℃保持1-2h，選用0.1mol/l碘液作為指示劑，直至碘液不再變色，確認淀粉降解為單糖或寡糖；冷卻至室溫后，用hcl調(diào)整溶液ph至3，攪拌，靜置，沉淀蛋白；4500r/min，15min，離心得上清液，調(diào)整ph至7.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將體積濃縮至1/3，并于每50ml濃縮液中加入16.5g(nh4)2so4固體，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液充分溶解后，置于4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入500ml純水，充分加熱溶解；冷卻至室溫，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，充分攪拌后，置于4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入500ml純水，邊加熱邊攪拌，直至沉淀完全溶解；采用孔徑為3500da的卷式有機膜進行脫鹽處理，每隔1h換水，透析24h，用0.5mbacl2進行監(jiān)測，直至樣品溶液與bacl2溶液混合時不再產(chǎn)生白色沉淀；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒，收集上清液，將溶液濃縮為原來體積的1/5，冷凍干燥，得到5.2gβ-葡聚糖產(chǎn)品。

實施例五

本實施案例按如下步驟展示一種青稞β-葡聚糖的制備工藝：

將青稞連帶麩皮磨粉，過60目篩；將青稞粉收集后，稱取200g青稞粉，加入1000ml80%乙醇溶液，置于75℃回流2h。離心，除去乙醇溶液和色素，將沉淀置于干燥箱烘干。加水?dāng)嚢?，按照料水比?:15，向200g青稞粉中加入3000ml水溶液，使用20%na2co3調(diào)整ph至10，并加入24ml（約750u）耐高溫淀粉酶，在85℃條件下攪拌回流2h，4500r/min，15min，收集上清液；冷卻至室溫，4500r/min，15min，分離后收集上清液，再加入適量耐高溫淀粉酶，85℃保持1-2h，選用0.1mol/l碘液作為指示劑，直至碘液不再變色，確認淀粉降解為單糖或寡糖；冷卻至室溫后，用hcl調(diào)整溶液ph至3，攪拌，靜置，沉淀蛋白；4500r/min，15min，離心得上清液，調(diào)整ph至7.0，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，將體積濃縮至1/3，并于每50ml濃縮液中加入16.5g(nh4)2so4固體，邊加邊攪拌，使硫酸銨溶液充分溶解后，置于4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入600ml純水，充分加熱溶解；冷卻至室溫，緩慢加入3倍體積的無水乙醇，充分攪拌后，置于4℃，靜置，過夜；4500r/min，15min，收集沉淀，加入600ml純水，邊加熱邊攪拌，直至沉淀完全溶解；采用孔徑為3500da的卷式有機膜進行脫鹽處理，每隔1h換水，透析24h，用0.5mbacl2進行監(jiān)測，直至樣品溶液與bacl2溶液混合時不再產(chǎn)生白色沉淀；12000r/min，15min，去除溶液中可能存在的不溶性小顆粒，收集上清液，將溶液濃縮為原來體積的1/5，冷凍干燥，得到12.3gβ-葡聚糖產(chǎn)品。

綜上所述，本發(fā)明公開了一種青稞β-葡聚糖的制備工藝，通過高效溶出、硫酸銨沉淀、超濾膜過濾等關(guān)鍵工藝的改進，使得β-葡聚糖有較高的純度，純度達到95%以上，且色澤較好；得率較高，每100g干燥青稞粉中可提取3-10gβ-葡聚糖；結(jié)構(gòu)序列明確；以及具有良好的降血脂以及降血糖活性，可以用于高血脂以及糖尿病的治療，為開發(fā)治療高血脂以及糖尿病的新藥打下基礎(chǔ)，積極推動高血脂以及糖尿病天然藥物活性成分的研究開發(fā)。

應(yīng)說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的精神和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當(dāng)中。