本發(fā)明屬于煙草制備技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種煙草薄片加工過程中果膠的同時降解處理法。
背景技術(shù)：
造紙法煙草薄片（paper-processreconstitutedtobacco）是一種煙草資源再生利用的產(chǎn)品。它是利用一些煙草廢棄料、邊角料，如煙梗、煙葉碎片、煙末等為原料，經(jīng)過浸提、濃縮、分離、打漿、磨漿、抄造、烘干、加香工藝過程，制成煙葉薄片，用作卷煙填充物。造紙法煙草薄片，不僅在改善煙葉產(chǎn)品結(jié)構(gòu)強度、燃燒性能及降低卷煙的煙氣煙堿和焦油量等方面具有優(yōu)勢，同時還能降低煙葉單耗，節(jié)約生產(chǎn)成本，可以說是煙草工業(yè)近年最重要的成果之一。而近年來，生物技術(shù)與造紙法煙草薄片技術(shù)在生產(chǎn)中的結(jié)合應(yīng)用，不僅發(fā)揮了造紙法煙草薄片的工藝優(yōu)勢，而且利用生物技術(shù)有選擇地改變煙草化學(xué)成分，明顯改善了煙草薄片的品質(zhì)。
研究表明，煙草原料中的纖維素、木質(zhì)素、果膠和蛋白質(zhì)在高溫下均會產(chǎn)生芳烴類化合物。其中果膠是一種膠體性物質(zhì)，沉積在初生細胞壁和胞間層，并與纖維素、半纖維素、木質(zhì)素以及一些蛋白質(zhì)相互交聯(lián)。果膠在熱解過程中主要生成甲醇等有害物質(zhì)。果膠的去除不僅能夠減少這類物質(zhì)的生成，而且還能夠改變煙草細胞結(jié)構(gòu)，讓細胞變的更松散透氣，有利于提高煙草燃燒能力，減少熱解的發(fā)生。
現(xiàn)有技術(shù)中，針對煙草薄片中果膠類物質(zhì)的降解主要是采用傳統(tǒng)的果膠酶進行的。但是由于煙草薄片中果膠結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性和多樣性，而現(xiàn)有技術(shù)中的果膠酶普遍存在對于煙草薄片中果膠降解針對性不強、降解不夠充分、降解過程難以控制的缺陷，因而急需探討新的果膠酶及其在煙草薄片加工中的應(yīng)用。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
本發(fā)明目的在于提供一種利用特定菌株發(fā)酵制備的果膠酶，該果膠酶對于煙草薄片中的果膠具有較好針對性，利用該果膠酶可較好實現(xiàn)對煙草薄片加工過程中果膠的同時降解處理，進而改善煙草品質(zhì)。
本發(fā)明的技術(shù)方案具體如下所述。
一種小孢根霉華變種發(fā)酵制備的果膠酶，通過如下生產(chǎn)步驟制備獲得：
（1）菌種活化，從保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌株，接種到活化培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)2~3d左右；
所述發(fā)酵菌株具體為中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(cicc)保藏的保藏號為41410的小孢根霉華變種(rhizopusmicrosporusvar.chinensis)；該菌株為可公開獲得菌株；從保藏培養(yǎng)基挑取菌株后接種活化培養(yǎng)基時具體可采用劃線法接種；
所述活化培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基，pda培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備，具體為：馬鈴薯提取液1.0l（200g馬鈴薯），葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，ph自然；
（2）制備種子液，將步驟（1）中活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，24~28℃、120~180rmin搖床培養(yǎng)36~48h左右（優(yōu)選，26℃、160r/min培養(yǎng)48h），制備種子液；
所述種子培養(yǎng)基為：果膠3g/l，酵母粉15g/l，nano33.0g，mgso4?7h2o0.5g，kcl0.5g，feso4?4h2o0.01g，k2hpo41.0g，蒸餾水1.0l，ph=6.0～6.5；
（3）發(fā)酵培養(yǎng)，將步驟（2）中所制備的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，24~28℃、120~180rmin搖床培養(yǎng)4~24h以進一步發(fā)酵培養(yǎng)（優(yōu)選，27℃、180r/min搖床培養(yǎng)12h）；
將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時，接種量具體可按4%體積分數(shù)比例進行接種；
所述優(yōu)化后的發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠50g/l、酵母浸膏2.0g/l，ph=6.2；
（4）制備粗酶液，將步驟（3）中發(fā)酵液經(jīng)抽濾濾去菌體，再經(jīng)超濾濃縮即可獲得粗酶液，測定酶活后即可作為果膠酶進行應(yīng)用。
利用所述小孢根霉華變種發(fā)酵制備的果膠酶在煙草中的應(yīng)用，用于煙草薄片加工過程，用于降解煙草薄片原料中的果膠成分。
具體使用時，以上述步驟（4）所制備粗酶液直接應(yīng)用為例，將果膠酶粗酶液稀釋0~30倍后，以料液比計，在煙末萃取工段中，按煙末：稀釋后果膠酶粗酶液=1g：1~6ml的比例，將煙末的水混合液（或煙梗水混合液）與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，40~50℃、酶解2~6h。
優(yōu)選處理條件為，將果膠酶粗酶液稀釋10倍，以料液比計，針對煙末物料時，煙末：果膠酶粗酶液=1g：3ml的比例，50℃、酶解6h；針對煙梗物料時，煙梗：果膠酶粗酶液=1g：5ml的比例，50℃、酶解6h。
一種煙草薄片加工過程中果膠的同時降解處理法，具體包括如下步驟：
（1）制備粗酶液，即按照上述步驟（1）至步驟（4）制備粗酶液；稀釋0~30倍備用，
（2）按現(xiàn)有工藝制備煙草薄片，其中在煙末萃取工段中，以料液比計，按煙末：步驟（1）中稀釋后果膠酶粗酶液=1g：1~6ml的比例，將煙末的水混合液（或煙梗水混合液）與果膠酶粗酶液溶液混合均勻，40~50℃、酶解2~6h。
本發(fā)明的總體技術(shù)路線是：通過菌株篩選，篩選針對性用于煙草物料的發(fā)酵菌株，然后將特定菌株進行發(fā)酵，篩選優(yōu)化最佳發(fā)酵條件，獲得最高果膠酶酶活的粗酶液，然后將粗酶液直接用于煙草薄片原料處理以降低其果膠酶含量，通過優(yōu)化處理工藝，獲得最佳降解效果，從而改善煙草品質(zhì)。
初步試驗表明，本發(fā)明采用特定菌種發(fā)酵所得粗酶液的酶活最高可達2685.25u/ml，具有較好的應(yīng)用潛力。進一步用于煙草薄片原料處理后，可將煙草薄片中果膠含量由2.00%降低到1.45%。將處理后煙草薄片用于卷煙后，進一步的感官抽吸評價表明，添加有酶解后煙草薄片的卷煙樣品相較于未處理的樣品，卷煙香氣更加細膩，煙氣透發(fā)性更好，甜潤感有所增強且刺激性減輕，口感發(fā)澀程度減小，雜氣減少，勁頭足，且燃燒性更好，從而較好的改善了煙草的吸食品質(zhì)。
需要解釋的是，本申請中所述“同時處理法降解煙草果膠”是指對煙草薄片加工工藝中的煙末萃取和煙梗萃取兩個加工工段中煙草原料進行處理，通過分別加入發(fā)酵制備的果膠酶，同時降解上述原料中的果膠。因而總體而言，本申請與現(xiàn)有煙草薄片加工工藝結(jié)合較為緊密，可直接配合現(xiàn)有煙草薄片加工工藝使用，由于可同時降解處理煙末和煙梗中果膠成分，因而不需額外改動生產(chǎn)工藝，具有較好的適用性，結(jié)合其改進效果而言，具有一定的推廣應(yīng)用價值。
具體實施方式
下面結(jié)合實施例對本發(fā)明做進一步的解釋說明。在介紹具體實施例前，就下述實施例中果膠含量測定、果膠降解率的計算方法簡要介紹如下。
果膠含量測定
下述實施例中對于煙草薄片中的果膠含量采用咔唑比色法測定，具體測定步驟如下：
1、樣品預(yù)處理，取待測樣品（酶解處理后或未處理樣品），研碎，量取10ml或10g（精確到0.001g）樣品于250ml錐形瓶中，加入150ml加熱至沸騰的0.05mol/l的hcl溶液，裝上冷凝器，于90℃水浴中加熱回流1h，冷卻后把濾液移入250ml容量瓶中，加入2mol/l的naoh中和至ph=4，搖勻，收集濾液即得總果膠提取液，備用；
2、以半乳糖醛酸為標準品，咔唑比色法測定果膠含量，取步驟a中所得總果膠提取液1ml于含有6ml濃硫酸的試管中，搖勻；
85℃水浴加熱15min；冷卻，加入0.15%咔唑無水乙醇溶液0.3ml，搖勻，暗置30min；530nm下測吸光度；
3、根據(jù)咔唑比色法標準曲線和公式，求得待測液果膠含量；
所述公式為：果膠（%）=c×v×k×100/(w×106)；
其中，c：對照標準曲線求得的果膠提取稀釋液的果膠含量（μg/ml)；v：果膠提取液原液體積（ml）；k：果膠提取液稀釋倍數(shù)；w：樣品質(zhì)量（g）；106：質(zhì)量單位換算系數(shù)；
所述咔唑比色法標準曲線的繪制方法為：
首先準確稱取0.1000g半乳糖醛酸標準品于燒杯中，用少量蒸餾水溶解后轉(zhuǎn)移至100ml容量瓶中，用ph為3的鹽酸定容；
然后分別取0、1、2、3、4、5、6、7ml于8個100容量瓶中，用ph為3的hcl定容，得到濃度為0、10、20、30、40、50、60、70μg/ml的標準溶液；
最后以上述方法測定，然后繪制咔唑比色法的標準曲線。
果膠降解率計算
下述實施例中果膠降解率按以下公式計算：
ei=[（c0－ci）/c0]×100%；
其中，ei：果膠的降解率；c0：空白對照樣中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；ci：酶處理的煙草薄片中果膠水解生成的半乳糖醛酸的量；空白對照樣和酶處理的煙草薄片中果膠含量測定均按上述咔唑比色法進行測定。
酶活力檢測方法：參照miller(1959)方法。取0.4mll%果膠溶液于試管中，加入1.0mlph=5的0.04mol/lna2hpo4-0.02mol/l檸檬酸緩沖液，45℃水浴平衡5min；加入0.1ml適當稀釋的酶液，45℃反應(yīng)30min（空白對照組以煮沸失活的酶液代替），加入3.0mldns溶液終止反應(yīng)，沸水浴5min，冷卻，定容至15ml，于分光光度計540nm波長下測吸光度，得到反應(yīng)體系中半乳糖醛酸的量；
酶活力單位：1ml酶液或1g酶在45℃、ph5.0的條件下，每min分解底物產(chǎn)生lμg半乳糖醛酸的酶量定義為1單位聚半乳糖醛酸酶(pg)酶活；以u/ml表示；
酶活力計算公式：u=(c實驗-c對照)*n*1000*(v總/v酶)/t；
其中：n—酶液稀釋倍數(shù)，v總—反應(yīng)總體積，v酶—酶液體積，t—反應(yīng)時間（min）；
dns法標準曲線的繪制：
配置1mg/ml的半乳糖醛酸標準溶液；取1mg/ml半乳糖醛酸溶液0、0.2、0.4、0.6、0.8、1.0ml于試管中，補水至1ml，加dns試劑3ml，混合后于沸水中煮7min，冷卻后定容至15ml，于分光光度計540nm波長下測吸光度；以吸光度為縱坐標，半乳糖醛酸量為橫坐標，繪制標準曲線。
實施例1
本實施例所提供的利用小孢根霉華變種發(fā)酵所制備的果膠酶，通過如下生產(chǎn)步驟制備獲得。
（1）菌種活化，從保藏培養(yǎng)基上挑取發(fā)酵菌株，接種到活化培養(yǎng)基中活化培養(yǎng)3d左右；
所述發(fā)酵菌株具體為中國工業(yè)微生物菌種保藏中心(cicc)保藏的保藏號為41410的小孢根霉華變種(rhizopusmicrosporusvar.chinensis)；本實施例中所用菌株從對應(yīng)保藏單位購買獲得；
所述活化培養(yǎng)基為pda培養(yǎng)基；從保藏培養(yǎng)基挑取菌株后接種活化培養(yǎng)基時具體采用劃線法接種；
所述pda培養(yǎng)基按常規(guī)方法制備，具體為：馬鈴薯提取液1.0l，葡萄糖20.0g，瓊脂15.0g，ph自然；
所述馬鈴薯提取液制備方法為：取去皮馬鈴薯200g，切成小塊，加水1.0l煮沸30min，濾去馬鈴薯塊，將濾液補足至1.0l，121℃滅菌即可。
（2）制備種子液，將步驟（1）中活化后的菌種接種到種子培養(yǎng)基中，27℃、180r/min搖床培養(yǎng)48h，制備種子液；
制備小孢根霉華變種種子液所用小孢根霉華變種種子培養(yǎng)基配方為：果膠3g/l，酵母粉15g/l，nano33.0g，mgso4?7h2o0.5g，kcl0.5g，feso4?4h2o0.01g，k2hpo41.0g，蒸餾水1.0l，ph=6.0～6.5；
具體裝液量為：100/250ml錐形瓶。
從活化培養(yǎng)基中挑取菌株時，具體按如下方法進行：
用打孔器在活化培養(yǎng)基平板上靠近菌株生長邊緣的位置取兩塊0.5cm2的、長滿新生菌絲的接種塊，再接種于種子培養(yǎng)基中；
還需解釋的是，在搖床發(fā)酵培養(yǎng)結(jié)束后后，可加入滅菌的磁珠和適量的玻璃珠，使用磁力攪拌器攪拌2h左右，以使將培養(yǎng)物打碎，便于作為種子液接種用于進一步發(fā)酵培養(yǎng)擴增使用。
（3）發(fā)酵培養(yǎng)，將步驟（2）中所制備的種子液接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，27℃、180r/min搖床培養(yǎng)12h以進一步發(fā)酵培養(yǎng)；
將種子液接種發(fā)酵培養(yǎng)基時，接種量具體按4%體積分數(shù)比例進行接種；
所述發(fā)酵培養(yǎng)基配方為：果膠50g/l、酵母浸膏2.0g/l，ph=6.2。
（4）制備粗酶液，將步驟（3）中發(fā)酵液經(jīng)抽濾濾去菌體，再經(jīng)超濾濃縮即可獲得粗酶液，測定酶活后即可作為果膠酶進行應(yīng)用，其酶活為2685.25u/ml。
實施例2
以許昌煙草薄片廠所提供的煙草薄片原料（包括煙梗和煙末）為例，利用實施例1中所制備果膠酶粗酶液（酶活為2685.25u/ml，理論而言，實施例1中所制備任意酶活的粗酶液均可用于降解果膠應(yīng)用，但為確定較好降解條件及對煙草實際改善效果，因而僅以實施例1所制備的酶活為2685.25u/ml的粗酶液為例進行實驗），同時降解處理煙末和煙梗兩個原料內(nèi)的果膠成分，具體過程介紹如下。
將實施例1所制備果膠酶粗酶液稀釋10倍，按料液比，針對煙末物料，煙末：果膠酶粗酶液=1g：3ml，50℃、酶解6h；針對煙梗物料，煙梗：果膠酶粗酶液=1g：5ml，50℃、酶解6h。
酶解結(jié)束后，將處理后的煙草薄片原料，按照生產(chǎn)工藝制成煙草薄片，然后測定其果膠含量。
以失活酶液（將粗酶液煮沸失活）作為對照組，同樣操作方式下，制備對照樣品。
最終計算表明：果膠降解率為1.45%。
為進一步檢測酶解處理后煙草薄片對于煙草吸食效果的改進程度，以上述酶解處理處理后煙草薄片為例，發(fā)明人對其進行了實際卷煙抽吸實驗，相關(guān)實驗過程簡要介紹如下。
將酶解處理后煙草薄片在70℃條件下進行適當烘干（至濕度65%）后，切絲，然后置于恒溫恒濕箱內(nèi)平衡（相對濕度(60±5)%，溫度(22±2)℃）48h；
按煙絲重量15%（即稱取0.12g樣品）與平衡后85%的云煙87均勻混合后按現(xiàn)有技術(shù)制備抽吸用卷煙，此即為試驗組卷煙。
相同條件及相同方法下采用滅活酶處理的煙草薄片所制備的卷煙記為對照組，以蒸餾水處理的煙草薄片所制備的卷煙組記為空白組。
將各組卷煙樣品（每支煙只總重0.80±0.01g）在溫度(22±2)℃、相對濕度(60±5)%的恒溫恒濕箱中平衡24h后，依據(jù)國家現(xiàn)行成品煙評析標準gb5606.4-2005對卷煙進行質(zhì)量評吸鑒定和評價。
具體評價結(jié)果如下表所示：
從上述評價結(jié)果可以看出，酶解處理后的煙草薄片添加與卷煙后，可使卷煙的煙氣透發(fā)性更好，同時能夠增加甜潤感且減輕刺激性，口感發(fā)澀程度減小，余味純凈舒適，勁頭足，卷煙的吸食品質(zhì)得到了較好改善。