本發(fā)明涉及藥物化學技術領域，具體為一種3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑及其制備方法和用途。本發(fā)明也涉及制備目標化合物的中間體化合物。

背景技術：

微管蛋白是一類含有多個成員的蛋白質家族，包括α、β、γ、δ、ε、ζ、η七種微管蛋白。其中，α-微管蛋白和β-微管蛋白是構成微管的主要成分。微管是真核細胞的主要骨架成分，在維持細胞形態(tài)、蛋白質轉運、信號傳導和有絲分裂過程中起到關鍵作用，因此成為了治療癌癥的一個有效的靶點。而作用于微管蛋白的微管靶向藥物，成為近年來進行較多研究的有效的抗腫瘤藥物。已知的微觀蛋白抑制劑通過至少四個結合位點與微管蛋白相互作用，分別是laulimalide、紫杉醇/埃博霉素、長春堿和秋水仙堿位點。與已經成功用于癌癥臨床治療的紫衫醇類和長春堿類相比，秋水仙堿(colchicine)本身雖然是有效的化合物，但在有效藥物濃度下被其對正常組織的的毒性所限制，僅被批準用于家族性地中海、發(fā)燒和急性痛風治療。研究發(fā)現，作用于秋水仙堿位點的抑制劑通過阻止新血管生成或者破壞腫瘤現有的脈管系統(tǒng)阻止微管聚合，破壞腫瘤細胞的骨架，從而阻斷腫瘤的血液供給，使腫瘤細胞因缺乏營養(yǎng)而凋亡。另外，由于秋水仙堿位點在微管蛋白中所占體積較小，且相應抑制劑的結構較為簡單，此類微管蛋白抑制劑的研究成為一個新方向。

許多微管蛋白抑制劑是基于天然產物而得到的。combretastatin一族是pettit小組從南非植物combretumcaffrum中分離出來的天然化合物。combretastatina-4(ca-4)是已知的具有強效抑制微管蛋白活性和細胞毒性的天然微管蛋白抑制劑。研究證明，ca-4通過與秋水仙堿競爭微管蛋白上的結合位點來達到抑制微管蛋白的聚合。雖然ca-4具有廣譜的體外抗腫瘤活性，但由于水溶性差，生物利用度低，且在儲存和體內代謝過程中其順式活性構型容易異化成無活性的反式構型，限制了它在臨床上的廣泛應用。直到20世紀90年代，ca-4的磷酸鹽化極大的改善了這些性質，使其進入了更深入的臨床試驗。

技術實現要素：

本發(fā)明的一個目的是提供一種3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑，以微管蛋白中的秋水仙堿結合位點為靶標。

本發(fā)明的另一個目的是提供一種制備上述化合物的中間體化合物。

本發(fā)明還提供具有良好抗腫瘤活性的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑。

為實現上述目的，本發(fā)明采用下述技術方案：

本發(fā)明提供一種3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑，其具有通式i所示結構：

其中：r1是h,f,cl,br,oh,ch3,och3,no2,och2ch3或och(ch3)2,r2是ch3，och3，och2ch3或och(ch3)2，且r1為h時，r2不為och3。優(yōu)選的r1為h或f,r2為och3，或者och2ch3。更優(yōu)選的，r1為h，同時r2為och2ch3；或者r1為f，同時r2為och3。

本發(fā)明還提供一種上述的微管蛋白抑制劑的制備方法，其化學反應方程式如下：

具體步驟如下：

(1)在催化劑三氟乙酸銀的存在下，將碘單質溶于有機溶劑中，在室溫下避光,與式1所示取代苯酚類化合物反應獲得式2所示碘化產物；

(2)將式2所示碘化產物在乙酸酐和有機堿的作用下進行乙酰化，獲得式3所示的乙酰化產物；

(3)將式3所示的乙?；a物在堿、pd(pph3)2cl2和cui的作用下，與4-r2取代苯乙炔發(fā)生sonogashira偶聯反應，惰性氣氛保護，95～105℃的溫度下下反應5～7小時得式4所示的偶聯產物；

(4)堿性條件下，將式4所示的偶聯產物溶于甲醇中，加熱回流可得式5所示苯并呋喃類化合物；

(5)將式5所示苯并呋喃類化合物溶于無水二氯甲烷中，在無水四氯化錫作用下，與3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯發(fā)生傅克?；磻玫酵ㄊ絠所示結構的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑。

上述步驟(2)中，有機堿為吡啶；步驟(3)中，采用的堿為三乙胺；步驟(4)中，所用的堿為碳酸鉀。

上述步驟(3)中，式3所示乙酰化產物、4-r2取代苯乙炔、堿、pd(pph3)2cl2和cui的投料摩爾比為1:1.3:2:0.05:0.05。

上述步驟(5)中，式5所示苯并呋喃類化合物、3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯和無水四氯化錫的投料摩爾比為1:1.2:1。

本發(fā)明進一步提供一種用于制備3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑的中間體化合物，其具有如式4所示的結構：

其中：r1是h,f,cl,br,oh,ch3,och3,no2,och2ch3或och(ch3)2,r2是ch3，och3，och2ch3或och(ch3)2，且r1為h時，r2不為och3。優(yōu)選的，r1為h或f,r2為och3，或者och2ch3。

本發(fā)明還進一步提供上述的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑在制備肺癌、胃癌、肝癌、結腸癌、宮頸癌和乳腺癌藥物方面的用途。

和現有技術相比，本發(fā)明的有益效果在于：

本發(fā)明合成的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑具有優(yōu)秀的微管蛋白抑制活性，作用機制與秋水仙堿相似，能夠抑制微管蛋白聚合。

本發(fā)明合成的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑，對人肺癌細胞a549，人胃癌細胞mgc-803，人肝癌細胞hepg2，人結腸癌細胞hct-116，人宮頸癌細胞hela，人乳腺癌細胞mcf-7有很強的增殖抑制活性。

具體實施方式

結合實施例對本發(fā)明作進一步的說明，應該說明的是，下述說明僅是為了解釋本發(fā)明，并不對其內容進行限定。

核磁共振¹hnmr,¹³cnmr,¹⁹fnmr由布魯克avanceiii型500mhz核磁共振儀測定，使用氘代cdcl3或氘代dmso作溶劑，tms為內標，化學位移δ單位為ppm，耦合常數j的單位為hz。高分辨質譜由brukersolarix70ft-ms測定。

本發(fā)明主要針對3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑進行設計與合成。首先利用計算機輔助藥物設計，通過模型建立、分子對接、分子動力學模擬手段得到新化合物的模擬結果，其中最具參考價值的是運用分子動力學模擬等方法得到的化合物與微管蛋白復合物的吉布斯結合自由能。就combretastatina-4而言，其結合自由能的預測值為-37.57±2.62kcal·mol^-1(文獻：med.chem.commun.,2014,5,766-782)，以之為參考，本發(fā)明實施例中設計出結合自由能更小的新化合物：結構式1和結構式2其結合自由能結果分別為-43.45、-42.03kcal·mol^-1。結合自由能的結果越小，則說明化合物的活性可能更高。

實施例1：結構式1化合物的制備

(1)250ml用錫紙包裹的圓底燒瓶中，i2(5.1g,20.0mmol)溶于氯仿(150ml)，并攪拌超過1.5小時。另，化合物式1(r1＝h)(20.0mmol)置入250ml用錫紙包裹的圓底燒瓶，加入三氟乙酸銀agotfa(4.5g,20.0mmol)。將氯仿溶液緩慢(約2-3小時)加入錫紙包裹的燒瓶中，反應室溫下攪拌24小時結束。過濾，并用氯仿洗滌殘渣。然后用飽和na2s2o3溶液，飽和nahco3溶液，飽和食鹽水萃取，所得有機相用無水na2so4干燥。過濾，減壓濃縮后進行柱層析分離(用ch2cl2作洗脫劑,柱層析避光)。得到產物，2-碘-5-甲氧基苯酚(式2，r1＝h)。白色固體，產率52.87％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.49(d,j＝9.0hz,1h),6.60(d,j＝2.5hz,1h),6.34(dd,j＝6.0,2.5hz,1h),5.31(s,1h),3.77(s,3h).

(2)將步驟(1)得到的化合物式2(r1＝h)(7.46mmol)溶于無水ch2cl2，加吡啶(1.2g,14.92mmol)，在0℃下逐滴地加乙酸酐(1.54g,14.92mmol)，然后室溫避光攪拌4小時，反應結束。倒入ch2cl2，加飽和nahco3溶液，加食鹽水萃取。有機相用無水na2so4干燥。減壓濃縮后，用pet-ether/etoac進行柱層析分離。得到產物，2-碘-5-甲氧基乙酸苯酯(式3，r1＝h)。無色液體，產率78.55％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.66(d,j＝9.0hz,1h),6.69(d,j＝3.0hz,1h),6.60(dd,j＝6.0,2.5hz,1h),3.77(s,3h),2.36(s,3h).

(3)n2氛圍下將步驟(2)所得化合物式3(r1＝h)(5.0mmol)溶于dmf(10ml)，然后加入4-乙氧基苯乙炔(950mg,6.5mmol)，三乙胺(1.02g,10.0mmol)，以及催化劑cui(50mg,0.25mmol)和pd(pph3)2cl2(175mg,0.25mmol)。加熱至100℃，反應6小時。tlc跟蹤反應。結束后，體系緩慢冷卻至室溫，用etoac和水萃取。合并有機相，無水na2so4干燥，過濾，減壓濃縮后用pet-ether/etoac進行柱層析分離，得到產物：2-((4-乙氧基苯基)乙炔基)-5-甲氧基乙酸苯酯(式4，r1＝h，r2＝och2ch3)。

黃色固體，產率46.08％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.46(d,j＝8.5hz,1h),7.40(d,j＝8.5hz,2h),6.85(d,j＝8.5hz,2h),6.78(dd,j＝6.0,2.5hz,1h),6.67(d,j＝2.5hz,1h),4.05(q,j＝7.0hz,2h),3.82(s,3h),2.36(s,3h),1.42(t,j＝7.0hz,3h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝168.77,160.28,159.02,152.58,133.40,132.84,115.23,114.54,112.01,109.89,108.26,92.87,82.84,63.53,55.56,20.89,14.76.esi-hrms(m/z):calculatedforc19h18o4(m+h)⁺,311.12386,found:311.12381.

(4)將步驟(3)得到的化合物式4(r1＝h)(1.6mmol)溶于甲醇(10ml)，溶解均勻后，加無水k2co3(553mg,4.0mmol)，加熱到60℃，攪拌回流16小時。反應結束后，過量甲醇用減壓旋蒸除去，得黃色固體。用etoac溶解固體，并用水萃取，無水na2so4干燥所得有機相。過濾，減壓濃縮，再得黃色固體。用petether:etoac＝30:1進行柱層析可得產物，2-(4-乙氧基苯基)-6-甲氧基苯并呋喃(式5，r1＝h，r2＝och2ch3)。

白色固體，產率40.25％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.73(d,j＝9.0hz,2h),7.41(d,j＝8.0hz,1h),7.06(s,1h),6.96(d,j＝9.0hz,2h),6.86(dd,j＝6.0,2.5hz,1h),6.80(s,1h),4.09(q,j＝7.0hz,2h),3.87(s,3h),1.45(t,j＝7.0hz,3h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝159.03,157.70,155.68,155.39,125.93,123.47,122.88,120.64,114.77,111.67,99.42,95.94,63.55,55.75,14.85.esi-hrms(m/z):calculatedforc17h16o3(m+h)⁺,268.10994,found:268.10936.

(5)將步驟(4)得到的化合物式5(r1＝h，r2＝och2ch3)(50mg)溶于無水ch2cl2(2ml)中，加入3,4,5-三甲氧基苯甲酰氯(1.2eq)，然后在0℃逐滴加入無水sncl4(1.0eq)。于室溫下反應3小時，tlc跟蹤。反應結束時，用碎冰塊淬滅，再攪拌1小時。分離出有機相，并用ch2cl2萃取水相。用無水na2so4干燥合并的有機相，過濾，減壓濃縮，用pet-ether/etoac進行柱層析分離純化，可得目標產物，2-(4-乙氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-6-甲氧基苯并呋喃(結構式1，r1＝h，r2＝och2ch3)。

黃綠色固體，產率70.76％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.55–7.53(m,3h),7.12(s,2h),7.08(d,j＝2.0hz,1h),6.91(dd,j＝6.5,2.0hz,1h),6.79(d,j＝9.0hz,2h),4.00(q,j＝7.0hz,2h),3.88(s,3h),3.86(s,3h),3.69(s,6h),1.39(t,j＝7.0hz,3h).¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝190.90,159.99,158.50,157.34,154.69,152.86,142.39,132.68,129.84,122.21,121.99,121.70,114.54,114.35,112.60,107.42,95.65,63.55,60.93,56.10,55.76,14.66.esi-hrms(m/z):calculatedforc27h26o7(m+h)⁺,463.17121,found:463.17670.

實施例2：結構式2化合物的制備

(1)苯酚類原料為式1(r1＝f)，步驟同實施例1中的步驟(1)。得到產物2-碘-4-氟-5-甲氧基苯酚(式2，r1＝f)。

白色固體，產率39.92％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.31(d,j＝10hz,1h),6.67(d,j＝7.5hz,1h),5.13-5.12(m,1h),3.85(s,3h).¹⁹fnmr(470mhz,cdcl3)δ＝-143.08.¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝151.73(d,j＝2.5hz),149.2,146.82(d,j＝240.6hz),123.70(d,j＝22.5hz),100.30,70.97(d,j＝7.5hz),56.27.esi-hrms(m/z):calculatedforc7h6fio2(m+h)⁺,268.94301,found:268.94769.

(2)步驟同實施例1中的步驟(2)。得到產物2-碘-4-氟-5-甲氧基乙酸苯酯(式3，r1＝f)。

白色晶體，產率81.28％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.47(d,j＝10hz,1h),6.74(d,j＝7.5hz,1h),3.85(s,3h),2.35(s,3h).¹⁹fnmr(470mhz,cdcl3)δ＝-135.80.¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝168.57,150.05(d,j＝247.5hz),148.50(d,j＝11.3hz),147.60(d,j＝2.5hz),125.22(d,j＝21.3hz),108.28,99.99,56.43,21.15.esi-hrms(m/z):calculatedforc9h8fio3(m+h)⁺,310.95357,found:310.95754.

(3)步驟同實施例1中的步驟(3)。得到產物2-((4-甲氧基苯基)乙炔基)-4-氟-5-甲氧基乙酸苯酯(式4，r1＝f，r2＝och3)。

黃色固體，產率32.80％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.43(d,j＝9.0hz,2h),7.27(d,j＝11.5hz,1h),6.89(d,j＝8.5hz,2h),6.75(d,j＝7.5hz,1h),3.90(s,3h),3.84(s,3h),2.37(s,3h).¹⁹fnmr(470mhz,cdcl3)δ＝-137.90.¹³cnmr(125hz,cdcl3)δ＝168.81,159.88,149.6(d,j＝243.8hz),148.24(d,j＝12.5hz),147.99(d,j＝3.8hz),132.94,119.00(d,j＝21.3hz),114.91,114.09,109.59(d,j＝10hz),107.86,93.63,81.94,56.38,55.31,20.77.esi-hrms(m/z):calculatedforc18h15fo4(m+na)⁺,337.09544,found:337.08508.

(4)后處理得到的黃色固體用正己烷，etoac洗脫，其余步驟同實施例1中的步驟(4)，可得產物2-(4-甲氧基苯基)-5-氟-6-甲氧基苯并呋喃(式5，r1＝f，r2＝och3)

白色固體，產率25.25％。¹hnmr(500mhz,dmso)δ＝7.79(d,j＝9.0hz,2h),7.49(d,j＝7.0hz,1h),7.45(d,j＝11.0hz,1h),7.17(s,1h),7.06(d,j＝8.5hz,2h),3.90(s,3h),3.82(s,3h).¹⁹fnmr(470mhz,dmso)δ＝-140.21.¹³cnmr(125mhz,dmso)δ＝160.05,156.03,150.84,149.80(d,j＝236.3hz),145.83(d,j＝13.8hz),126.29,122.96,121.40(d,j＝10.0hz),115.00,107.03(d,j＝22.5hz),100.68,97.60,56.93,55.74.esi-hrms(m/z):calculatedforc16h13fo3(m+h)⁺,273.08823,found:273.09217.

(5)步驟同實施例1中的步驟(5)，得到目標產物2-(4-甲氧基苯基)-3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-5-氟-6-甲氧基苯并呋喃(結構式2，r1＝f，r2＝och3)。

黃綠色固體，產率70.07％。¹hnmr(500mhz,cdcl3)δ＝7.50(d,j＝8.5hz,2h),7.38(d,j＝10.5hz,1h),7.14(d,j＝6.5hz,1h),7.08(s,2h),6.79(d,j＝8.5hz,2h),3.94(s,3h),3.85(s,3h),3.76(s,3h),3.68(s,6h).¹⁹fnmr(470mhz,cdcl3)δ＝-138.74.¹³cnmr(125mhz,cdcl3)δ＝190.41,160.76,158.10,152.91,150.58(d,j＝240hz),149.85,146.81(d,j＝13.8hz),142.60,132.39,129.92,122.14,120.79(d,j＝8.8hz),114.74(d,j＝3.8hz),113.90,107.60,107.42,96.29,60.93,56.61,56.12,55.32.esi-hrms(m/z):calculatedforc26h23fo7(m+h)⁺,467.14614,found:467.15066.

實施例3：抗增殖實驗

1.實驗方法

取活細胞比例達90％以上的細胞進行實驗。細胞增殖抑制試驗采用enogenecell^tmcountingkit-8(cck-8)細胞活力檢測試劑盒。細胞消化、計數、制成濃度為1×105個/ml的細胞懸液，96孔板中每孔加入100μl細胞懸液(每孔1×104個細胞)；96孔板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24小時；每孔加入100μl相應的含藥物的培養(yǎng)基，同時設立陰性對照組，溶媒對照組，陽性對照組，每組5復孔；96孔板置于37℃，5％co2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)72小時后；每孔加入10μlcck-8溶液,將培養(yǎng)板在培養(yǎng)箱內孵育4小時，用酶標儀測定在450nm處的od值，計算結構式1、結構式2以及ca-4陽性對照對人肺癌細胞a549、人結腸癌細胞hct-116、人宮頸癌細胞hela、人肝癌細胞hepg2、人胃癌細胞mgc-803、人乳腺癌細胞mcf-7等細胞的抑制率及ic50值。

2.實驗結果

表1本發(fā)明化合物和陽性對照ca-4(combretastatina-4)對不同腫瘤細胞的抑制活性

在本發(fā)明化合物結構式1、結構式2和陽性對照ca-4對6種癌細胞的抗腫瘤活性中，化合物結構式1表現出了除hepg2細胞外，與陽性對照ca-4相當的抑制活性。結構式1的抑制活性是ca-4活性的12.2倍，超過一個數量級。化合物結構式2，在a549、hela細胞的抑制活性上與ca-4相當，在hct-116、mgc-803和mcf-7細胞的抑制活性比ca-4要差，僅在hepg2細胞的抑制活性上是ca-4活性的3.8倍。結構式1對六種癌細胞的抑制活性都比結構式2的活性要好。除hepg2細胞外，結構式1對其余5種癌細胞的抑制活性是結構式2活性的5倍還要多。說明本發(fā)明的有益效果在于制備的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑對癌癥細胞有著強效的增殖抑制活性。

實施例4：微管蛋白聚合實驗

1.實驗方法

抑制微管蛋白聚合活性測試由濟南華維醫(yī)藥科技有限公司采用豬腦微管蛋白進行抑制活性測試。

2.實驗結果

表2本發(fā)明化合物和陽性對照ca-4對微管蛋白抑制活性

從表2可以看到本發(fā)明化合物結構式1的微管蛋白抑制活性為0.86μm，與陽性參照ca-4的活性(0.88μm)相當?；衔锝Y構式2的微管蛋白活性則超過了200μm。說明本發(fā)明的有益效果在于制備的3-(3,4,5-三甲氧基苯甲酰)-苯并呋喃類微管蛋白抑制劑具有優(yōu)秀的微管蛋白抑制活性。