本發(fā)明涉及基因檢測(cè)領(lǐng)域，特別是涉及融合基因的測(cè)序檢測(cè)，更具體地說，是涉及融合基因的dna測(cè)序文庫(kù)的制備，以及使用該dna測(cè)序文庫(kù)進(jìn)行融合基因的高通量測(cè)序檢測(cè)的方法。

背景技術(shù)：

自20世紀(jì)80年代早期第一個(gè)融合基因(bcr/abl1)被檢測(cè)證實(shí)，融合基因已成為多個(gè)癌種的重要標(biāo)志，例如：bcr/abl1用于檢測(cè)慢性骨髓性白血?。籩ml4/alk用于檢測(cè)惡性肺腺癌；tmprss2/erg用于檢測(cè)前列腺癌，等等。

21世紀(jì)開始，隨著靶向藥物的興起，癌癥治療藥物，尤其非小細(xì)胞肺癌(nsclc)的治療藥物，也開始使用融合基因所在的代謝通路。例如，2011年克唑替尼獲得fda許可用于alk和ros1基因融合的治療；2015年艾樂替尼獲得fda許可用于alk基因融合的治療；索拉非尼和舒尼替尼獲得ret基因融合的治療許可。

在惡性腫瘤精準(zhǔn)檢測(cè)及個(gè)性化治療概念被提出的今天，為了避免藥物禁忌和耐受引起無效治療，耽誤寶貴的治療時(shí)間，對(duì)于融合基因的有效特異檢測(cè)成為臨床醫(yī)師給藥的重要依據(jù)。早期的融合基因檢測(cè)是在傳統(tǒng)組織活檢的基礎(chǔ)上，采用熒光原位雜交、染色體條帶分析以及rt-pcr分析技術(shù)來確認(rèn)患者的腫瘤細(xì)胞是否發(fā)生了特定基因的基因融合。但是這些早期的細(xì)胞學(xué)及分子生物學(xué)技術(shù)對(duì)于融合基因的檢測(cè)存在以下缺陷：1)檢測(cè)時(shí)間久；2)假陽性率偏高；3)檢測(cè)技術(shù)要求高，需要熟練有經(jīng)驗(yàn)的檢測(cè)人員，不利于標(biāo)準(zhǔn)化；4)在融合基因基因型細(xì)胞在癌組織中含量少的情況下，無法有效檢出。隨著ngs(高通量測(cè)序)技術(shù)的日益成熟，并全面進(jìn)入臨床基因檢測(cè)領(lǐng)域，上述問題得到了有效解決。ngs檢測(cè)技術(shù)具有靈敏度、特異性高，檢測(cè)樣本dna需要量少，以及技術(shù)成熟、操作簡(jiǎn)便快速等一系列優(yōu)點(diǎn)，在技術(shù)應(yīng)用成本降低和通量不斷增高的發(fā)展背景下，ngs技術(shù)成為融合基因檢測(cè)的主流平臺(tái)。

對(duì)于用測(cè)序或pcr方法檢測(cè)融合基因，最為直接的方式是提取組織樣本的rna，通過反轉(zhuǎn)錄技術(shù)合成cdna，捕獲發(fā)生融合的外顯子來分析完成。這樣的方式是基于在基因組dna層次，兩個(gè)基因的融合點(diǎn)都發(fā)生融合的外顯子序列間的內(nèi)含子序列區(qū)域，而這個(gè)區(qū)域可能>1kb，即使是讀長(zhǎng)較長(zhǎng)的一代測(cè)序技術(shù)，也無法有效覆蓋(ngs測(cè)序技術(shù)的讀長(zhǎng)一般在100-400bp)，無法直接分析融合的內(nèi)含子區(qū)域；有些基因融合的融合點(diǎn)的位置僅僅在cosmic數(shù)據(jù)庫(kù)中有報(bào)導(dǎo)的就超過20個(gè)，無法確認(rèn)融合位置的位置樣本，也不可能通過特異pcr來富集融合位置的序列用于測(cè)序，而發(fā)生剪切后的成熟融合基因rna的兩側(cè)序列則是已知的，可以通過pcr擴(kuò)增富集長(zhǎng)度小于200bp的序列，用于ngs高通量測(cè)序?；谝陨显?，目前主流的融合基因測(cè)序檢測(cè)技術(shù)是基于rna的。但是，隨著液態(tài)活檢概念的引入及其優(yōu)勢(shì)性，基于rna的融合基因檢測(cè)方法突顯了其局限性。

液態(tài)活檢技術(shù)，是指僅提取患者的血漿或尿液中游離的腫瘤dna(ctdna，circulatingtumordna)，通過基因捕獲技術(shù)來快速檢測(cè)腫瘤細(xì)胞基因型。在腫瘤細(xì)胞的生活周期中，會(huì)發(fā)生細(xì)胞死亡(發(fā)生的多種原因，此處不再贅述)，從而將內(nèi)部核酸物質(zhì)釋放出來，并進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)或排泄系統(tǒng)，當(dāng)然這里也存在健康細(xì)胞的核酸，常規(guī)情況下每毫升血漿中游離dna的得率是5-20ng，這樣少量的游離dna中，ctdna的含量可能只有0.1-5％，而正因?yàn)楦哽`敏的ngs技術(shù)的應(yīng)用，使檢測(cè)ctdna成為可能?？梢钥吹揭簯B(tài)活檢技術(shù)相比傳統(tǒng)組織活檢具有多種優(yōu)勢(shì)：1)對(duì)患者侵害??；2)可多次取樣監(jiān)測(cè)；3)無需對(duì)取樣進(jìn)行病理區(qū)分。因此，各種腫瘤細(xì)胞的檢測(cè)技術(shù)都紛紛改進(jìn)，以適用于液態(tài)活檢。

然而，相比于ctdna，ctrna的碎片化程度更為嚴(yán)重，一般在10-25bp(ctdna的碎片化程度一般在150-200bp)，因此，ctrna在現(xiàn)有技術(shù)下并不適合用于融合基因的檢測(cè)，這使得基于rna的融合基因檢測(cè)很難在液態(tài)活檢中應(yīng)用。

此外，基于rna的融合基因檢測(cè)還面臨著大部分患者很難接受多次穿刺取樣，只能取得病理檢測(cè)剩余的ffpe(福爾馬林固定石蠟包埋)樣本的問題。ffpe樣本由于甲醛固定的原因，其中的rna已經(jīng)發(fā)生了嚴(yán)重的降解，很難提供檢測(cè)需要的足夠長(zhǎng)度的rna片段。

目前，基于dna的融合基因測(cè)序方法是通過在基因組文庫(kù)中用探針捕獲融合基因區(qū)域來進(jìn)行鑒定的，這種方法的優(yōu)點(diǎn)是目的性強(qiáng)，可以節(jié)約數(shù)據(jù)量和成本；缺點(diǎn)是容易脫靶，尤其是在液態(tài)活檢中檢測(cè)游離dna時(shí)，有效數(shù)據(jù)比例低，需要提高起始dna量和測(cè)序數(shù)據(jù)量，從而導(dǎo)致成本高，操作時(shí)間長(zhǎng)，操作難度高，甚至影響檢測(cè)。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之一是提供一種基于dna的融合基因定量測(cè)序建庫(kù)方法，該方法建庫(kù)時(shí)間短，成本低，可應(yīng)用于液態(tài)活檢。

為解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的基于dna的融合基因定量測(cè)序建庫(kù)方法，包括以下步驟：

1)構(gòu)建基因組片段化dna文庫(kù)，并純化；

2)以步驟1)純化后的dna文庫(kù)為模板，通過pcr擴(kuò)增反應(yīng)捕獲融合基因發(fā)生區(qū)域，對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化，并富集包含有引物特異片段的序列；

3)以步驟2)所得產(chǎn)物為模板，用巢式pcr擴(kuò)增反應(yīng)捕獲包含有融合基因的目的片段；

4)用步驟3)所得產(chǎn)物構(gòu)建用于高通量測(cè)序的dna測(cè)序文庫(kù)。

上述步驟1)進(jìn)一步包括：

末端修復(fù)及加a尾的步驟；

在末端修復(fù)及加a尾產(chǎn)物上連接文庫(kù)接頭，并對(duì)接頭連接產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟；

以純化后的接頭連接產(chǎn)物為模板，進(jìn)行dna文庫(kù)擴(kuò)增反應(yīng)，并對(duì)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟。

對(duì)于ctdna，上述步驟1)在末端修復(fù)及加a尾的步驟前，還包括dna酶切片段化步驟。

上述步驟2)，pcr反應(yīng)的正向引物為通用引物；反向引物為一組序列與編碼鏈方向反向互補(bǔ)的特異引物，且5’端帶有標(biāo)簽。較佳的，通用引物為p5引物；反向引物的序列如seqidno:1～20所示，反向引物的5’端用生物素修飾。

上述步驟3)，較佳的，巢式pcr擴(kuò)增反應(yīng)的引物組的序列如seqidno:21～40所示。

上述步驟4)進(jìn)一步包括：

對(duì)步驟3)所得產(chǎn)物進(jìn)行末端修復(fù)及磷酸化，并進(jìn)行純化的步驟；

在純化后的末端修復(fù)及磷酸化產(chǎn)物上連接通用測(cè)序接頭，并對(duì)連接產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟；

以純化后的連接產(chǎn)物為模板，進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增反應(yīng)，并對(duì)文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化的步驟；

對(duì)純化后的文庫(kù)進(jìn)行定量、質(zhì)檢，獲得用于高通量測(cè)序的dna文庫(kù)。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之二是提供一種用上述建庫(kù)方法制備的dna測(cè)序文庫(kù)對(duì)融合基因進(jìn)行高通量定量測(cè)序檢測(cè)的方法，該方法可應(yīng)用于ffpe樣本或液態(tài)活檢。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之三是提供一種融合基因定量測(cè)序檢測(cè)試劑盒，該試劑盒包含有用上述建庫(kù)方法制備的dna測(cè)序文庫(kù)。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之四是提供上述融合基因定量測(cè)序檢測(cè)方法在ffpe樣本或液態(tài)活檢中的應(yīng)用。

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題之五是提供一組特異性擴(kuò)增融合基因發(fā)生區(qū)域的引物，該引物組的序列如seqidno:1～20所示。

本發(fā)明使用單向特異引物來錨定融合斷點(diǎn)發(fā)生的下游，通過特異引物和通用引物配對(duì)，運(yùn)用pcr方式來獲取需要的序列，再運(yùn)用標(biāo)簽富集和巢式pcr進(jìn)一步降低背景，最后在捕獲的目的片段兩端加上通用測(cè)序接頭，構(gòu)建成最終的融合基因測(cè)序文庫(kù)。相比傳統(tǒng)的基于rna的融合基因檢測(cè)方法和探針捕獲建庫(kù)方法，本發(fā)明的融合基因建庫(kù)和檢測(cè)方法具有以下優(yōu)點(diǎn)和有益效果：

1.特異性高，背景低，測(cè)序數(shù)據(jù)中不匹配讀數(shù)的比例低。

2.只需運(yùn)用簡(jiǎn)便的pcr技術(shù)，無需探針雜交、封閉等繁瑣的過程，操作簡(jiǎn)單，建庫(kù)時(shí)間短(建庫(kù)時(shí)間可從3天縮短至1-1.5天)，成本低(成本可降低50％)。

3.樣本起始量可低至10ng，適用于血漿游離dna(ctdna和cfdna)的檢出。

4.可適用于目前所有的alk(間變性淋巴瘤激酶)融合基因型，不限制上游是哪個(gè)基因與alk融合，甚至可發(fā)現(xiàn)未知的融合型或已知融合型中的未知斷點(diǎn)。

5.解決了現(xiàn)有的基于rna的融合基因檢測(cè)難以獲得適當(dāng)質(zhì)量的rna的問題，可應(yīng)用于ffpe樣本或液態(tài)活檢。

6.對(duì)照樣本檢測(cè)結(jié)果表明，和金標(biāo)準(zhǔn)的rna捕獲測(cè)序結(jié)果高度一致。

附圖說明

圖1為本發(fā)明實(shí)施例的基因融合reads分布圖。其中，(a)圖為eml4基因，(b)圖為alk基因。

具體實(shí)施方式

為對(duì)本發(fā)明的技術(shù)內(nèi)容、特點(diǎn)與功效有更具體的了解，現(xiàn)結(jié)合具體實(shí)施例，對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案做進(jìn)一步詳細(xì)的說明。

實(shí)施例中所用儀器設(shè)備、實(shí)驗(yàn)材料和試劑如下：

一、儀器

abproflexpcr儀、ikams3digital漩渦振蕩器、ivgnqubit3.0熒光光度計(jì)、ikaminig掌上離心機(jī)；

二、材料

rainin移液器(規(guī)格10、20、200、1000μl)、axygen通用過濾接頭(universalfitfiltertips，規(guī)格10、20、200、1000μl)、dynaldynamag^tm-2magnet磁力架、ambionmagneticstand-96、axygen0.2ml透明平蓋低吸附pcr薄壁管、axygen無色低吸附離心管(1.5ml、2.0ml)；

三、試劑

分析純無水乙醇、ivgndsdnahs試劑盒、nebt4dna連接酶、nebt4多聚核苷酸激酶、nebphusion超保真pcrmastermix、beckmanxp、ivgnmyone^tmstreptavidin(鏈霉親和素)c1、kapahyperpluslibrarypreparationkit(文庫(kù)制備試劑盒)。

實(shí)施例中未注明具體條件的實(shí)驗(yàn)方法，通常按照常規(guī)條件，例如sambrook等人，分子克隆：實(shí)驗(yàn)室手冊(cè)(newyork:coldspringharborlaboratorypress,1989)中所述的條件，或按照制造廠商所建議的條件。

本實(shí)施例的基于dna的alk融合基因定量測(cè)序建庫(kù)方法流程如下：

一、基因組片段化dna建庫(kù)

采用kapahyperpluslibrarypreparationkit構(gòu)建基因組片段化dna文庫(kù)(如果是cfdna，則不需要進(jìn)行dna酶切片段化步驟，且保證起始量10ng)。

1.dna酶切片段化

1)在冰上的0.2ml離心管中混合下列組分：dna100ng(提取自患者ffpe、血漿或活組織)35μl，10xkapa片段化反應(yīng)緩沖液5μl，kapa片段酶10μl，總計(jì)50μl。

2)渦旋震蕩3秒，短暫離心，盡快進(jìn)行下一步。

3)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行片段化反應(yīng)(不使用熱蓋)，反應(yīng)程序?yàn)椋?℃預(yù)冷10min；37℃片段化反應(yīng)20min；4℃保持。

2.末端修復(fù)及加“a”(a-tailing)

1)在完成dna酶切片段化的離心管中添加以下成分：50μl片段化dna或cfdna，末端修復(fù)和加“a”尾緩沖液7μl，末端修復(fù)和加“a”尾酶混合物3μl，總計(jì)60μl。

2)渦旋震蕩，短暫離心，盡快進(jìn)行下一步。

3)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行末端修復(fù)及加“a”尾反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?5℃末端修復(fù)及加“a”尾反應(yīng)30min；4℃保持。反應(yīng)結(jié)束后盡快進(jìn)行下一步。

3.接頭連接并純化

1)在完成末端修復(fù)及加“a”尾反應(yīng)的體系中加入以下成分：末端修復(fù)及加“a”尾產(chǎn)物60μl，文庫(kù)接頭15μl，水(pcr級(jí)別)5μl，連接緩沖液(ligationbuffer)30μl；dna連接酶10μl，總計(jì)110μl。

其中，文庫(kù)接頭由p5和p7退火得到。

p5序列為：

aatgatacggcgaccaccgagatctacactctttccctacacgacgctcttccgatct(seqidno:41)

p7序列為：

gatcggaagagcacacgtctgaactccagtcacatcacgatctcgtatgccgtcttctgcttg(seqidno:42)

2)用移液器小心吸打混勻，短暫離心，20℃孵育15min。

3)在110μl接頭連接產(chǎn)物中加入88μlxp試劑(純化磁珠)，總體積198μl，混勻，短暫離心，室溫放置5分鐘，將反應(yīng)管置于磁架上2min或直至溶液澄清，棄去上清。

4)反應(yīng)管保持在磁架上，加入200μl80％新鮮制備的乙醇，保持至少30s，隨后小心棄去上清。重復(fù)本步驟一次，保證乙醇被充分吸去。

5)反應(yīng)管保持在磁架上，室溫干燥3min(不要過度干燥，可能會(huì)導(dǎo)致回收率較低)，取下，加入25μl0.1×te(tris-edta緩沖液)，吸打混勻5次，室溫放置2分鐘。將反應(yīng)管放回磁架，直至溶液澄清，吸取25μl上清放入新的0.2ml反應(yīng)管中。

4.dna文庫(kù)擴(kuò)增并純化

1)在離心管中加入2×kapahifihotstartreadymix(熱啟動(dòng)高保真酶)25μl，10×kapalibraryamplificationprimermix(文庫(kù)擴(kuò)增引物混合物)5μl，純化后的接頭連接產(chǎn)物20μl，總計(jì)50μl。吸打混勻，短暫離心。

2)在熱循環(huán)儀上進(jìn)行文庫(kù)擴(kuò)增反應(yīng)，反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃預(yù)變性45s；98℃變性15s，60℃復(fù)性30s，72℃延伸30s，5個(gè)循環(huán)；72℃后延伸1min；4℃保持。

3)取50μl擴(kuò)增產(chǎn)物，加入50μlxp試劑，總計(jì)100μl?；靹颍虝弘x心，室溫放置5分鐘，將反應(yīng)管置于磁架上2min或直至溶液澄清，棄去上清。

4)反應(yīng)管保持在磁架上，加入200μl80％新鮮制備的乙醇，保持至少30s，隨后小心棄去上清。重復(fù)本步驟一次，保證乙醇被充分吸去。

5)反應(yīng)管保持在磁架上，室溫干燥3min，取下，加入22μl0.1×te，吸打混勻5次，室溫放置2分鐘。將反應(yīng)管放回磁架，直至溶液澄清，吸取20μl上清放入新的0.2ml反應(yīng)管中。

二、目的區(qū)域擴(kuò)增捕獲

1.第一輪融合基因發(fā)生區(qū)域擴(kuò)增捕獲

在pcr管中混合如下反應(yīng)體系：2×phusionhfpcrmastermix25μl，taq聚合酶1μl，dmso(二甲亞砜)1μl，1μmfusionpanel引物混合物10μl，純化后的dna文庫(kù)10μl，無核酸酶水3μl，總計(jì)50μl。吸打混勻，短暫離心后，按表1程序進(jìn)行pcr擴(kuò)增。

其中，引物混合物中，正向引物使用基因組文庫(kù)的p5通用引物序列(seqidno:41)，反向引物是一組與編碼鏈方向反向互補(bǔ)的特異序列，且5’端用生物素修飾，以便后一步富集特異序列時(shí)，降低測(cè)序背景。這組反向引物的序列為：

表1第一輪擴(kuò)增捕獲pcr反應(yīng)程序

2.擴(kuò)增產(chǎn)物純化

1)向擴(kuò)增產(chǎn)物中加入50μl無核酸酶水，轉(zhuǎn)入1.5ml低吸附管中，加入90μl(0.9倍體積)xp試劑，吸打混勻5次，室溫放置5min。

2)將反應(yīng)管置于磁架上2min或直至溶液澄清，將上清吸入新的反應(yīng)管中(上清中是需要的文庫(kù)片段，不要丟棄)，加入15μl(0.15倍體積)xp試劑，吸打混勻5次，室溫放置5min。

3)將反應(yīng)管置于磁架上2min或直至溶液澄清，棄去上清。

4)加入500μl新鮮制備的80％乙醇，保持大于30s，然后吸去上清。重復(fù)本步驟一次，保證乙醇被充分吸去。

5)反應(yīng)管保持在磁架上，室溫干燥3min，取下，加入200μl無核酸酶水，吸打混勻5次，放在磁架上靜置2min，吸取上清至新的1.5ml反應(yīng)管，再加入200μl2×b&w緩沖液，吸打混勻。

3.富集引物特異片段

1)取50μl10mg/ml的bsa(標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)溶液)加無核酸酶水450μl，稀釋成1×bsa。

2)漩渦振蕩myone^tm鏈霉親和素c1磁珠，吸取50μl磁珠到1.5ml低吸附管中，加入500μl1×b&w緩沖液，漩渦振蕩15s，短暫離心，置于磁架上至少1min，直至溶液變清，吸掉上清，加500μl1×bsa，漩渦振蕩15s，短暫離心后，置于磁架上至少1min，等溶液變清后，吸掉上清，加入500μl1×b&w緩沖液，漩渦振蕩15s，短暫離心，放置備用。

3)將含磁珠的離心管置于磁架上，等溶液變清后，吸掉上清，向洗好的磁珠中加入純化后的第一輪擴(kuò)增產(chǎn)物，室溫(20-25℃)垂直轉(zhuǎn)動(dòng)反應(yīng)管，雜交30min。

4)將雜交好的磁珠dna混合物短暫離心，置于磁架上至少1min，等溶液變清后，吸去上清。

5)用500μl1×b&w緩沖液懸浮磁珠，漩渦振蕩15s，短暫離心后置于磁架上至少1min，等溶液變清后，吸去上清。重復(fù)本步驟2次，共清洗3次磁珠。

6)用500μl0.1×te懸浮磁珠，放置備用。

4.第二輪目的片段擴(kuò)增(巢式pcr)

1)將上一步所得含有磁珠的反應(yīng)管置于磁架上，待溶液澄清后，盡量棄去上清，用20μl巢式pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系再懸浮磁珠，一起轉(zhuǎn)入新的0.2ml反應(yīng)管中，在熱循環(huán)儀上按照表2所示程序進(jìn)行巢式pcr擴(kuò)增反應(yīng)。

20μl巢式pcr擴(kuò)增反應(yīng)體系包含：2×phusionhfpcrmastermix10μl，taq聚合酶0.5μl，dmso0.5μl，1μm巢式fusionpanel引物混合物9μl。其中，引物混合物包含有以下引物：

表2第二輪巢式pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序

2)擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)束后，將反應(yīng)管置于磁架上，待溶液澄清后，吸取最終捕獲產(chǎn)物至新的反應(yīng)管中，可在-20℃保存1-2周。

三、建庫(kù)

1.末端修復(fù)及磷酸化

在pcr反應(yīng)管中加入以下成分：上一步所得最終捕獲產(chǎn)物20μl，t4連接酶緩沖液10μl，10mg/mlbsa1μl，10mmdntps2μl，t4聚合酶1μl，t4多聚核苷酸激酶1μl，無核酸酶水75μl，總計(jì)100μl。小心吸打混勻，室溫孵育20min。

2.末端修復(fù)產(chǎn)物純化

1)在末端修復(fù)產(chǎn)物中加入xp試劑100μl(1倍體積)，吸打混勻5次，室溫靜置5min。將反應(yīng)管置于磁架上，靜置2min或待溶液澄清，小心吸去上清，避免碰到磁珠沉淀。

2)加入200μl新鮮配置的80％乙醇，貼著磁架輕輕地上下移動(dòng)反應(yīng)管來清洗磁珠，然后吸去上清。重復(fù)本步驟一次，并確保所有的80％乙醇都被吸去。

3)將反應(yīng)管保持在磁架上，室溫干燥3min，取下，加入42μl無核酸酶水，旋渦振蕩2s，短暫離心2s，放回磁架上，靜置2min或待溶液澄清，吸取40μl上清至新的0.2ml低吸附pcr管中，避免碰到磁珠。

3.測(cè)序接頭連接

向40μl純化后的末端修復(fù)產(chǎn)物中加入如下試劑：t4連接酶緩沖液5μl，barcodex(不同樣本所用barcode不同，x編號(hào)不同)1μl，p1接頭1μl，10mmdntps1μl，t4連接酶1μl，taq聚合酶1μl，總體積50μl。用移液器小心吸打混勻5次，在熱循環(huán)儀上進(jìn)行測(cè)序接頭連接反應(yīng)。連接反應(yīng)條件為：22℃20min，72℃10min，10℃保持。產(chǎn)物可在-20℃保存。

4.連接產(chǎn)物純化

1)在連接產(chǎn)物中加入30μlxp試劑，吸打混勻5次，室溫放置5min。將反應(yīng)管置于磁架上，靜置5min或直至溶液澄清，將上清吸入新的反應(yīng)管中(上清中是需要的文庫(kù)片段，不要丟棄)。

2)在上一步吸取的上清中加入20μlxp試劑，吸打混勻5次，室溫放置5min。將反應(yīng)管置于磁架上5min或直至溶液澄清，棄去上清。

3)加入200μl新鮮配制的80％乙醇，貼著磁架輕輕上下移動(dòng)反應(yīng)管來清洗磁珠，然后吸去上清。重復(fù)本步驟一次，保證乙醇被充分吸去。

4)保持在磁架上，室溫干燥3min(干燥期間馬上開始下一步文庫(kù)擴(kuò)增)。

5.文庫(kù)擴(kuò)增

1)向上一步純化后的連接產(chǎn)物中加入2×phusionhfpcrmastermix25μl、文庫(kù)擴(kuò)增引物1μl、無核酸酶水24μl，將反應(yīng)管從磁架上取下，用移液器吸打混勻5次，放回磁架上，靜置2min或待溶液澄清。

其中，文庫(kù)擴(kuò)增引物由20μmaf和pf引物等體積混合而成，af、pf引物序列如下：

af：ccatctcatccctgcgtgtctccgactcag(seqidno:43)

pf：gtctcagcctctctatgggcagtcggtgat(seqidno:44)

2)小心將上清移入新的反應(yīng)管中，避免吸到磁珠。對(duì)上清反應(yīng)體系進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr擴(kuò)增反應(yīng)程序?yàn)椋?8℃2min；98℃15s，60℃1min，共5個(gè)循環(huán)；10℃保持。

6.文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物純化

1)在文庫(kù)擴(kuò)增中加入xp50μl(1倍體積)，吸打混勻5次，室溫靜置5min。

2)將反應(yīng)管置于磁架上，靜置2min或待溶液澄清，小心吸去上清，避免碰到磁珠沉淀。

3)加入200μl新鮮配制的80％乙醇，貼著磁架輕輕上下移動(dòng)反應(yīng)管來清洗磁珠，然后吸去上清。重復(fù)本步驟一次，確保所有80％乙醇都被吸去。

4)將反應(yīng)管保持在磁架上，室溫干燥3min，取下，加入50μl無核酸酶水，吸打混勻5次，放置在磁架上靜置2min，待溶液澄清后，吸取上清至新的反應(yīng)管，用于qubit定量。

7.qubit2.0定量

1)用dsdnahsassaykit試劑盒在qubit熒光光度計(jì)上定量樣本dna。

2)在一個(gè)1.5ml離心管中，合并597μlqubitdsdnahs緩沖液和3μlqubitdsdnahs試劑，漩渦振蕩混勻，制備成qubit工作溶液。

3)分別標(biāo)記3個(gè)qubit試管：#1標(biāo)準(zhǔn)品管、#2標(biāo)準(zhǔn)品管、#3樣品管。在#1標(biāo)準(zhǔn)品管和#2標(biāo)準(zhǔn)品管中，加入190μlqubit工作溶液，然后分別將qubitstandardhs#1和#2標(biāo)準(zhǔn)品10μl加入相應(yīng)的#1標(biāo)準(zhǔn)品管和#2標(biāo)準(zhǔn)品管中，漩渦振蕩混勻。在#3樣品管中加入198μlqubit工作溶液和2μl純化后的文庫(kù)擴(kuò)增產(chǎn)物，漩渦振蕩混勻。

4)靜置2min后，打開qubit，選擇dna測(cè)定，校正#1標(biāo)準(zhǔn)品管和#2標(biāo)準(zhǔn)品管中的標(biāo)準(zhǔn)品。

5)將#3樣品管放入qubit中讀數(shù)定量，并計(jì)算使用2μl樣品的定量值。

6)將文庫(kù)稀釋至100pm(約20ng/ml)，獲得可用于iontorrent高通量測(cè)序儀的dna文庫(kù)。

將上述dna文庫(kù)送入iontorrent高通量測(cè)序儀進(jìn)行測(cè)序檢測(cè)。

基因融合檢測(cè)方法的原理是：利用二代測(cè)序的單分子reads(每個(gè)read來自于一個(gè)單分子dna序列)，如果同一個(gè)reads(包含雙端和單端)的兩部分分別比對(duì)到基因組的不同位置，且不為repeat(重復(fù))區(qū)域，那么這個(gè)read就可能是潛在的發(fā)生融合的reads。最后根據(jù)cutoff>100，篩選出陽性的融合基因及其配對(duì)基因。具體步驟如下：

1)使用fastqc對(duì)所有原始測(cè)序的reads進(jìn)行質(zhì)量控制，然后去除接頭序列。

2)取質(zhì)量合格的序列，用bwa比對(duì)軟件，與hg19基因組染色體進(jìn)行比對(duì)。

3)篩選出目的基因(alk)上的非正常比對(duì)的reads。

4)將非正常比對(duì)的reads，轉(zhuǎn)化成fasta格式，利用blat軟件比對(duì)到基因組上，找出所有可能的匹配位置，與hg19中基因的位置做maping，并計(jì)算個(gè)數(shù)。

5)根據(jù)reads個(gè)數(shù)>100個(gè)，并去掉幾個(gè)基因組經(jīng)常出現(xiàn)的重復(fù)區(qū)間，用igv查看基因融合reads分布，篩選出陽性的融合基因及其配對(duì)基因。

檢測(cè)結(jié)果顯示eml4與alk基因發(fā)生融合(參見圖1所示)。

序列表

<110>領(lǐng)星生物科技（上海）有限公司

<120>基于dna的融合基因定量測(cè)序建庫(kù)、檢測(cè)方法及其應(yīng)用

<130>cpc-np-17-100461

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