本發(fā)明涉及涉及組織工程領(lǐng)域，更特別地，涉及一種poss-peg雜化水凝膠及其制備方法以及用其制備的組織工程支架。

背景技術(shù)：

組織工程技術(shù)在生物醫(yī)學(xué)應(yīng)用中擁有巨大的潛力，如修復(fù)、替換受損或患病組織的生物功能。組織工程技術(shù)成功的關(guān)鍵因素之一是選擇一個(gè)合適的支架材料。為了實(shí)現(xiàn)組織重建，支架材料應(yīng)當(dāng)具備以下條件：(1)良好生物相容性；(2)較強(qiáng)的機(jī)械性能；(3)較高的孔隙率和足夠的孔徑；(4)生物可降解性以及合適的降解速率。

聚乙二醇(peg)水凝膠是一類非常有吸引力的組織工程支架材料，其生物相容性好、無毒、免疫原性低、對蛋白質(zhì)抗吸附，可通過腎排出體外，在體內(nèi)不會有積累。peg水凝膠的結(jié)構(gòu)、力學(xué)行為及降解性可通過peg的化學(xué)和加工條件來控制；其生物功能則可通過在peg水凝膠內(nèi)部嵌入生物活性分子來獲取，例如嵌入基質(zhì)金屬蛋白酶(mmp)底物肽(mmp(w)x)，使peg水凝膠具有酶敏感性，利用種子細(xì)胞自身分泌的蛋白酶(尤其是mmps)，促進(jìn)細(xì)胞外基質(zhì)降解，促使活性分子釋放，有利于種子細(xì)胞在支架的生長、粘附。然而，peg水凝膠的機(jī)械強(qiáng)度差，其機(jī)械強(qiáng)度遠(yuǎn)小于生物組織。

多面體低聚倍半硅氧烷(poss)是一種分子水平上的納米雜化材料，分子尺寸在1-3nm之間，由核心的si-o-si鍵組成的無機(jī)骨架和外圍的有機(jī)取代基組成有機(jī)-無機(jī)雜化結(jié)構(gòu)，外圍的有機(jī)取代基賦予了poss良好的分子可設(shè)計(jì)。poss納米粒子能增強(qiáng)聚合物韌性、耐溫性能、力學(xué)性能，且其無毒無味，具有良好的生物相容性，被認(rèn)為是新一代生物醫(yī)用材料。目前所研究的poss雜化水凝膠都是通過光聚合或使用的六亞甲基二異氰酸酯(hdi)或二苯基甲烷二異氰酸酯(mdi)等作為交聯(lián)劑進(jìn)行縮合反應(yīng)制備得到。這些制備方法的主要缺點(diǎn)是所用的光引發(fā)劑、hdi、mdi等具有毒性，且反應(yīng)需要在有機(jī)溶劑中進(jìn)行，對材料的體外生物相容性研究只能局限于2d細(xì)胞培養(yǎng)中。

因此，需要開發(fā)出具有更好力學(xué)性能的水凝膠，并且在制備過程中不使用有機(jī)溶劑成膠，從而使細(xì)胞在保持最大活性的同時(shí)被封裝到材料中。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為解決以上問題，本發(fā)明提供了一種poss-peg雜化水凝膠的制備方法，包括以下步驟：

s1：將馬來酰亞氨基功能化的四臂聚乙二醇(4-arm-peg-mal)與poss-sh進(jìn)行michael加成反應(yīng)得到poss-peg預(yù)聚物；

s2：使用酶敏感的基質(zhì)金屬蛋白酶底物肽(mmp(w)x)作為交聯(lián)劑與所述poss-peg預(yù)聚物通過micheal加成反應(yīng)交聯(lián)成膠，得到所述poss-peg雜化水凝膠。具體反應(yīng)過程如圖10的反應(yīng)式所示。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，mmp(w)x肽的序列為：ac-gcrd-gpqg↓iwgq-dgcg-nh2。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述4-arm-peg-mal的分子量為10kda～40kda。

在一個(gè)實(shí)施方案中，s1中所述4-arm-peg-mal與所述poss-sh之間的michael加成反應(yīng)在四氫呋喃中進(jìn)行。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，s1中所述poss-sh與所述4-arm-peg-mal之間的摩爾比為0.25-1。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，s1包括以下步驟：

s11：將所述4-arm-peg-mal與所述poss-sh溶解于四氫呋喃中；

s12：室溫?cái)嚢?.5小時(shí)使所述4-arm-peg-mal與所述poss-sh發(fā)生michael加成反應(yīng)；

s13：去除所述四氫呋喃，即得到所述poss-peg預(yù)聚物。

在一個(gè)實(shí)施方案中，s2中所述mmp(w)x與所述poss-peg預(yù)聚物之間的交聯(lián)反應(yīng)在乙醇胺的水溶液中進(jìn)行。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乙醇胺的濃度為3-10mm。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，所述乙醇胺溶液的ph為7-8，優(yōu)選為7.4。

在一個(gè)優(yōu)選實(shí)施方案中，s2中所述mmp(w)x與所述poss-peg預(yù)聚物之間重量比為1:3-20，更優(yōu)選地，可將mmp(w)x的功能基與poss-peg預(yù)聚物的功能基的比例為1:1。

在一個(gè)實(shí)施方案中，s2中的反應(yīng)溫度為37℃。

在一個(gè)實(shí)施方案中，s2中的乙醇胺水溶液中還添加了藥物或種子細(xì)胞。

本發(fā)明還涉及上述方法制備的poss-peg雜化水凝膠。

本發(fā)明還涉及上述poss-peg雜化水凝膠在制備組織工程支架中的應(yīng)用。

本發(fā)明的poss-peg雜化水凝膠機(jī)械強(qiáng)度好，且其機(jī)械強(qiáng)度可通過改變馬來酰亞氨基功能化的四臂聚乙二醇(4-arm-peg-mal)分子量、poss-sh與4-arm-peg-mal的摩爾比例進(jìn)行精細(xì)調(diào)控，同時(shí)只需在低濃度的三乙醇胺緩沖液中制備而成，成膠時(shí)間很快，在保證基本的理化性質(zhì)的前提下盡可能地降低了對其上搭載的種子細(xì)胞或藥物的損害或損失。

附圖說明

圖1為poss-peg雜化水凝膠的掃描電鏡照片；

圖2為poss-peg雜化水凝膠的儲能模量(g’)的振蕩應(yīng)力掃描圖譜；

圖3為poss-peg雜化水凝膠的儲能模量(g’)的動(dòng)態(tài)頻率掃描圖譜；

圖4為poss-peg雜化水凝膠溶脹曲線；

圖5為poss-peg雜化水凝膠的平衡溶脹比柱狀圖；

圖6為poss-peg雜化水凝膠降解率統(tǒng)計(jì)圖；

圖7為以4-arm-peg-mal分子量20kda制備的poss-peg雜化水凝膠4周內(nèi)降解曲線；

圖8為poss-peg雜化水凝膠體外細(xì)胞培養(yǎng)cck細(xì)胞活力測定圖；

圖9為poss-peg雜化水凝膠體外細(xì)胞培養(yǎng)細(xì)胞的活死細(xì)胞染色照片；

圖10為本發(fā)明的方法的化學(xué)反應(yīng)式。

具體實(shí)施方式

以下結(jié)合實(shí)例對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。

1.poss-peg雜化水凝膠的制備

poss-peg雜化水凝膠通過以下方法來制備：將4-arm-peg-mal(北京健凱科技有限公司)和poss-sh(sigma公司)溶解于3ml四氫呋喃中，室溫?cái)嚢?.5小時(shí)后除去溶劑得poss-peg預(yù)聚物；然后將poss-peg預(yù)聚物與基質(zhì)金屬蛋白酶底物肽(上海吉爾生化科技公司)溶解于3mlph7.4的三乙醇胺中，混合均勻，得預(yù)成膠溶液；最后將上述預(yù)成膠溶液轉(zhuǎn)移至5個(gè)600μl模具中，37℃生化培養(yǎng)箱中反應(yīng)，制備得到水凝膠。poss-peg預(yù)聚物制備過程中的4-arm-peg-mal的分子量、4-arm-peg-mal、poss-sh的量如表1所示；poss-peg雜化水凝膠制備過程中的poss-peg預(yù)聚物和基質(zhì)金屬蛋白酶底物肽的量、三乙醇胺濃度以及成膠時(shí)間如表2所示。

表1實(shí)施例1-5中4-arm-peg-mal的分子量、4-arm-peg-mal、poss-sh的量

表2實(shí)施例1-5中poss-peg預(yù)聚物和基質(zhì)金屬蛋白酶底物肽的量、三乙醇胺濃度以及成膠時(shí)間

在實(shí)施例1-5中，都能成膠，并且成膠時(shí)間都在20min以內(nèi)。所得到的poss-peg雜化水凝膠在掃描電鏡下進(jìn)行觀察，結(jié)果如圖1所示，在poss-sh與4-arm-peg-mal的摩爾比為0.25、0.5和1的情況下，所實(shí)驗(yàn)的各分子量的4-arm-peg-mal都能與poss-sh反應(yīng)，且其反應(yīng)產(chǎn)物能與基質(zhì)金屬蛋白酶底物肽交聯(lián)形成多孔狀的交聯(lián)結(jié)構(gòu)。

2.poss-peg雜化水凝膠的理化性質(zhì)

1)機(jī)械強(qiáng)度

將水凝膠測試樣(n＝3)用超純水溶脹至平衡，濾紙擦干表面水分，采用流變儀解析水凝膠力學(xué)性能，3個(gè)測試樣取平均值。圖2為水凝膠材料的儲能模量(g’)的振蕩應(yīng)力掃描圖譜，圖3為儲能模量(g’)的動(dòng)態(tài)頻率掃描圖譜。由圖2和3可看出，采用本發(fā)明方法制備的水凝膠材料在所受應(yīng)力從0.1pa增加到20pa時(shí)，儲能模量(g’)隨應(yīng)力的變化沒有明顯變化，掃描頻率范圍為1hz到2hz時(shí)儲能模量(g’)也無明顯變化，表明水凝膠材料交聯(lián)良好。相較于未加入poss的純peg水凝膠，poss-peg雜化水凝膠機(jī)械強(qiáng)度更大，且機(jī)械強(qiáng)度隨poss含量增大而增大。

2)親水性

將水凝膠測試樣(n＝3)冷凍干燥，準(zhǔn)確稱取其重量。將干水凝膠沉浸在0.9％氯化鈉注射液(10ml)中，置于37℃水浴。在預(yù)定的時(shí)間，取出溶脹的水凝膠，用濾紙擦干表面水分后稱重，直至水凝膠重量恒定不變。水凝膠的溶脹百分率(％)＝(溶脹后水凝膠質(zhì)量-溶脹前水凝膠質(zhì)量)/溶脹前水凝膠質(zhì)量×100％，3個(gè)測試樣取平均值。圖4為水凝膠材料溶脹曲線；圖5為水凝膠材料的平衡溶脹比柱狀圖。由圖4和5可看出本發(fā)明方法制備的水凝膠材料在前10h已經(jīng)達(dá)到較高的溶脹比，并在168h后達(dá)到溶脹平衡。盡管poss-peg雜化水凝膠的平衡溶脹比隨poss含量增大而減小，但本發(fā)明方法制備的水凝膠材料平衡溶脹比在12至33之間，表明其仍具有良好的親水性。

3)酶降解性

將水凝膠測試樣(n＝3)冷凍干燥，準(zhǔn)確稱取其重量。將干水凝膠沉浸在0.01m磷酸鹽緩沖液(pbs，ph＝7.4,9ml)和重組人類mmp-2(200ng/ml,1ml)，純peg水凝膠作為空白組，置于37℃水浴。30天后蒸餾水漂洗，冷凍干燥，稱重。計(jì)算每組水凝膠在溶液中的累計(jì)降解百分率(％)＝(降解前水凝膠質(zhì)量-剩余水凝膠質(zhì)量)/降解前水凝膠質(zhì)量×100％，3個(gè)測試樣取平均值。圖6中a為降解率圖；圖7為以4-arm-peg-mal分子量20kda制備的poss-peg雜化水凝膠4周內(nèi)降解曲線。由圖6和7可看出本發(fā)明方法制備的水凝膠材料降解率在28％至48％之間，表明水凝膠材料具有酶降解性，并且隨著poss含量的增大，poss-peg雜化水凝膠降解率越低、降解速度越慢。

3.搭載人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)的poss-peg雜化水凝膠

制得的不同poss-sh與4-arm-peg-mal的摩爾比例預(yù)成膠液各3ml，與人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞(huvec)均勻混合，細(xì)胞密度為1×10⁶/ml。取64μl置于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，高度為2mm，5％co2恒溫培養(yǎng)箱37℃孵育30min，加入200ul含10％胎牛血清的低糖dmem培養(yǎng)基，繼續(xù)孵育，在第1天和第4天取出樣本，進(jìn)行活死細(xì)胞染色測試細(xì)胞活性，應(yīng)用熒光顯微鏡分析圖像，觀察細(xì)胞活性及形態(tài)；并用cck-8進(jìn)行細(xì)胞活力測試，應(yīng)用分光光度計(jì)檢測吸光度推算活細(xì)胞數(shù)目。純peg水凝膠為對照組。圖8為cck細(xì)胞活力測定圖；圖9為體外細(xì)胞培養(yǎng)活死細(xì)胞染色圖。結(jié)果顯示，細(xì)胞在水凝膠內(nèi)部封裝均勻，培養(yǎng)四天后均有較高的細(xì)胞活力，表明poss-peg水凝膠材料無毒且具有良好的生物相容性。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。