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      RT?LAMP檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的引物組合物、相應(yīng)的試劑盒及檢測方法與流程

      文檔序號:11428840閱讀:430來源:國知局
      RT?LAMP檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的引物組合物、相應(yīng)的試劑盒及檢測方法與流程

      本發(fā)明屬于分子檢測技術(shù)領(lǐng)域,涉及一種引物組合物、試劑盒和檢測方法,具體地說是一種rt-lamp檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的引物組合物、相應(yīng)的試劑盒及檢測方法。



      背景技術(shù):

      結(jié)核病是由結(jié)核分枝桿菌引起的嚴重影響人類健康的慢性傳染病,是至今仍然困擾人類的古老疾病之一,在古埃及木乃伊中就已發(fā)現(xiàn)結(jié)核分枝桿菌的存在,即使在最近幾年,每年還大約有900萬人感染結(jié)核。隨著耐藥與多重耐藥菌株的出現(xiàn),結(jié)核病的控制難度不斷增加,而建立快速、靈敏度高、特異性強的診斷方法,對于結(jié)核病的防治工作具有重要意義,也是進行早期隔離、診治的前提。

      目前,結(jié)核病的診斷方法主要是痰涂片抗酸染色法、羅氏固體培養(yǎng)法、液體快速培養(yǎng)、核酸擴增等方法。染色涂片雖然簡單易行,但敏感性差,檢出率低,并且不能鑒別是死菌還是活菌,亦不能分辨結(jié)核分支桿菌與非結(jié)核分枝桿菌;羅氏固體培養(yǎng)法培養(yǎng)周期長,需要4-8周,改進后液體快速培養(yǎng)系統(tǒng)將時間縮短到10天左右,但花費昂貴且容易受到污染,只能檢出活力旺盛的菌,并且培養(yǎng)法不能鑒別結(jié)核分支桿菌與非結(jié)核分枝桿菌;以擴增核酸為基礎(chǔ)的實驗技術(shù),具有快速、靈敏、特異強等特點,比如pcr、lamp等;但因pcr技術(shù)對操作人員技能有較高要求,需要的熱循環(huán)設(shè)備格昂貴而很難得到推廣,環(huán)介導(dǎo)等溫擴增技術(shù)(loop-mediatedisothermalamplification,lamp)克服了上述缺點,具有反應(yīng)快速、操作簡單的優(yōu)勢,一臺水浴鍋等恒溫設(shè)備即可完成操作,擴增結(jié)果可用肉眼判定,對員工簡單培訓即可完成操作,適合在基層醫(yī)療機構(gòu)應(yīng)用,但pcr、lamp等分子生物學檢測法是針對結(jié)核桿菌dna基因為靶序列設(shè)計的引物并進行擴增的,對死菌或活菌都呈現(xiàn)陽性結(jié)果,無法在臨床上評估抗結(jié)核治療效果。



      技術(shù)實現(xiàn)要素:

      本發(fā)明要解決的技術(shù)問題,是要提供一種rt-lamp檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的引物組合物及相應(yīng)的試劑盒,該引物組合物的序列設(shè)計合理,特異性強,靈敏度高;含有該引物組合物的試劑盒特異性強、靈敏度高,操作方便,可通過肉眼觀察擴增結(jié)果;

      本發(fā)明的另外一個目的,是提供一種rt-lamp檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的方法,該方法簡單,靈敏度高,檢測過程便捷,擴增反應(yīng)快,節(jié)省時間,30min內(nèi)即可完成擴增,擴增結(jié)果通過肉眼即可觀察,能特異性檢測死菌或活菌。

      為解決上述技術(shù)問題,本發(fā)明所采取的技術(shù)方案是:

      一種rt-lamp檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的引物組合物,它包括:

      正向外引物f3:5’-tcctggctcaggacgaac-3’;

      反向外引物b3:5’-cgctttccaccacaagacat-3’;

      正向內(nèi)引物fip:5’-tcgccactcgagtatctccgaagcggcgtgcttaacacat-3’;

      反向內(nèi)引物bip:5’-agtaacacgtgggtgatctgccatcccgtggtcctatccg-3’;

      反向環(huán)引物lb:5,-ataagcctgggaaactgggt-3,

      本發(fā)明提供了一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的rt-lamp試劑盒,包括25μl的rt-lamp擴增反應(yīng)液,所述rt-lamp擴增反應(yīng)液包括如下組分:

      0.2μm正向外引物f3、0.2μm反向外引物b3、1.6μm正向內(nèi)引物fip、1.6μm反向內(nèi)引物bip、0.8μm反向環(huán)引物lb、0.8m甜菜堿、8mmmgso4、1.4mmdntps,8ubstdna聚合酶、20u重組核糖核酸酶抑制劑、100um-mlv反轉(zhuǎn)錄酶、2.5μl10×buffer、1μl模板rna、5mm/μl鈣黃綠素、10mm/μlmncl2混合液、11.7μl去離子水。

      本發(fā)明還提供了一種rt-lamp檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的方法,利用前述的試劑盒進行檢測,并按照如下的步驟順序進行:

      (1)在反應(yīng)管中加入0.2μm正向外引物f3、0.2μm反向外引物b3、1.6μm正向內(nèi)引物fip、1.6μm反向內(nèi)引物bip、0.8μm反向環(huán)引物lb、0.8m甜菜堿、8mmmgso4、1.4mmdntps,8ubstdna聚合酶、20u重組核糖核酸酶抑制劑、100um-mlv反轉(zhuǎn)錄酶、2.5μl10×buffer、1μl模板rna、5mm/μl鈣黃綠素、10mm/μlmncl2和11.7μl去離子水,并將反應(yīng)管置于恒溫水浴箱內(nèi)反應(yīng);

      (2)將步驟(1)的反應(yīng)管置于90℃恒溫水浴箱內(nèi)2min,終止反應(yīng),根據(jù)反應(yīng)管中液體的顏色變化判斷擴增結(jié)果。

      作為限定,所述恒溫水浴箱的溫度為60-65℃,反應(yīng)時間為30-50min。

      作為進一步限定,所述恒溫水浴箱的溫度為60℃,反應(yīng)時間為50min。

      由于采用了上述的技術(shù)方案,本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比,所取得的技術(shù)進步在于:

      本發(fā)明提供的用于檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的rt-lamp的引物組合物設(shè)計合理,特異性強;含有該引物組合物的試劑盒特異性強、靈敏度高,操作方便,可通過肉眼觀察擴增結(jié)果;

      結(jié)核桿菌16srrna半衰期短,僅存在于代謝增殖的活菌中,占總rna的80%,與dna的單一拷貝相比較,16srrna拷貝數(shù)更多,本發(fā)明提供的用于檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的檢測方法,選擇能合并反轉(zhuǎn)錄功能的rt-lamp方法,不僅有助于判定活菌,而且可以進一步提高靈敏性;檢測方法簡單,靈敏度高,檢測過程便捷,擴增反應(yīng)快,節(jié)省時間,30min內(nèi)即可完成擴增,擴增結(jié)果通過肉眼即可觀察,能特異性檢測死菌或活菌。

      本發(fā)明適用于對結(jié)核桿菌的活菌進行檢測。

      本發(fā)明下面將結(jié)合具體實施例作進一步詳細說明。

      附圖說明

      圖1為rt-lamp引物的相對位置和特異識別位點圖;

      圖2為不同溫度的rt-lamp與lamp電泳圖(a圖和b圖中:m-250bpdnamaker;1-56℃、2-58℃、3-60℃、4-63℃;5-65℃;6-陰性對照);

      圖3為rt-lamp與lamp檢測時效對比圖(a-不同時間的rt-lamp電泳圖;b-不同時間的lamp電泳圖;圖中:m-250bpdnamaker;1-20min、2-25min、3-30min、4-40min、5-50min;6-陰性對照);

      圖4為rt-lamp和lamp的靈敏度實驗結(jié)果圖(a-rt-lamp凝膠電泳及鈣黃綠素染色圖;b-lamp凝膠電泳及鈣黃綠素染色圖;a圖和b圖中:m-250bpdnamaker;1-5.0×107、2-5.0×106、3-5.0×105、4-5.0×104、5-5.0×103、6-5.0×102、7-5.0×101、8-5.0×100、9-5.0×10-1cfu/ml;10-陰性對照);

      圖5為rt-lamp的特異性實驗中凝膠電泳及鈣黃綠素染色結(jié)果圖(a圖:m-250bpdnamaker;1肺結(jié)核患者痰標本、2-葡萄菌肺炎患者痰標本、3-銅綠假單胞菌肺炎患者痰標本、4-肺炎克雷伯肺炎患者痰標本;b圖:m-250bpdnamaker;1-結(jié)核桿菌h37rv、2-胞內(nèi)分枝桿菌、3-海分枝桿菌、4-堪薩斯分枝桿菌、5-鳥結(jié)核分枝桿菌、6-淺黃分枝桿菌、7-恥垢分枝桿菌、8-偶發(fā)分枝桿菌、9-龜分枝桿菌);

      圖6為rt-lamp檢測極限實驗中rt-lamp凝膠電泳及鈣黃綠素染色結(jié)果圖(圖中:m-250bpdnamaker;1-0.1ng、2-10pg、3-1pg、4-100fg、5-10fg、6-1fg、7-100ag、8-10ag、9-1ag;10-陰性對照);

      圖7為酶切產(chǎn)物分析結(jié)果圖(a圖為rt-lamp酶切產(chǎn)物分析結(jié)果圖:m-250bpdnamarker;1-酶切前產(chǎn)物、2-酶切后產(chǎn)物;b圖為lamp產(chǎn)物分析結(jié)果圖,m-100bpdnamarker;1-酶切前產(chǎn)物、2-酶切后產(chǎn)物);

      圖8為rt-lamp和lamp的臨床樣本的檢測結(jié)果圖(a圖為rt-lamp凝膠電泳及鈣黃綠素染色圖:m-250bpdnamaker;1-4:肺結(jié)核患者痰標本;5-陰性對照;b圖lamp凝膠電泳及鈣黃綠素染色圖:m-250bpdnamaker;1-4:肺結(jié)核患者痰標本;5-陰性對照)。

      具體實施方式

      下面將結(jié)合具體的實施方式對本發(fā)明的技術(shù)方案進行詳細的說明。

      下述實施例中所用的試劑如無特殊說明均為現(xiàn)有的常規(guī)市售試劑,所用的測試方法、檢測方法、提取方法如無特殊說明,均使用現(xiàn)有的方法。

      實施例1一種rt-lamp檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的引物組合物

      本實施例括:

      正向外引物f3:5’-tcctggctcaggacgaac-3’(seqidno:1);

      反向外引物b3:5’-cgctttccaccacaagacat-3’(seqidno:2);

      正向內(nèi)引物fip:5’-tcgccactcgagtatctccgaagcggcgtgcttaacacat-3’(seqidno:3);

      反向內(nèi)引物bip:5’-agtaacacgtgggtgatctgccatcccgtggtcctatccg-3’(seqidno:4);

      反向環(huán)引物lb:5,-ataagcctgggaaactgggt-3,(seqidno:5)。

      該引物組合物的設(shè)計過程如下:

      從ncbi數(shù)據(jù)庫下載非結(jié)核桿菌16srrna全序列,用clustalomega工具將結(jié)核桿菌標準株(genbank號:nr_102810.1)與各種非結(jié)核桿菌進行序列對比,非結(jié)核桿菌包括:胞內(nèi)分枝桿菌(m.intracellμlarenr_074661.1)、海分枝桿菌(m.marinumnr_025214.1)、堪薩斯分枝桿菌(m.kansasiinr_121712.1)、鳥結(jié)核分枝桿菌(m.aviumnr_102855.1)、淺黃分枝桿菌(m.flavescensnr_044815.1)、恥垢分枝桿菌(m.segmatisnr_074718.1)、偶發(fā)分枝桿菌(m.fortuitumx65529.1)、龜分枝桿菌(m.chelonaeaf480594.1)。

      根據(jù)兩個高變區(qū)170-210bp處和430-490bp處,從而確定特異引物的設(shè)計區(qū)段,如圖1所示。然后用引物設(shè)計軟件primerexplorerv5,針對該區(qū)段設(shè)計多套特異引物,比較每套引物的3’端位點的特異性并使用blast工具進一步驗證其特異性,最后選出最佳引物。本實施例選用1-210bp區(qū)段設(shè)計特異引物,所有引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成。

      實施例2一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的rt-lamp試劑盒

      本實施例為一種用于檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的rt-lamp試劑盒,該試劑盒包括rt-lamp擴增反應(yīng)液。

      rt-lamp擴增反應(yīng)液為25μl,包括如下組分:

      0.2μm正向外引物f3(實施例1所提供)、0.2μm反向外引物b3(實施例1所提供)、1.6μm正向內(nèi)引物fip(實施例1所提供)、1.6μm反向內(nèi)引物bip(實施例1所提供)、0.8μm反向環(huán)引物lb(實施例1所提供)、0.8m甜菜堿、8mmmgso4、1.4mmdntps,8ubstdna聚合酶、20u重組核糖核酸酶抑制劑、100um-mlv反轉(zhuǎn)錄酶、2.5μl10×buffer,1μl模板rna,5mm/μl鈣黃綠素、10mm/μlmncl2、11.7μl去離子水。

      在具體的試驗中,為了進行效果對比,試劑盒還包括對照,對照包括陽性對照和陰性對照,陽性對照為含目的基因結(jié)核桿菌(m.tuberculosish37rv,genbank號:nr_102810.1)的混合液(即本實施例中的rt-lamp擴增反應(yīng)液);陰性對照為不含目的基因結(jié)核桿菌(如其他肺部細菌感染者及常見的非結(jié)核桿菌)混合液。

      本實施例提供的rt-lamp試劑盒,特異性強、靈敏度高,操作方便,可通過肉眼觀察擴增結(jié)果,簡便、易于操作。

      實施例3一種rt-lamp檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的方法

      本實施例在檢測的過程中使用實施例2所提供的試劑盒,具體的檢測方法如下:

      (31)將含有結(jié)核分枝桿菌的待檢提取液用rna提取試劑盒提取結(jié)核分枝桿菌的rna后,得到模板rna,作為rt-lamp擴增反應(yīng)液中組分之一(即模板rna);

      本實施例中的待檢提取液取自確診肺結(jié)核的就診者的痰液,即將該痰液作為痰標本,加入痰液2倍體積的rna保護劑,用2倍體積2%n-乙酰-l-半胱氨酸(nalc)-naoh溶液進行消化,旋緊蓋子,在渦旋振蕩器上渦旋震蕩2min,直至痰標本充分液化,利用rna提取試劑盒按照現(xiàn)有的提取手段,提取樣品rna;rna提取時根據(jù)試劑盒提示加入dnasei進行處理,提取后得到模板rna;其中:rna提取試劑盒(rneasyminikit)購自德國的qiagen。

      (32)在反應(yīng)管中加入試劑盒中rt-lamp擴增反應(yīng)液并將反應(yīng)管置于60℃恒溫水浴箱內(nèi),反應(yīng)50min;

      (33)將步驟(32)的反應(yīng)管置于90℃恒溫水浴箱內(nèi)2min,終止反應(yīng),根據(jù)反應(yīng)管中液體的顏色變化判斷擴增結(jié)果。

      擴增完成后,見到體系變綠色是為陽性,保持淡橙色是為陰性,并取擴增產(chǎn)物5μl在凝膠中電泳25min以驗證擴增結(jié)果。

      本實施例提供的用于檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的檢測方法,過程簡單,靈敏度高,檢測過程便捷,擴增反應(yīng)快,節(jié)省時間,30min內(nèi)即可完成擴增,擴增結(jié)果通過肉眼即可觀察,能特異性檢測死菌或活菌。

      實施例4-6rt-lamp檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的方法

      實施例4-6分別為一種rt-lamp檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的方法,與實施例3相似,不同之處僅在于:rt-lamp擴增過程[即步驟(x2)(x=4-7)]中的反應(yīng)溫度和時間不同,具體如下:

      實施例4中,反應(yīng)溫度為62℃,反應(yīng)時間為30min;

      實施例5中,反應(yīng)溫度為63℃,反應(yīng)時間為40min;

      實施例6中,反應(yīng)溫度為65℃,反應(yīng)時間為45min。

      實施例4-6所提供的用于檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的方法,過程簡單,靈敏度高,檢測過程便捷,擴增反應(yīng)快,節(jié)省時間,30min內(nèi)即可完成擴增,擴增結(jié)果通過肉眼即可觀察,能特異性檢測死菌或活菌。

      實施例7rt-lamp與lamp方法分別檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的對比實驗與探究

      在下述的實驗中,rt-lamp與lamp擴增的條件、體系是相似的,不同之處僅在于:所用的擴增模板不同,rt-lamp擴增使用的是模板rna,lamp擴增使用的是模板dna。

      (一)、靈敏度實驗

      將結(jié)核分枝桿菌菌液按照10倍梯度稀釋,取各稀釋度菌液2ml分別提取rna與dna,rna的提取方法與實施例3中相同,dna的提取利用dna提取試劑盒[細菌dna提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司]按照現(xiàn)有的提取手段,提取樣品dna。利用rt-lamp與lamp檢測方法對結(jié)核分枝桿菌進行檢測,測試兩種方法的靈敏度,重復(fù)3次以上實驗,以凝膠電泳和鈣黃綠素染色進行結(jié)果判定,其中rt-lamp檢測方法即進行rna的反轉(zhuǎn)錄擴增,即擴增體系中含有提取后的rna模板,lamp檢測方法即進行dna的擴增,即擴增體系中含有提取后的dna模板,rt-lamp檢測方法與實施例3相同,lamp的檢測方法為現(xiàn)有的檢測方法。

      具體的檢測結(jié)果如圖4所示,由該圖可以看出,rt-lamp比lamp靈敏度高10倍。

      (二)、特異性實驗

      以含有結(jié)核桿菌(m.tubercμlosish37rv)的基因rna液體作為陽性對照,其他肺部細菌感染者及常見的非結(jié)核桿菌混合液作為陰性對照,用rt-lamp(與實施例3中檢測方法相同)和lamp檢測方法(現(xiàn)有技術(shù))分別進行擴增,通過電泳觀察擴增結(jié)果并進行特異性比較,具體的結(jié)果如圖5所示。

      由圖5可知,只有結(jié)核桿菌出現(xiàn)擴增條帶,其它細菌及非結(jié)核分枝桿菌為出現(xiàn)擴增,該引物特異性強。

      (三)、檢測極限實驗

      使用核酸蛋白分析儀(eppendorf,germany)對純化的結(jié)核桿菌標準株rna進行多次測量,取平均值作為真實rna含量值,并用去離子水調(diào)至1ng/μl作為rt-lamp實驗的模板;用去離子水對模板進行倍比稀釋,根據(jù)下述公式:

      1ng約相當于109copyrna,1ag約相當于1copyrna。用rt-lamp檢測方法(實施例3所提供的方法)進行擴增,根據(jù)結(jié)果評價rt-lamp的檢測極限,具體結(jié)果見圖6。

      由圖6可知,rt-lamp可檢測1copy結(jié)核菌,該方法靈敏度高。

      (四)、擴增后產(chǎn)物酶切鑒定

      對在同一條件下rt-lamp及l(fā)amp擴增方法擴增后的產(chǎn)物,采用限制性內(nèi)切酶xhoi進行酶切鑒定,30μl酶切體系如下:

      rt-lamp產(chǎn)物3μl、lamp產(chǎn)物3μl、q.cut.10×buffer3μl、xhoi1μl,去離子水補足23μl,37°c作用1小時;酶切產(chǎn)物用2.0%瓊脂糖凝膠進行電泳。具體的結(jié)果如圖7所示。

      由圖7可知,lamp反應(yīng)產(chǎn)物被切成大約70bp的條帶,與預(yù)期條帶相符,rt-lamp出現(xiàn)兩條條帶,說明反應(yīng)產(chǎn)物量大,與未完全酶切有關(guān)。

      (五)、臨床樣本檢測

      利用rt-lamp檢測方法(實施例3所提供)和lamp的檢測方法(現(xiàn)有技術(shù))對同一含有結(jié)核桿菌的痰標樣本進行檢測,檢測結(jié)果如圖8所示。

      結(jié)果表明:rt-lamp的擴增結(jié)果中對培養(yǎng)法與lamp法檢測不到的結(jié)核桿菌仍能檢測陽性,這說明rt-lamp較lamp敏感性強。

      以羅氏培養(yǎng)法為金標準,用rt-lamp與lamp檢測方法分別對122例痰標本進行檢測,3種方法檢出率為:rt-lamp100%、lamp法92%、培養(yǎng)法88%,利用統(tǒng)計分析軟件為spss19.0統(tǒng)計結(jié)果的靈敏度、特異度。

      檢測結(jié)果比較用卡方檢驗,p<0.05認為兩者有統(tǒng)計學差異。rt-lamp與scm差異有統(tǒng)計學意義(p<0.01,見表1),lamp和scm差異無統(tǒng)計學意義(p>0.05,見表1),rt-lamp與lamp差異在統(tǒng)計學上有意義(p<0.05,見表1),rt-lamp陽性率高于lamp。

      表1臨床樣本陽性檢出率(%)

      表中:a-mtb患者,n=100;非mtb患者,n=22;b-rt-lamp與scm相比的靈敏度;c-lamp與scm相比的靈敏度;d-rt-lamp與lamp相比的靈敏度。

      實施例8rt-lamp與lamp方法分別檢測結(jié)核分枝桿菌活菌時溫度和檢測時效對比試驗

      將結(jié)核分枝桿菌菌液按照10倍梯度稀釋,取各稀釋度菌液2ml分別提取rna與dna,rna的提取方法與實施例3中相同,dna的提取利用dna提取試劑盒[細菌dna提取試劑盒購自生工生物工程(上海)股份有限公司]按照現(xiàn)有的提取手段,提取樣品dna。利用rt-lamp與lamp檢測方法對結(jié)核分枝桿菌進行檢測,分別測試兩種方法的擴增時效及在不同的擴增溫度下擴增效果,重復(fù)3次以上實驗,其中rt-lamp檢測方法即進行rna的反轉(zhuǎn)錄擴增,即擴增體系中含有提取后的rna模板,lamp檢測方法即進行dna的擴增,即擴增體系中含有提取后的dna模板,rt-lamp檢測方法與實施例3相同,lamp的檢測方法為現(xiàn)有的檢測方法。

      具體的結(jié)果見圖2和圖3。

      由圖2可知,rt-lamp的最適溫度為60°c;

      由圖3可知,rt-lamp30min即可完成擴增。

      實施例1-6,僅是本發(fā)明的較佳實施例而已,并非是對本發(fā)明所作的其它形式的限定,任何熟悉本專業(yè)的技術(shù)人員可能利用上述技術(shù)內(nèi)容作為啟示加以變更或改型為等同變化的等效實施例。但凡是未脫離本發(fā)明權(quán)利要求的技術(shù)實質(zhì),對以上實施例所作出的簡單修改、等同變化與改型,仍屬于本發(fā)明權(quán)利要求保護的范圍。

      sequencelisting

      <110>中國人民解放軍白求恩國際和平醫(yī)院

      <120>rt-lamp檢測結(jié)核分枝桿菌活菌的引物組合物、相應(yīng)的試劑盒及檢測方法

      <130>2017.5.25

      <160>5

      <170>patentinversion3.3

      <210>1

      <211>18

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>正向外引物f3

      <400>1

      tcctggctcaggacgaac18

      <210>2

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>反向外引物b3

      <400>2

      cgctttccaccacaagacat20

      <210>3

      <211>40

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>正向內(nèi)引物fip

      <400>3

      tcgccactcgagtatctccgaagcggcgtgcttaacacat40

      <210>4

      <211>40

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>反向內(nèi)引物bip

      <400>4

      agtaacacgtgggtgatctgccatcccgtggtcctatccg40

      <210>5

      <211>20

      <212>dna

      <213>人工序列

      <220>

      <223>反向環(huán)引物lb

      <400>5

      ataagcctgggaaactgggt20

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