本發(fā)明涉及一種合成固定化酶材料的方法，具體涉及一種利用高內相pickering乳液模板法合成am/bis聚合物材料的方法，屬于高分子材料技術領域。

背景技術：

木質素是一種在自然界中廣泛存在的可再生的有機資源，地球生每年會產生大量的木質素，由于木質素含多活性官能團的特點，主要用作混凝土減水劑、瀝青乳化劑、稠油降粘劑、表面活性劑、橡膠補強劑、樹脂膠粘劑等。國內外很多研究者，正致力于開發(fā)廉價的木質素吸附材料用于替代離子交換樹脂和活性炭等昂貴的材料。高內相乳液是基于在高內相乳液的連續(xù)相中加入聚合物單體，通過引發(fā)聚合物反應形成交聯(lián)網絡而固化連續(xù)相，隨后除去嵌入整個材料中的分散液滴而獲得。其最大的特點就是高空隙率和低密度，可提供極好的液體吸附能力。但同時，高空隙率也使得材料的機械性能較差，如此薄弱的支撐結構大大限制了其應用的范圍。pickering乳液是由固體粒子代替表面活性劑穩(wěn)定的乳液，相比傳統(tǒng)的乳液，pickering乳液模板具有更強的穩(wěn)定性，能夠有效防止自組裝過程中，乳滴或聚電解質的團聚。所以用木質素作為原料，可以通過各種發(fā)應摻雜到材料中，使材料的性能有所提高，也可以作為一種粒子表面活性劑代替?zhèn)鹘y(tǒng)的表面活性劑制備pickering乳液，節(jié)約成本，減少毒害。

本發(fā)明以蔗渣木質素粒子作為乳液的穩(wěn)定劑，以丙烯酰胺作為單體，利用高內相pickering乳液模板法，制作多孔的聚丙烯酰胺材料，與傳統(tǒng)的方法比較，該方法制備的多孔材料有豐富的多孔結構，且機械強度性能強，重復使用性能好，可用于蛋白酶的固定化。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是利用高內相pickering乳液模板法合成固定化酶的材料。

一、木質素粒子穩(wěn)定的高內相pickering乳液的制備

本發(fā)明利用高內相pickering乳液模板法合成固定化酶材料的方法，其特征在于，以naoh水溶液為連續(xù)相，有機溶劑為有機分散相，蔗渣木質素粒子作為穩(wěn)定劑，以丙烯酰胺為單體在引發(fā)劑和交聯(lián)劑的存在下，合成固定化酶的材料。其具體制備工藝為：首先在800rpm攪拌24h下制備木質素粒子溶液，將am/bis/aps混合液加入到經磁力攪拌后的木質素粒子溶液中，充分震蕩混合得到高內相乳液的水相，在向水相中加入有機相，得到穩(wěn)定的高內相乳液，最終高內相pickering乳液體系轉移到玻璃試管中，于30℃～90℃，反應12h～48h后，索氏提取12h～48h，將材料切成碎片，置于表面皿中除去蓖麻油，最后材料冷凍干燥，得到固定化酶材料。

所述丙烯酰胺(am)和n,n'-亞甲基雙丙烯酰胺(bis)的比例為29：5～29：12。

所訴有機分散相為正辛烷和液體石蠟，其內相體積分數為75％～85％。

所訴木質素粒子的濃度為4％～8％，其蔗渣木質素的活性官能團總羥基為9.38％、總酸性基4.48％、總羧基0.84％。

二、合成固定化酶材料的結構、形貌表征

下面通過掃描電鏡(sem)和紅外光譜表征手段，對本發(fā)明的利用高內相pickering乳液模板法合成固定化酶的材料結構形貌進行分析。

三、固定化酶/游離酶酶學性質考察

1、固定化酶/游離酶最適反應溫度

改變酶催化水解的溫度27℃、32℃、37℃、42℃、47℃、52℃，測定固定化酶/游離酶的酶活，以最大酶活為1，計算不同溫度下的相對酶活。

2、固定化酶/游離酶最適反應ph

調節(jié)反應中使用的溶液的ph為5.5、6、6.5、7、7.5、8、8.5、9，測定固定化酶/游離酶的酶活，以最大酶活為1，計算不同ph相對酶活。

3、固定化酶/游離酶的溫度的穩(wěn)定性

將固定化酶和游離酶酶液置于50℃、60℃、70℃保溫，每隔1h取出一定量的固定化酶和游離酶酶液，在最適酶解反應ph和最適反應溫度下，測定固定化酶/游離酶的酶活，以未經高溫處理的固定化酶和游離酶酶液的酶活為1，測定不同溫度下，隨時間的增加剩余的相對酶活。

4、重復使用性

將固定化酶催化水解木瓜蛋白酶酶液后，測定酶活，回收固定化酶，洗滌，冷凍干燥，進行下一次固定化酶酶活測定，循環(huán)使用5次，測定每次使用后相對于第一次的酶活。

采用本發(fā)明合成固定化酶的材料的優(yōu)點：

(1)本發(fā)明的制備的多孔材料會有豐富的多孔結構。

(2)機械強度較高，具有較強的重復使用性能。

附圖說明

圖1木質素粒子濃度6％、內相體積80％、am水相中濃度16％、am：bis29：5的配方掃描電鏡圖。

圖2木質素粒子濃度6％、內相體積85％、am水相中濃度16％、am：bis29：5的配方掃描電鏡圖。

圖3木質素粒子濃度6％、內相體積85％、am水相中濃度24％、am：bis29：5的配方掃描電鏡圖。

圖4木質素粒子濃度6％、內相體積80％、am水相中濃度16％、am：bis29：12的配方掃描電鏡圖。

圖5am、bis和am/bis的紅外光譜圖。

圖6溫度對固定化酶/游離酶酶活力的影響。

圖7ph對固定化酶/游離酶酶活力的影響。

圖8孵育時間對固定化酶/游離酶酶活力的影響。

圖9固定化木瓜蛋白酶的重復使用穩(wěn)定性。

具體實施方式

實施例1

穩(wěn)定的am/bis高內相乳液配方為木質素離子濃度為6％、內相體積80％、am水相中濃度16％、am：bis29：5制得的聚合物如圖1，當木質素粒子的濃度為6％時，理論蛋白包埋率80％，酶活回收率8％。聚合物內部出現(xiàn)了明顯的球形孔洞，這是由于am與bis聚合反應發(fā)生在水相當中，當除去水相包裹的蓖麻油時，形成這樣球形孔洞，同時能觀察到，在這球形孔洞上形成了明顯的通孔結構，這是由于，在反應過程中am聚合，體積收縮。一般來說，表面活性劑的量越多，形成的油水界面的膜越薄，在反應過程中，由于體積收縮導致的通孔越明顯，木質素粒子在本實驗中起到表面活性劑的作用，因此能觀察到更多的窗孔的結構。

實施例2

穩(wěn)定的am/bis高內相乳液配方為木質素粒子濃度6％、內相體積85％、am水相中濃度16％、am：bis29：5制得的聚合物如圖2，內相體積分數到85％時，理論蛋白包埋率78％，酶活回收率8％?？谞罱Y構已經不明顯，大部分為通孔，這是由于，隨著內相體積分數的增大，需要更多的木質素去保持油水界面的穩(wěn)定，如果木質素粒子的量不增大，乳液滴的平均尺寸將會增大，其油水界面膜會變的更薄，反應中會導致更多的通孔形成，作為油相的蓖麻油在通孔之間流動，使本應成孔狀的結構發(fā)生形變，大的孔狀結構不再明顯。

實施例3

穩(wěn)定的am/bis高內相乳液配方為木質素粒子濃度6％、內相體積85％、am水相中濃度24％、am：bis29：5制得的聚合物如圖3，理論蛋白包埋率85％，酶活回收率45％。明顯可以看出，聚合物的結構的厚度高，其表面的通孔結構的直徑較小，這是由于單體濃度增大，導致界面膜處的反應單體濃度增大，聚合過程的收縮對界面膜的影響相對較小。圖5所示，1640cm^-1是c＝c的震動吸收峰，當am自身發(fā)生聚合發(fā)硬或者與bis交聯(lián)聚合后這個峰的吸收振動明顯降低，在am/bis聚合物中只能觀察到1680cm^-1的c＝o振動吸收，因為這個集團不參與聚合反應，同樣的3100cm^-1的吸收峰也是由于聚合反應發(fā)生后導致c-h振動消失。

實施例4

穩(wěn)定的am/bis高內相乳液配方為木質素粒子濃度6％、內相體積80％、am水相中濃度16％、am：bis29：12制得的聚合物如圖4，理論蛋白包埋率80％，酶活回收率7％。聚合物上的通孔結構比更小，更密集，這是由于bis作為交聯(lián)劑參反應，增強了材料的機械性能，使得界面膜在反應過程中能抵抗更大的由聚合過程產生的收縮的力，這會導致更小的通孔形成，同時整個材料的穩(wěn)定性更好，不會由于蓖麻油在孔之間的流動產生大的形變，整個材料比較均勻，通孔直徑相差不大。

實施例5

固定化酶/游離酶酶學性質的考察，測定不同溫度下的相對酶活，其中f％表示游離酶的相對酶活，e％表示固定化酶的相對酶活，如圖6，游離酶的酶活在37℃達到最高，升高或降低溫度都會使其酶活有所下降，在52℃時，酶活只有70％左右，而固定化酶活隨著溫度的升高，酶活基本沒有下降，其適用溫度范圍明顯增大。

測定不同ph下的相對酶活，如圖7，游離酶的最適ph在7.0，而固定化酶的最適ph在7.5，酶分子中含有-nh2和-cooh兩種基團，在酸性環(huán)境中-nh2以-nh³⁺形式存在，在堿性環(huán)境中-cooh以-coo^-形式存在，這兩種粒子對酶的活性中心起到關鍵作用，當酶固定到載體上時，會造成酶分子上的-nh2和-cooh數目的改變，同時載體上的基團也會對反應溶液介質的ph值有一定的影響，因此游離酶和固定化酶的最適ph值一般會發(fā)生偏移。

測定固定化酶/游離酶的溫度穩(wěn)定性，如圖7，同一高溫下，隨著孵育的時間延長，游離酶的相對酶活快速下將，70℃經過6h的孵育其酶活只剩13％，而固定化酶的酶活仍有55％，不同溫度下，越高的溫度使酶失活越嚴重。固定化酶能有效抑制因為高溫帶來的酶活減弱，在受熱情況下，酶內部結構會從緊密有序的狀態(tài)轉變?yōu)殡S機松散的狀態(tài)，內部的折疊結構被打開，導致酶催化的能力下降，固定化酶與載體結合以后，其內部結構變得具有剛性，不易受熱打開，同時能夠對由受熱帶來的內部基團的震動，而時酶的穩(wěn)定增強。從圖中也能看出，固定化酶比游離酶具有更好的熱穩(wěn)定性。

測定固定化酶重復使用后的相對酶活，如圖8，在每次使用后固定化酶的活力都有一定的下降，這可能是使用過程中酶分子與載體分離，導致酶量的減少，酶活下降，但在使用五次以后仍有40％左右的酶活，說明am/bis聚合物作為固定木瓜蛋白酶的載體有一定的可行性的。