本發(fā)明屬于生物工程領(lǐng)域，具體地說，涉及一種通過微生物發(fā)酵生產(chǎn)(r)-3-羥基丁酸及其鹽的方法。
背景技術(shù)：
(r)-3-羥基丁酸((r)-3-hydroxybutyrate，3hb)是一種具有光學(xué)活性的手性化合物，cas號為625-72-9。(r)-3-羥基丁酸是哺乳動物體內(nèi)由肝臟內(nèi)的長鏈脂肪酸代謝而產(chǎn)生的化合物，作為主要的酮體存在于血漿和外周組織中，可以用作身體大部分組織中的能量來源。(r)-3-羥基丁酸除了具有營養(yǎng)功能之外，還具有治療許多疾病的作用，包括：1、可以治療許多得益于酮體水平提高的疾病(如包括癲癇和肌陣攣的神經(jīng)紊亂疾病以及包括阿爾茲默癥和癡呆等的神經(jīng)退化性疾病)；2、通過氧化輔酶q來減少自由基傷害(如缺血癥)；3、加強代謝效率(提高訓(xùn)練效率以及運動成績，治療供養(yǎng)不足、心絞痛、心肌梗塞等)；4、治療如癌癥尤其是腦癌(如星細胞瘤等)相關(guān)的疾?。?、對于糖代謝紊亂(如i型糖尿病、ii型糖尿病、低血糖低酮體癥等)具有很好的療效；6、可以用于防治骨質(zhì)減少(osteopenia)、骨質(zhì)疏松癥、重度骨質(zhì)疏松癥以及相關(guān)骨折等?；谶@些功能，(r)-3-羥基丁酸及其鹽可以用作食品添加劑和藥物，具有巨大的保健和藥用價值。
(r)-3-羥基丁酸的制備主要為化學(xué)法，包括直接化學(xué)合成(r)-3-羥基丁酸、使用聚3-羥基丁酸解聚酶通過酶法降解聚3-羥基丁酸酯生產(chǎn)(r)-3-羥基丁酸。化學(xué)合成(r)-3-羥基丁酸的方法需要高溫、高壓的反應(yīng)條件以及昂貴的手性金屬催化劑等；而酶法降解聚3-羥基丁酸生產(chǎn)(r)-3-羥基丁酸需要耗費大量的有機溶劑，反應(yīng)時間較長，并且需要高純度的聚3-羥基丁酸酯作為起始物，并極易產(chǎn)生消旋化，但該方法目前還處于實驗室水平，如果進入工業(yè)化大生產(chǎn)仍然存在成本高、產(chǎn)率低等問題。
目前，市場上銷售的大部分3-羥基丁酸為消旋體，即(r)-3-羥基丁酸和(s)-3-羥基丁酸的等量混合物。雖然研究表明(s)-3-羥基丁酸沒有生理活性，但消旋的3-羥基丁酸及其鹽尤其是鈉鹽目前仍然是主要的商品形式并被廣大消費者接受?？梢灶A(yù)期，單一光學(xué)活性的(r)-3-羥基丁酸及其鹽今后應(yīng)當會逐漸成為消費市場主流，取代無光學(xué)活性的3-羥基丁酸及其鹽。
人們普遍認為天然或生物來源的化合物更安全，對于藥品、食品、化妝品成分的來源越來越追求“天然化”。出于市場推廣目的，藥品、食品、化妝品生產(chǎn)商都更樂意使用生物來源的產(chǎn)品來替代化學(xué)方法合成出來的相同物質(zhì)。(r)-3-羥基丁酸作為廣泛使用的天然化合物，尋找一種生物方法替代化學(xué)方法來生產(chǎn)已成為一種研究熱點。
技術(shù)實現(xiàn)要素：
為了實現(xiàn)生物方法來生產(chǎn)“安全無毒”的(r)-3-羥基丁酸，發(fā)明人對于微生物一步發(fā)酵法進行了探索，選擇無致病性的微生物作為宿主，利用基因工程技術(shù)進行改造，通過增強與(r)-3-羥基丁酸生物合成相關(guān)的基因的表達，弱化分支代謝途徑，篩選出高產(chǎn)(r)-3-羥基丁酸的生產(chǎn)菌株。這幾種(r)-3-羥基丁酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中能有效地積累(r)-3-羥基丁酸，具有廣闊的工業(yè)化應(yīng)用前景。
因此，本發(fā)明的第一個目的在于提供一種生產(chǎn)(r)-3-羥基丁酸的方法。
本發(fā)明的第二個目的在于提供一種食品級的(r)-3-羥基丁酸及其鹽。
本發(fā)明的第三個目的在于提供食品級的消旋體3-羥基丁酸及其鹽，以滿足市場的需要。
本發(fā)明的第四個目的在于提供一種(r)-3-羥基丁酸生產(chǎn)菌。
本發(fā)明包括如下技術(shù)方案：
一種生產(chǎn)(r)-3-羥基丁酸的方法，采用無致病性的微生物，通過發(fā)酵直接將碳源和氮源轉(zhuǎn)化為(r)-3-羥基丁酸，所述微生物中產(chǎn)生的(r)-3-羥基丁酸分泌到發(fā)酵液中，從發(fā)酵液中提取純化(r)-3-羥基丁酸，
所述微生物選自谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、散枝短桿菌、黃色短桿菌和產(chǎn)氨短桿菌，并且所述微生物具有下述依次進行的生物轉(zhuǎn)化功能：使碳源與輔酶a轉(zhuǎn)化為乙酰輔酶a；將乙酰輔酶a轉(zhuǎn)化為乙酰乙酰輔酶a；將乙酰乙酰輔酶a轉(zhuǎn)化為(r)-3-羥基丁酰輔酶a；將(r)-3-羥基丁酰輔酶a轉(zhuǎn)化為(r)-3-羥基丁酸。
優(yōu)選地，所述微生物過表達一種以上選自下組的酶：琥珀酰輔酶a轉(zhuǎn)移酶(succinyl-coatransferase)、乙酰乙酰輔酶a合成酶(acetoacetyl-coasynthetase)、乙酰乙酰輔酶a還原酶(acetoacetyl-coareductase、硫酯酶(thioesterase)。
更優(yōu)選所述微生物過表達乙酰乙酰輔酶a合成酶、乙酰乙酰輔酶a還原酶。
優(yōu)選地，所述微生物抑制或下調(diào)β-酮硫解酶(β-ketothiolase)的表達。
在優(yōu)選的實施方式中，所述微生物是谷氨酸棒桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13957。
發(fā)酵過程中，對于不同的微生物，可采用不同的培養(yǎng)基，其中所述碳源可以選自葡萄糖、蔗糖、麥芽糖、糖蜜、淀粉和甘油。發(fā)酵培養(yǎng)基中的氮源可以選自有機氮源和無機氮源，所述有機氮源選自玉米漿、麩皮水解液、豆餅水解液、酵母浸膏、酵母粉、蛋白胨和尿素；所述無機氮源選自硫酸銨、硝酸銨、或氨水。
根據(jù)本發(fā)明的優(yōu)選實施例，當微生物采用谷氨酸棒桿菌時，發(fā)酵培養(yǎng)基組成如下：葡萄糖75g/l、玉米漿25-30g/l、(nh4)2so420g/l、kh2po41.5g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、尿素1.0g/l、組氨酸30mg/l、糖蜜25g/l、生物素100μg/l，消泡劑0.2g/l。
優(yōu)選地，當發(fā)酵過程中進行補料，即采取分批補料培養(yǎng)方式時，所使用的補料培養(yǎng)基組成如下：硫酸銨500g/l、葡萄糖650g/l。
本發(fā)明方法制備的(r)-3-羥基丁酸純度達到95％以上、優(yōu)選96％以上、97％以上、98％以上，更優(yōu)選99％以上。
通過上述方法制備的(r)-3-羥基丁酸不含細菌內(nèi)毒素，并且無化學(xué)異味比如苦味和溶劑殘留。
(r)-3-羥基丁酸是一種酸，可以與堿形成鹽?？蛇x地，本發(fā)明的(r)-3-羥基丁酸呈鹽的形式，比如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽；優(yōu)選鈉鹽。這些鹽也都可以是光學(xué)活性化合物。
考慮到消旋體3-羥基丁酸及其鈉鹽在傳統(tǒng)上已經(jīng)被食品和藥品生產(chǎn)廠商、以及消費者所接受，可以對(r)-3-羥基丁酸及其鹽經(jīng)消旋化處理來制備外消旋的3-羥基丁酸及其鹽。例如，通過將(r)-3-羥基丁酸在堿性溶液比如氫氧化鈉溶液中加熱并保溫一定時間，可以實現(xiàn)消旋化。
消旋體3-羥基丁酸鹽可以是3-羥基丁酸鈉、3-羥基丁酸鉀、3-羥基丁酸鎂、3-羥基丁酸鈣或者上述混合鹽。
通過本發(fā)明的方法制備的(r)-3-羥基丁酸及其鹽，不含細菌內(nèi)毒素，也不包含有毒害性的化學(xué)物質(zhì)，因此可以保障其食品安全性。另外，由于不含化學(xué)殘留物或化學(xué)反應(yīng)雜質(zhì)，本發(fā)明的(r)-3-羥基丁酸不含化學(xué)異味比如苦味，可以直接用于制作藥品和保健品。
一種谷氨酸棒桿菌，保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏編號為cgmccno.13957。
本發(fā)明所構(gòu)建的(r)-3-羥基丁酸生產(chǎn)菌在發(fā)酵過程中能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵液中(r)-3-羥基丁酸的有效積累，得到食品級的(r)-3-羥基丁酸，因而具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。
本發(fā)明構(gòu)建的(r)-3-羥基丁酸高產(chǎn)基因工程菌的拉丁學(xué)名是corynebacteriumglutamicum，中文名稱是谷氨酸棒桿菌或谷氨酸棒狀桿菌，已保藏于中國微生物菌種保藏管理委員會普通微生物中心，保藏日期是2017年3月30日，保藏地址為北京市朝陽區(qū)北辰西路1號院3號中國科學(xué)院微生物研究所，保藏編號為cgmccno.13957。
具體實施方式
以下結(jié)合具體實施例對本發(fā)明做進一步詳細說明。應(yīng)理解，以下實施例僅用于說明本發(fā)明而非用于限定本發(fā)明的范圍。
本文中涉及到多種物質(zhì)的添加量、含量及濃度，其中所述的百分含量，除特別說明外，皆指質(zhì)量百分含量。
本發(fā)明的實施例中，如果對于操作溫度沒有做出具體說明，則該溫度通常指室溫(15-30℃)。
在本文中，術(shù)語“谷氨酸棒桿菌”、“谷氨酸棒狀桿菌”、“菌株cgmccno.13957”表示相同的意義，都是指發(fā)明人構(gòu)建的用于發(fā)酵生產(chǎn)(r)-3-羥基丁酸的菌株。
為了滿足消費者以及藥品和食品生產(chǎn)商對于(r)-3-羥基丁酸及其鹽、3-羥基丁酸及其鹽“天然化”或“生物化”來源的追求，發(fā)明人研究了用微生物發(fā)酵來生產(chǎn)(r)-3-羥基丁酸的方法。發(fā)明人對于用于構(gòu)建基因工程菌株的微生物品種進行了篩選，摒棄了雖然常用、但有潛在致病性的微生物比如大腸肝菌，選擇無致病性的谷氨酸棒桿菌、枯草芽孢桿菌、乳糖發(fā)酵短桿菌、散枝短桿菌、黃色短桿菌和產(chǎn)氨短桿菌等作為宿主，構(gòu)建了基因工程菌，通過篩選，得到可通過一步發(fā)酵生產(chǎn)(r)-3-羥基丁酸的幾種菌株。這些菌株在發(fā)酵過程中不會產(chǎn)生可能對于大部分人群造成危害的內(nèi)毒素，符合“無毒無害”的設(shè)計思想。
在發(fā)酵過程中，為了得到較高的(r)-3-羥基丁酸產(chǎn)率，可以對溶氧、溫度、ph等條件進行必要的調(diào)節(jié)和控制。
優(yōu)選進行發(fā)酵時，常數(shù)do2控制在15％～25％。例如發(fā)酵可以在下述條件下進行：空氣流量約為1vvm，其中vvm(通氣比)是每分鐘通氣量與罐體實際料液體積的比值(例如，對于一個含有30升發(fā)酵液的發(fā)酵罐，1vvm等于30l/min；而對于一個含有5升發(fā)酵液的發(fā)酵罐，1vvm等于5l/min)。
優(yōu)選進行發(fā)酵時，溫度控制在30～32℃；在發(fā)酵后期，可將溫度提高到34～37℃，以便于(r)-3-羥基丁酸的合成和排到發(fā)酵液中。
優(yōu)選進行發(fā)酵時，ph控制在ph6.0-8.0，優(yōu)選ph6.5～7.0；在發(fā)酵后期，可將ph控制在6.8～7.0，以便于(r)-3-羥基丁酸的合成和排到發(fā)酵液中。
上述的術(shù)語“發(fā)酵后期”是指微生物生長平臺期至衰亡期。比如用od600nm值監(jiān)測微生物濃度時，od600nm值不再上升并且趨于下降。
整個發(fā)酵過程殘?zhí)强刂圃?％～3.0％左右，更優(yōu)選控制在1.5％～2.5％。
發(fā)酵結(jié)束后，需要對發(fā)酵液進行回收，從中提取(r)-3-羥基丁酸。例如，通過離心方法得到除去菌體的上清液，必要時濃縮上清液；通過干燥、純化等后處理手段，分離出(r)-3-羥基丁酸?；蛘咄ㄟ^過濾(包括超濾、納濾等)方法除去菌體和大分子物質(zhì)，得到濾液，必要時濃縮濾液；再通過干燥、純化等后處理手段，分離出(r)-3-羥基丁酸。或者通過離心方法得到除去菌體的上清液，再通過超濾或納濾等方法除去大分子物質(zhì)，得到濾液，必要時濃縮濾液；再通過干燥、純化等后處理手段，分離出(r)-3-羥基丁酸。
在制備(r)-3-羥基丁酸鹽比如鈉鹽、鉀鹽、鎂鹽、鈣鹽時，應(yīng)等當量的(r)-3-羥基丁酸與相應(yīng)的堿或金屬氧化物比如氫氧化鈉的反應(yīng)溫度控制在30℃以下、優(yōu)選25℃以下、更優(yōu)選以下20℃以下，盡量避免消旋發(fā)生。
由于制備過程中不使用有機溶劑，所得到的(r)-3-羥基丁酸及其鹽產(chǎn)品不含化學(xué)異味比如苦味，可直接用于藥品、保健品的制造。
實施例
實施例1：預(yù)培養(yǎng)和發(fā)酵
將裝在甘油管中的菌株cgmccno.13957保藏液解凍，接種于種子培養(yǎng)基(葡萄糖75g/l、玉米漿25-30g/l、(nh4)2so420g/l、kh2po41.5g/l、mgso4·7h2o0.5g/l、尿素1.0g/l、組氨酸30mg/l、糖蜜25g/l、生物素100μg/l，ph7.0)中，5000ml三角瓶裝液量500ml，30℃培養(yǎng)18小時，吸光度值δod＝0.4-0.5時下?lián)u床，得種子培養(yǎng)液。經(jīng)檢測，無雜菌。
將500ml種子培養(yǎng)液接種于7升發(fā)酵罐中，裝液量5升。培養(yǎng)基成分與種子培養(yǎng)基相同，ph＝6.4～6.7(滅菌后)。補料培養(yǎng)基：硫酸銨500g/l、葡萄糖650g/l。培養(yǎng)溫度30℃，罐壓0.05mpa，初始通氣比1vvm。攪拌600rpm。發(fā)酵時ph控制在ph6.5左右；在發(fā)酵后期，將ph控制在6.7左右，將溫度提高到35℃左右。通風量和攪拌轉(zhuǎn)速的調(diào)節(jié)是根據(jù)溶氧靈活控制的，溶氧常數(shù)do2控制在15～25％。殘?zhí)强刂疲寒敵跆墙抵?.0％左右時，開始流加補料，整個發(fā)酵過程殘?zhí)强刂圃?.5％～2.0％左右。發(fā)酵總時間為72小時，產(chǎn)品(r)-3-羥基丁酸濃度11.5g/l。
實施例2：發(fā)酵液的分離和(r)-3-羥基丁酸的提取純化
將實施例1中所得5.2升發(fā)酵液在4500rpm下離心，棄去菌體。上清液中加1％硅藻土后過濾。然后加入1％活性炭，攪拌脫色30分鐘后過濾，得清澈的濾液。
用納濾膜對濾液進行納濾處理，所得濾液過732陽離子交換樹脂，收集穿透液。濃縮至1000g/l，呈油狀物，趁熱倒出，得到55.9g(r)-3-羥基丁酸，收率91％。采用高效液相色譜測定(r)-3-羥基丁酸純度。色譜柱為shim-packvp-odsc18柱(150l×4.6)，流動相為乙腈：水(v/v)＝15：85，紫外檢測波長為210nm，進樣量20μl，流速1ml/min，柱溫10℃。經(jīng)檢測，(r)-3-羥基丁酸的純度為99.2％，比旋光度：[α]d20＝-25.1°(c＝6％，h2o)。
實施例3：(r)-3-羥基丁酸鈉的制備
將5g實施例2中得到的(r)-3-羥基丁酸緩慢加入到等當量的2n氫氧化鈉溶液中進行中和反應(yīng)，反應(yīng)溫度控制在在25℃以下。旋蒸濃縮至有固體析出，靜置2小時，抽濾收集固體，60℃鼓風干燥，得到4.8克(r)-3-羥基丁酸鈉粉末，收率79％。熔點為152℃，比旋光度：[α]d20＝-14.2°(c＝10％，h2o)。
實施例4：(r)-3-羥基丁酸的消旋化
將10g的(r)-3-羥基丁酸緩慢加入到100ml的2n氫氧化鈉溶液中，加熱到60℃反應(yīng)4小時。降至室溫，旋光儀測定旋光度為0°。用鹽酸中和至ph7.0，旋蒸濃縮至有固體析出，靜置2小時，抽濾收集固體，得到3-羥基丁酸鈉粉末10.8g，收率89％，旋光儀測定旋光度為0°(c＝10％，h2o)。結(jié)果表明得到的是消旋3-羥基丁酸鈉。
綜上所述，本發(fā)明所構(gòu)建的(r)-3-羥基丁酸基因工程菌在發(fā)酵過程中能夠?qū)崿F(xiàn)發(fā)酵液中(r)-3-羥基丁酸的有效積累，生產(chǎn)出安全無毒的食品級(r)-3-羥基丁酸，具有廣闊的工業(yè)應(yīng)用前景。