本申請(qǐng)是中國(guó)專利申請(qǐng)200880023017.1的分案申請(qǐng)，原申請(qǐng)的申請(qǐng)日是2008年5月9日，發(fā)明名稱是“新除草劑抗性基因”。發(fā)明背景雜草可以迅速耗盡土壤中作物和其他目的植物所需的有價(jià)值的養(yǎng)分。目前有多種不同類型的除草劑用于控制雜草。一種特別流行的除草劑是草甘膦。已經(jīng)開發(fā)了對(duì)草甘膦具有抗性的作物，如玉米、大豆、蕓苔、棉花、甜菜、小麥、草坪草和稻。因此可以例如對(duì)草甘膦抗性大豆生長(zhǎng)活躍的田地噴灑草甘膦以控制雜草而不顯著損害大豆植物。隨著二十世紀(jì)九十年代中期遺傳改造的草甘膦耐性作物(gtc)的引入，在農(nóng)業(yè)中前所未有地使種植者能夠以簡(jiǎn)單、便利、靈活且廉價(jià)的工具控制廣譜闊葉和禾本科雜草。因此，生產(chǎn)者們迅速采用了gtc，并在很多情況下放棄了多種公認(rèn)最佳的農(nóng)業(yè)實(shí)踐，如作物輪作、除草劑作用方式輪作、罐混、將雜草的化學(xué)防治和栽培防治與機(jī)械防治有機(jī)結(jié)合起來。目前在美國(guó)和西半球其他地方可以購(gòu)買到草甘膦耐性大豆、棉花、玉米和蕓苔。苜蓿是第一種引入的多年生gtc，助長(zhǎng)了在一定的年限內(nèi)反復(fù)地對(duì)相同的作物和田地重復(fù)使用甘草膦的可能性。取決于全球市場(chǎng)的接受度，更多的gtc(如小麥、稻、甜菜、草坪草等等)正準(zhǔn)備引入。許多其他草甘膦抗性物種正處于實(shí)驗(yàn)至開發(fā)階段(如甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、洋蔥、草莓、番茄和煙草；林業(yè)物種如白楊和香楓；園藝物種如金盞花、矮牽?；ê颓锖Ｌ?；參閱站點(diǎn)“isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm,2005”)。此外，近年來草甘膦的費(fèi)用已經(jīng)急劇降低，達(dá)到了幾乎沒有常規(guī)雜草控制程序能在價(jià)格和性能上與草甘膦gtc系統(tǒng)有效競(jìng)爭(zhēng)的程度。草甘膦已經(jīng)在滅生(burndown)地區(qū)和其他非作物地區(qū)成功用于總植被控制15年以上。在許多情況下(如對(duì)于gtc)，可以在連續(xù)的3、5、10直至15年中每年使用草甘膦1-3次。這些情況已經(jīng)導(dǎo)致對(duì)草甘膦和gtc技術(shù)的過度依賴，并對(duì)天然雜草物種中對(duì)草甘膦天然更具耐受性或已經(jīng)發(fā)展出抗草甘膦除草劑活性機(jī)制的植物施加了高選擇壓。僅用草甘膦的雜草控制程序的廣泛使用正導(dǎo)致對(duì)草甘膦抗性雜草的選擇，并且正在選擇固有地比多數(shù)靶物種更能耐受草甘膦的雜草物種后代(即雜草演替)(powles和preston，2006；ng等,2003；simarmata等,2003；lorraine-colwill等,2003；sfiligoj,2004；millar等,2003；heap,2005；murphy等,2002；martin等,2002)。盡管草甘膦已經(jīng)在全球廣泛使用15年以上，僅有少數(shù)雜草據(jù)報(bào)道已發(fā)展出對(duì)草甘膦的抗性(heap,2005)，然而它們中的大多數(shù)都鑒定于過去的5年?？剐噪s草包括禾本科植物和闊葉物種―硬直黑麥草(loliumrigidum)、多花黑麥草(loliummultiflorum)、牛筋草(eleusineindica)、假高梁(sorghumhalepense)、豚草(ambrosiaartemisiifolia)、小飛蓬(conyzacanadensis)、野塘蒿(conyzabonariensis)、長(zhǎng)葉車前(plantagolanceolata)、長(zhǎng)芒莧(amaranthuspalmerii)和amaranthusrudis。此外，在廣泛使用gtc之前并不是農(nóng)業(yè)問題的雜草現(xiàn)在開始大大盛行，并且難于在gtc的范圍內(nèi)(包括＞80％的美國(guó)棉花和大豆地區(qū)和＞20％的美國(guó)玉米地區(qū))控制(gianessi,2005)。這些雜草演替主要與(但不僅與)難于控制的闊葉雜草一起出現(xiàn)。一些實(shí)例包括番薯屬(ipomoea)、莧屬(amaranthus)、藜屬(chenopodium)、蒲公英屬(taraxacum)和鴨跖草屬(commelina)的物種。在種植者要面對(duì)草甘膦抗性雜草或演替成更難于控制的雜草物種的地區(qū)，種植者可以通過罐混或換用能控制遺漏雜草的其他除草劑來彌補(bǔ)草甘膦的弱點(diǎn)。在許多情況下控制闊葉逃逸的一種流行且有效的罐混伴侶為2,4-二氯苯氧乙酸(2,4-滴)。2,4-滴已經(jīng)在農(nóng)業(yè)和非作物條件下用于廣譜闊葉雜草控制60年以上。已有關(guān)于更具耐性物種的個(gè)案報(bào)道，但2,4-滴仍是全球最廣泛使用的除草劑之一。對(duì)進(jìn)一步使用2,4-滴的限制在于它在雙子葉農(nóng)作物(如大豆或棉花)中的選擇性極差，因此2,4-滴一般不用于(且一般不靠近)敏感性雙子葉作物。此外，2,4-滴在禾本科作物中的用途在某種程度上受限于會(huì)發(fā)生的作物損傷的性質(zhì)。2,4-滴和草甘膦的組合已經(jīng)用于在種植免耕大豆和棉花之前提供更強(qiáng)的滅生處理，然而，由于這些雙子葉物種對(duì)2,4-滴的敏感性，這些滅生處理必須至少在種植前14-30天進(jìn)行(agriliance,2005)。和mcpa一樣，2,4-滴是苯氧酸類除草劑。2,4-滴已經(jīng)用于在許多單子葉作物(如玉米、小麥和稻)中選擇性控制闊葉雜草而不嚴(yán)重?fù)p傷目的作物植物。2,4-滴是合成的植物生長(zhǎng)素衍生物，其作用為使正常的細(xì)胞激素內(nèi)穩(wěn)態(tài)失調(diào)，并阻礙平衡的受控生長(zhǎng)，然而其確切的作用模式仍不了解。綠草定和氟草煙是吡啶氧乙酸類除草劑，其作用模式也與合成的植物生長(zhǎng)素相同。這些除草劑對(duì)某些植物具有不同水平的選擇性(如雙子葉植物比禾本科植物更敏感)。不同植物對(duì)這些除草劑的差異代謝是不同水平選擇性的一種解釋。通常植物緩慢代謝2,4-滴，因此靶位點(diǎn)的不同活性更可能解釋植物對(duì)2,4-滴不同的應(yīng)答(wssa,2002)。2,4-滴的植物代謝一般通過兩步代謝實(shí)現(xiàn)，通常是羥基化后接著與氨基酸或葡萄糖綴合(wssa,2002)。隨著時(shí)間的發(fā)展，微生物種群已經(jīng)發(fā)展出降解此特定外來物的有效的替代途徑，這導(dǎo)致2,4-滴的完全礦化。對(duì)微生物連續(xù)應(yīng)用除草劑選擇了能利用除草劑作為碳源生長(zhǎng)(從而使其在土壤中具有競(jìng)爭(zhēng)優(yōu)勢(shì))的微生物。因?yàn)檫@個(gè)原因，目前制備的2,4-滴具有相對(duì)短的土壤半衰期，并且沒有遇到對(duì)其后的作物明顯的延續(xù)效應(yīng)(carryovereffect)。這促進(jìn)了2,4-滴的除草劑應(yīng)用。已經(jīng)廣泛研究了其降解2,4-滴能力的一種生物是真養(yǎng)雷氏菌(ralstoniaeutropha)(streber等,1987)。編碼礦化途徑中第一個(gè)酶促步驟的基因?yàn)閠fda。參閱美國(guó)專利no.6,153,401和genbank登錄號(hào)m16730。tfda通過α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶反應(yīng)催化2,4-滴酸轉(zhuǎn)化成二氯苯酚(dcp)(smejkal等,2001)。dcp與2,4-滴相比幾乎不具有除草劑活性。tfda在轉(zhuǎn)基因植物中用于向通常對(duì)2,4-滴敏感的雙子葉植物(如棉花和煙草)賦予2,4-滴抗性(streber等(1989),lyon等(1989),lyon(1993)和美國(guó)專利no.5,608,147)。已在環(huán)境中鑒定了大量編碼能降解2,4-滴的蛋白質(zhì)的tfda型基因并已保存于genbank數(shù)據(jù)庫(kù)。許多同源物與tfda類似(氨基酸同一性>85％)并具有與tfda相似的酶特性。然而，有大量同源物與tfda具有顯著更低的同一性(25-50％)，但卻具有與α-酮戊二酸雙加氧酶fe+2雙加氧酶相關(guān)的特征性殘基。因此這些不同的雙加氧酶的底物特異性是什么并不明確。與tfda具有低同源性(氨基酸同一性35％)的獨(dú)特實(shí)例是來自sphingobiumherbicidovorans的sdpa(kohler等,1999,westendorf等,2002,westendorf等,2003)。已經(jīng)顯示此酶催化(s)-2,4-滴丙酸(和其他(s)-苯氧丙酸)以及2,4-滴(苯氧乙酸)礦化的第一步(westendorf等,2003)。迄今仍沒有將此基因轉(zhuǎn)化進(jìn)植物的報(bào)道。新除草劑耐受作物(htc)技術(shù)的開發(fā)很大程度上受到gtc的效力、低費(fèi)用和便利性的限制。因此，gtc在生產(chǎn)者中的采用率非常高。這很難刺激開發(fā)新的htc技術(shù)。芳氧基鏈烷酸酯化學(xué)亞結(jié)構(gòu)是許多商業(yè)除草劑(包括苯氧乙酸植物生長(zhǎng)素(如2,4-滴和2,4-滴丙酸)、吡啶氧乙酸植物生長(zhǎng)素(如氟草煙和綠草定)、芳氧基苯氧丙酸酯(aopp)乙酰輔酶a羧化酶(acc酶)抑制劑(如吡氟氯禾靈(haloxyfop)、喹禾靈(quizalofop)和禾草靈(diclofop))和5-取代的苯氧乙酸原卟啉原氧化酶ix抑制劑(如霸草靈(pyraflufen)和氟胺草酯(flumiclorac)))的通用實(shí)體。然而，這些除草劑類別的差別都很大，并且目前的文獻(xiàn)中沒有這些化學(xué)制品類別中共有的降解途徑的證據(jù)。最近已描述降解涵蓋多種作用模式的除草劑的多功能酶(pctus/2005/014737；2005年5月2日提交)。下文將描述另一種獨(dú)特的多功能酶和潛在用途。發(fā)明概述本發(fā)明提供不僅對(duì)2,4-滴具有抗性，而且還對(duì)吡啶氧乙酸類除草劑具有抗性的新植物。迄今為止，還沒有預(yù)期或提出可通過引入單個(gè)基因產(chǎn)生具有這兩種有利特性的植物。本發(fā)明還包括這樣的植物：其產(chǎn)生與一種或多種其他除草劑抗性基因(包括但不僅限于草甘膦-、als-(咪唑啉酮、磺酰脲)、芳氧基鏈烷酸酯-、hppd-、ppo-和草銨膦-抗性基因)“疊加”的一種或多種本發(fā)明的酶，以提供與更廣更多的強(qiáng)雜草控制和除草劑抗性管理選擇相容的除草劑耐性植物。本發(fā)明還包括利用本文舉例說明的基因和蛋白質(zhì)的同源物的方法和組合物。在一些實(shí)施方案中，本發(fā)明提供對(duì)2,4-滴、mcpa、氟草煙和一種或多種市售除草劑(如草甘膦、草銨膦、百草枯、als抑制劑(如磺酰脲類、咪唑啉酮類、三唑并嘧啶磺酰胺類等)、hppd抑制劑(如硝草酮(mesotrione)、異唑草酮(isoxaflutole)等)、麥草畏(dicamba)、溴草腈、芳氧基苯氧丙酸酯等等)具有耐受性的單子葉和雙子葉植物。還公開了含有負(fù)責(zé)這類除草劑耐性的核酸序列的載體以及將這些耐性植物和除草劑組合用于雜草控制和防止雜草種群演替的方法。本發(fā)明使得可以以新的方法使用除草劑的新組合。此外，本發(fā)明提供預(yù)防產(chǎn)生并控制對(duì)一種或多種除草劑(如草甘膦)具有抗性的雜草株系的新方法。本發(fā)明賦予除草劑和作物的新組合的新用途，包括在種植否則會(huì)對(duì)該除草劑(如2,4-滴)敏感的植物的種子之前對(duì)將種植的地區(qū)進(jìn)行的種植前應(yīng)用。本發(fā)明部分涉及酶的鑒定，所述酶不僅能降解2,4-滴，而且還令人吃驚地具有例如使本發(fā)明的酶區(qū)別于先前已知的tfda型蛋白質(zhì)的新特性。更具體的，本發(fā)明涉及能降解2,4-滴和吡啶氧乙酸類除草劑的酶的用途。先前已報(bào)道的α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶均不具有降解苯氧乙酸和吡啶氧乙酸類植物生長(zhǎng)素除草劑的能力。本發(fā)明使用的優(yōu)選酶和基因在本文中稱為aad-13(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶)。這一高度新穎的發(fā)現(xiàn)是重要的除草劑耐性作物(htc)性狀和選擇標(biāo)記可能性的基礎(chǔ)。本發(fā)明所述植物在其全部生命周期中具有抗性。之前沒有動(dòng)機(jī)產(chǎn)生含有aad-13基因(優(yōu)選如本文所示例的具有為了在一種或多種類型植物中表達(dá)而優(yōu)化的序列的aad-13多核苷酸)的植物，也不會(huì)預(yù)期這類植物能有效的產(chǎn)生aad-13酶以使植物對(duì)苯氧乙酸類除草劑(如2,4-滴)和/或一種或多種吡啶氧乙酸類除草劑(如綠草定和氟草煙)具有抗性。因此，本發(fā)明提供了許多本領(lǐng)域迄今未曾設(shè)想過的優(yōu)點(diǎn)。本發(fā)明還部分涉及編碼能降解苯氧乙酸類植物生長(zhǎng)素和/或吡啶氧乙酸類植物生長(zhǎng)素除草劑的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶的基因的鑒定和用途。篩選蛋白質(zhì)的這些活性的方法也在本發(fā)明的范圍內(nèi)。因此，本發(fā)明包括通過重組表達(dá)的aad-13酶對(duì)2,4-二氯苯氧乙酸和其他芳氧基鏈烷酸酯類植物生長(zhǎng)素除草劑的降解。本發(fā)明還包括控制雜草的方法，其中所述方法包括對(duì)含有aad-13基因的植物應(yīng)用一種或多種吡啶氧乙酸類或苯氧乙酸類植物生長(zhǎng)素除草劑。本發(fā)明還提供使用aad-13基因作為鑒定轉(zhuǎn)化了aad-13的植物細(xì)胞和完整植物的選擇標(biāo)記的方法，所述植物細(xì)胞和完整植物任選地包含同時(shí)插入靶植物細(xì)胞的一種、兩種或更多外源基因。本發(fā)明的方法包括選擇對(duì)適當(dāng)水平的除草劑具有抗性的轉(zhuǎn)化細(xì)胞。本發(fā)明還包括通過培養(yǎng)本發(fā)明的植物和/或細(xì)胞制備具有芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶生物活性的多肽的方法。附圖簡(jiǎn)述圖1顯示本發(fā)明aad-13酶催化的一般化學(xué)反應(yīng)。圖2是α-酮戊二酸雙加氧酶的clustalw比對(duì)。在80％的序列中保守的殘基被突出顯示。(突出顯示相同和相似的殘基)。圖3圖解了通過aad-13對(duì)α-酮戊二酸和目的底物的同時(shí)分解。序列簡(jiǎn)述seqidno:1是來自sphingobiumherbicidovoran的aad-13的天然核苷酸序列。seqidno:2為翻譯的由seqidno:1編碼的蛋白質(zhì)序列。seqidno:3為植物優(yōu)化的核苷酸序列aad-13(v1)。seqidno:4為翻譯的由seqidno:3編碼的蛋白質(zhì)序列。seqidno:5為大腸桿菌優(yōu)化的核苷酸序列aad-13(v2)。seqidno:6顯示了“sdpacodf”aad-13(v1)引物的序列。seqidno:7顯示了“sdpacodr”aad-13(v1)引物的序列。seqidno:8顯示了“succd”引物的序列。seqidno:9顯示了“succd”引物的序列。seqidno:10顯示了aad-13(v2)引物的序列。seqidno:11顯示了aad-13(v2)引物的序列。發(fā)明詳述本發(fā)明開發(fā)的2,4-滴抗性基因及相應(yīng)的抗性作物提供用于在作物中控制草甘膦抗性(或高耐性和演替的)闊葉雜草物種的優(yōu)良選擇。2,4-滴是廣譜、相對(duì)便宜且強(qiáng)力的闊葉除草劑，如果在雙子葉和單子葉作物中同樣能提供更強(qiáng)的作物耐性，則可為種植者提供優(yōu)良的效用。2,4-滴耐性轉(zhuǎn)基因雙子葉作物還可在應(yīng)用時(shí)間和用量上具有更高的靈活性。2,4-滴除草劑耐性性狀的另一用途是它可用于預(yù)防2,4-滴漂移、揮發(fā)、轉(zhuǎn)化(inversion)(或其他遠(yuǎn)距離的移動(dòng)現(xiàn)象)、誤用、破壞等等對(duì)正常敏感性作物的損害。aad-13基因的另一益處是，與目前已表征的所有tfda同源物不同，aad-13除了能降解非手性苯氧基植物生長(zhǎng)素(如2,4-滴、mcpa、4-氯苯氧乙酸)以外，還能降解吡啶氧乙酸類植物生長(zhǎng)素(如氟草煙)。見表1。圖1所示為本發(fā)明aad-13酶催化的化學(xué)反應(yīng)的一般圖解(o2的加入是立體特異性的；中間產(chǎn)物自發(fā)分解為苯酚和乙醛酸)。應(yīng)當(dāng)理解圖1中的化學(xué)結(jié)構(gòu)表示分子骨架，還應(yīng)理解圖1包含多種r基團(tuán)以及相似的基團(tuán)(如表1所示)，但并未對(duì)其進(jìn)行必要地具體闡明。已經(jīng)全球使用不同苯氧基植物生長(zhǎng)素組合的多種混合來處理不同地區(qū)特定的雜草譜和環(huán)境條件。在植物中使用aad-13基因可以提供對(duì)更廣譜的植物生長(zhǎng)素除草劑的防護(hù)，從而提高靈活性和可控制的雜草譜。本發(fā)明還可用于對(duì)所有市售苯氧基植物生長(zhǎng)素的漂移或其他遠(yuǎn)距離合成的植物生長(zhǎng)素除草劑損傷的防護(hù)。表1詳細(xì)說明市售的吡啶氧基和苯氧基植物生長(zhǎng)素，并提供相應(yīng)的化學(xué)結(jié)構(gòu)?，F(xiàn)已鑒定了單個(gè)基因(aad-13)，其在遺傳改造用于植物表達(dá)后具有允許在植物中使用苯氧基植物生長(zhǎng)素除草劑的特性，所述植物中固有耐性根本不存在或不足以允許使用這些除草劑。此外，aad-13可以在植物天然耐性不足以允許選擇性時(shí)在植物中提供對(duì)吡啶氧乙酸除草劑的防護(hù)，擴(kuò)展了這些除草劑的潛在效用?，F(xiàn)在可以以一種、兩種或幾種苯氧基植物生長(zhǎng)素除草劑的組合相繼或罐混地處理僅含aad-13的植物。用于控制廣譜雙子葉雜草的每種苯氧基植物生長(zhǎng)素除草劑的用量范圍從25到4000gae/ha，更通常從100到2000gae/ha。類似的，可以對(duì)具有降低的來自吡啶氧乙酸植物生長(zhǎng)素除草劑損傷風(fēng)險(xiǎn)的表達(dá)aad-13的植物應(yīng)用一種、兩種或幾種所述除草劑化合物的混合物。用于控制其他雙子葉雜草的每種吡啶氧乙酸除草劑的用量范圍可以從25到2000gae/ha，更通常是從35到840gae/ha。草甘膦被廣泛地使用，因?yàn)樗刂品浅V譜的闊葉和禾本科雜草物種。然而，在gtc和非作物應(yīng)用中重復(fù)使用草甘膦已經(jīng)(而且仍將繼續(xù))選擇使雜草演替為天然更具耐性的物種或草甘膦抗性生物型。多數(shù)除草劑抗性管理策略建議使用有效用量的罐混除草劑伴侶作為延緩出現(xiàn)抗性雜草的方法，所述除草劑伴侶提供對(duì)同一物種的控制，但具有不同的作用模式。將aad-13與草甘膦耐性性狀(和/或其他除草劑耐性性狀)疊加可通過能對(duì)同一作物選擇性使用草甘膦、苯氧基植物生長(zhǎng)素(如2,4-滴)和吡啶氧乙酸類植物生長(zhǎng)素除草劑(如fluroxypyr)來提供允許控制gtc中草甘膦抗性雙子葉雜草物種的機(jī)制。這些除草劑的應(yīng)用可以是在含有不同作用模式的兩種或更多除草劑的罐混合物中同時(shí)使用；在相繼應(yīng)用(如種植前、出苗前或出苗后)中單個(gè)除草劑組合物的單獨(dú)使用(使用的間隔時(shí)間范圍從大約2小時(shí)到大約3個(gè)月)；或者備選地，可以在任何時(shí)間(從種植作物大約7個(gè)月內(nèi)到收獲作物時(shí)(或?qū)τ趩蝹€(gè)除草劑為收獲前間隔，取最短者))應(yīng)用代表每種化學(xué)類別的任意數(shù)目除草劑的任意組合。在控制廣譜禾本科和闊葉雜草中具有靈活性是很重要的，即使用時(shí)間、單個(gè)除草劑用量和控制頑固或抗性雜草的能力。作物中與草甘膦抗性基因/aad-13疊加的草甘膦應(yīng)用的范圍可以是大約250-2500gae/ha；苯氧基植物生長(zhǎng)素除草劑(一種或多種)可按照大約25-4000gae/ha應(yīng)用；而吡啶氧乙酸植物生長(zhǎng)素除草劑(一種或多種)可按照25-2000gae/ha應(yīng)用。這些應(yīng)用的最佳組合和時(shí)間取決于具體的情況、物種和環(huán)境，并可由雜草控制領(lǐng)域得益于本公開內(nèi)容的的技術(shù)人員最佳決定。在完整的生長(zhǎng)周期中，幼苗通常是抗性的。轉(zhuǎn)化的植物在基因表達(dá)的任意時(shí)間一般對(duì)新除草劑應(yīng)用具有抗性。本文顯示貫穿生命周期的對(duì)2,4-滴的耐受性，通過使用迄今檢測(cè)的組成型啟動(dòng)子(主要是csvmv和atubi10)。一般期望如此，但是這是一種基于其他非代謝活性的改進(jìn)，比如，通過減少抗性作用機(jī)制位點(diǎn)的表達(dá)顯著影響耐性。一個(gè)例子是抗農(nóng)達(dá)(roundupready)棉花，如果在早期噴灑，植物具有抗性，但是如果噴灑太晚，草甘膦在分生組織聚集(因?yàn)槠洳槐淮x和轉(zhuǎn)位)；使用的病毒啟動(dòng)子孟山都(monsanto)不能在花中很好的表達(dá)。本發(fā)明在這些方面提供改進(jìn)。除草劑制劑(如酯、酸或鹽制劑或可溶濃縮劑、乳化濃縮劑或可溶液體)和罐混添加劑(如佐劑、表面活性劑、漂移阻滯劑或相容劑)可顯著影響給定的除草劑或一種或多種除草劑的組合的雜草控制。這些和任意前述除草劑化學(xué)性質(zhì)的任意組合都在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)了解，兩種或更多作用模式的組合在提高受控雜草譜和/或在控制天然更具耐性或抗性雜草物種方面的益處，并還可擴(kuò)展到通過人工參與(轉(zhuǎn)基因或非轉(zhuǎn)基因)在作物中產(chǎn)生除gtc外的除草劑耐性的化學(xué)性質(zhì)。事實(shí)上，可以單獨(dú)或以多重組合疊加編碼以下抗性的性狀以提供有效控制或防止雜草演替和/或?qū)θ我馑鲱悇e除草劑的抗性的能力：草甘膦抗性(如抗性植物或細(xì)菌epsps(包括agro.菌株cp4)、草甘膦氧化還原酶(gox)、gat)、草銨膦抗性(如pat、bar)、乙酰乳酸合酶(als)抑制性除草劑抗性(如咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑并嘧啶磺酰胺類、嘧啶硫代苯甲酸類(pyrmidinylthiobenzoates)和其他化學(xué)品如ahas,csr1,sura等)、溴草腈抗性(如bxn)、對(duì)hppd(4-羥苯基丙酮酸雙加氧酶)酶抑制劑的抗性、對(duì)八氫番茄紅素去飽和酶(pds)抑制劑的抗性、對(duì)光系統(tǒng)ii抑制性除草劑的抗性(如psba)、對(duì)光系統(tǒng)i抑制性除草劑的抗性、對(duì)原卟啉原氧化酶ix(ppo)抑制性除草劑的抗性(如ppo-1)、對(duì)苯脲除草劑的抗性(如cyp76b1)、二氯甲氧苯酸降解酶(參閱如us20030135879)等等。體內(nèi)修飾的epsps以及i類、ii類和ш類草甘膦抗性基因可用于某些優(yōu)選的實(shí)施例。關(guān)于其他除草劑，一些其他優(yōu)選的als抑制劑包括但不僅限于：磺酰脲類(如綠磺隆(chlorsulfuron)、氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、煙嘧磺隆(nicosulfuron)、甲嘧磺隆(sulfometuron)、磺?；锹?sulfosulfuron)、三氟啶磺隆(trifloxysulfuron))、咪唑啉酮類(如甲氧咪草煙(imazamox)、咪草煙(imazethapyr)、滅草喹(imazaquin))、三唑并嘧啶磺酰胺類(如氯酯磺草胺、雙氯磺草安、雙氟磺草胺、唑嘧磺草胺、磺草唑胺(metosulam)和嘧啶并三唑類磺胺(penoxsulam)、嘧啶硫代苯甲酸類(如雙草醚(bispyribac)和嘧草硫醚(pyrithiobac))和氟酮磺隆(flucarbazone)。一些優(yōu)選的hppd抑制劑包括但不僅限于:甲基磺草酮、異唑草酮和磺草酮。一些優(yōu)選的ppo抑制劑包括但不僅限于:氟胺草酯、丙炔氟草胺、氟噠嗪草酯(flufenpyr)、吡草醚(pyraflufen)、噠草氟(fluthiacet)、氟丙嘧草酯、唑草酮、甲磺草胺和二苯醚(如三氟羧草醚、氟磺胺草醚、乳氟禾草靈和乙氧氟草醚)。此外，可以將aad-13單獨(dú)或與一種或多種其他htc性狀疊加后再與一種或多種其他輸入(如昆蟲抗性、真菌抗性或脅迫耐受性等)或輸出(如提高的產(chǎn)量、改進(jìn)的油譜、提高的纖維品質(zhì)等)性狀疊加。因此，本發(fā)明可用于提供以靈活且經(jīng)濟(jì)地控制任何數(shù)目的農(nóng)學(xué)害蟲的能力來提高作物品質(zhì)的完整農(nóng)學(xué)解決方案。本發(fā)明部分涉及鑒定不僅能降解2,4-滴，而且令人驚奇地具有使本發(fā)明的酶區(qū)別于先前已知的(例如)tfda蛋白的新特性的酶。盡管此酶與tfda的同源性很低，但本發(fā)明的基因一般仍可歸類到α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶的同一總家族。此家族蛋白質(zhì)的特征在于包含活性位點(diǎn)的“hx(d/e)x23-26(t/s)x114-183hx10-13r”基序中的三個(gè)保守性組氨酸殘基。組氨酸與活性位點(diǎn)中催化活性所必需的fe+2離子配位(hogan等,2000)。設(shè)計(jì)了本文所討論的初步體外表達(dá)實(shí)驗(yàn)以幫助選擇新屬性。這些實(shí)驗(yàn)還說明aad-13酶與先前提交的專利申請(qǐng)(pctus/2005/014737；2005年5月2日提交)中公開的同類另一種不同的酶有區(qū)別。前一申請(qǐng)中的aad-1酶與本發(fā)明中aad-13蛋白質(zhì)只具有大約25％的序列同一性。更具體的，本發(fā)明部分涉及不僅能降解2,4-滴而且還能降解吡啶氧乙酸類除草劑的酶的用途。除了以前鑒定的aad-1和aad-12酶(分別為專利申請(qǐng)pctus/2005/014737(wo2005/107437)和wo2007/053482的主題)，先前已經(jīng)報(bào)道的α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶均不具有以不同作用方式降解不同化學(xué)類別的除草劑的能力。本發(fā)明用途中優(yōu)選的酶和基因在本文中稱為aad-13(芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶)基因和蛋白質(zhì)。本發(fā)明還部分涉及編碼能降解苯氧基生長(zhǎng)素和吡啶氧乙酸類除草劑的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶的基因的鑒定和用途。因此，本發(fā)明部分涉及通過重組表達(dá)的aad-13酶降解2,4-二氯苯氧乙酸、其他苯氧乙酸和吡啶氧乙酸類除草劑。在分析測(cè)定中，本發(fā)明的蛋白質(zhì)對(duì)2,4-滴到2,4-二氯苯酚(“dcp”，無(wú)除草劑活性)的轉(zhuǎn)化測(cè)試為陽(yáng)性。部分純化的本發(fā)明蛋白質(zhì)能在體外將2,4-滴迅速轉(zhuǎn)化為dcp。轉(zhuǎn)化aad-13的植物提供的另一優(yōu)點(diǎn)是母體除草劑代謝為失活形式，從而降低谷物或秸稈中收獲除草劑殘留物的可能。本發(fā)明還包括控制雜草的方法，其中所述方法包括對(duì)含有aad-13基因的植物應(yīng)用吡啶氧乙酸和/或苯氧基生長(zhǎng)素除草劑。根據(jù)這些發(fā)現(xiàn)，現(xiàn)在提供了含有編碼這類酶的多核苷酸的新植物。迄今為止還沒有產(chǎn)生這類植物的動(dòng)機(jī)，也不會(huì)預(yù)期這樣的植物能有效產(chǎn)生此酶，不僅賦予植物對(duì)苯氧乙酸類除草劑(如2,4-滴)的抗性，而且賦予植物對(duì)吡啶氧乙酸類除草劑的抗性。因此，本發(fā)明提供本領(lǐng)域從未設(shè)想過的許多優(yōu)點(diǎn)?？梢垣@得(保藏于培養(yǎng)物保藏中心如atcc或dsmz的)公共可得的菌株并使用本文公開的技術(shù)篩選新基因。本文公開的序列可用于擴(kuò)增同源基因并克隆進(jìn)重組表達(dá)系統(tǒng)，以根據(jù)本發(fā)明進(jìn)一步進(jìn)行篩選和測(cè)試。如上文背景章節(jié)所討論的，已被廣泛研究其降解2,4-滴能力的一種生物為真養(yǎng)雷氏菌(streber等,1987)。編碼降解途徑中第一種酶的基因?yàn)閠fda。參閱美國(guó)專利no.6,153,401和genbank登錄號(hào)m16730。tfda通過α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶反應(yīng)催化2,4-滴酸轉(zhuǎn)化成無(wú)除草劑活性的dcp(smejkal等,2001)。tfda已在轉(zhuǎn)基因植物中用于將2,4-滴抗性賦予通常對(duì)2,4-滴敏感的雙子葉植物(如棉花和煙草)(streber等,1989；lyon等,1989；lyon等,1993)。已經(jīng)從環(huán)境中鑒定了編碼能降解2,4-滴的蛋白質(zhì)的大量tfda型基因并保存于ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)。許多同源物與tfda非常相似(氨基酸同一性>85％)并具有與tfda相似的酶特性。然而，現(xiàn)在鑒定了與tfda具有低水平同源性的小部分α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶同源物。本發(fā)明部分涉及遠(yuǎn)緣酶sdpa新用途和功能的令人驚奇的發(fā)現(xiàn)，該酶來自sphingobiumherbicidovorans(westendorf等，2002、2003)與tfda具有低同源性(氨基酸同一性35％)且與最近鑒定的aad-1具有低同源性(27％氨基酸同一性)。先前已經(jīng)顯示以其天然形式純化的這種α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶可降解2,4-滴和s-2,4-滴丙酸(westendorf等,2002和2003)。然而，先前已報(bào)道的α-酮戊二酸依賴性雙加氧酶均不具有降解吡啶氧乙酸化學(xué)類別的選擇性除草劑的能力。從未在植物中表達(dá)過sdpa(來自sphingobiumherbicidovorans)，也沒有動(dòng)機(jī)這樣做，部分是因?yàn)樾耯tc技術(shù)的開發(fā)已經(jīng)在很大程度上受到gtc的效能、低費(fèi)用和便利性的限制(devine,2005)。根據(jù)新的活性，本發(fā)明的新蛋白質(zhì)和基因在本文中稱為aad-12蛋白和基因。目前已證實(shí)aad-13在體外降解多種苯氧乙酸類生長(zhǎng)素除草劑。見下文實(shí)施例5中的表5.4.4-1。此外，如本文所第一次報(bào)道的，驚奇地發(fā)現(xiàn)此酶還能降解芳氧基鏈烷酸酯類分子的其他底物。具有重要農(nóng)學(xué)意義的底物包括吡啶氧乙酸類生長(zhǎng)素除草劑。這一高度新穎的發(fā)現(xiàn)是重要的除草劑耐受作物(htc)和選擇標(biāo)記性狀可能性的基礎(chǔ)。此酶的獨(dú)特性在于其傳遞對(duì)一系列廣譜闊葉除草劑(苯氧乙酸類和吡啶氧乙酸類生長(zhǎng)素)的除草劑降解活性的能力。因此，本發(fā)明部分涉及通過重組表達(dá)的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶(aad-13)降解2,4-二氯苯氧乙酸、其他苯氧乙酸類生長(zhǎng)素除草劑和吡啶氧乙酸類除草劑。本發(fā)明還部分涉及編碼能降解苯氧基和/或吡啶氧基生長(zhǎng)素除草劑的芳氧基鏈烷酸酯雙加氧酶降解酶(aad-13)的基因的鑒定和用途。本發(fā)明的酶可進(jìn)行轉(zhuǎn)基因表達(dá)，導(dǎo)致對(duì)控制幾乎所有闊葉雜草的除草劑組合的耐性。aad-13可作為優(yōu)秀的除草劑耐受作物(htc)性狀與例如其他htc性狀(如草甘膦抗性、草銨膦抗性、als-抑制劑(如咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑并嘧啶磺酰胺類)抗性、溴草腈抗性、hppd抑制劑抗性、ppo抑制劑抗性等)和昆蟲抗性性狀(cry1f、cry1ab、cry34/45、其他蘇云金芽孢桿菌(bt)蛋白質(zhì)或非芽孢桿菌屬來源的殺蟲劑蛋白質(zhì)等)疊加。此外，aad-13可作為選擇標(biāo)記輔助選擇用另一個(gè)基因或基因群遺傳改造的植物的原代轉(zhuǎn)化體。此外，已經(jīng)重新設(shè)計(jì)了本發(fā)明的微生物基因，以使該蛋白質(zhì)由單子葉和雙子葉植物使用偏好的密碼子編碼(hemicot)。已經(jīng)用含有aad-13的構(gòu)建體轉(zhuǎn)化了擬南芥、玉米、煙草、棉花、大豆、蕓苔和稻，并已證明了對(duì)苯氧基和吡啶氧基生長(zhǎng)素除草劑的高水平抗性。因此，本發(fā)明還涉及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)的“植物優(yōu)化的”基因。氧基鏈烷酸酯(oxyalkanoate)基團(tuán)可用于將穩(wěn)定的酸官能團(tuán)引入除草劑。酸性基團(tuán)可通過“酸捕獲”賦予韌皮部活動(dòng)性(除草劑作用所需的屬性)，從而可以為了活動(dòng)性目的而整合進(jìn)新除草劑。本發(fā)明的方面還提供產(chǎn)生htc的機(jī)制。存在很多可能為aad-13底物的市售和實(shí)驗(yàn)性除草劑。因此，使用本發(fā)明基因還可以導(dǎo)致對(duì)其他除草劑的除草劑耐性。本發(fā)明的htc性狀可用在與其他htc性狀(包括但不僅限于草甘膦耐性)的新組合中。由于對(duì)除草劑(如草甘膦)的新獲得的抗性或固有的耐性，這些性狀組合產(chǎn)生控制雜草(等)物種的新方法。因此，除了htc性狀，本發(fā)明的范圍包括使用除草劑控制雜草的新方法，其中通過轉(zhuǎn)基因作物中的所述酶產(chǎn)生對(duì)所述除草劑的耐性。本發(fā)明可以用于使(例如)大豆中與目前的草甘膦抗性性狀疊加的2,4-滴抗性性狀商品化。因此，本發(fā)明提供對(duì)抗闊葉雜草物種演替和/或選擇除草劑抗性闊葉雜草的工具，所述任務(wù)由于種植者在多種作物的雜草控制中對(duì)草甘膦極高的依賴性而達(dá)到白熱化的程度。本發(fā)明aad-13基因的轉(zhuǎn)基因表達(dá)示例于如擬南芥和煙草。大豆是本發(fā)明優(yōu)選轉(zhuǎn)化的作物。不過，本發(fā)明可應(yīng)用于多種其他單子葉(如牧草禾本科或草坪草禾本科)和雙子葉作物(如苜蓿、三葉草、喬木物種等)。類似的，2,4-滴(或其他aad-13底物)可更積極地用于耐性適中的禾本科作物中，由此性狀得到的提高的耐性將為種植者提供能以更有效的用量和更廣的施用時(shí)間來使用這些除草劑而無(wú)作物損傷風(fēng)險(xiǎn)的可能性。另外，本發(fā)明提供了可提供對(duì)控制闊葉雜草除草劑的抗性的單個(gè)基因。此基因可用于多種作物中，能使用廣譜除草劑組合。本發(fā)明還可控制對(duì)目前的化學(xué)品具有抗性的雜草，并輔助控制目前的農(nóng)業(yè)實(shí)踐產(chǎn)生的演替的雜草譜。本發(fā)明的aad-13還可以用于將其他除草劑底物有效解毒成非除草劑形式的嘗試。因此，本發(fā)明提供了其他htc性狀和/或選擇標(biāo)記技術(shù)的發(fā)展。除了使用本發(fā)明基因產(chǎn)生htc以外，本發(fā)明基因還可用作細(xì)胞培養(yǎng)物、溫室和大田中成功選擇轉(zhuǎn)化體的選擇標(biāo)記。本發(fā)明基因僅作為生物技術(shù)工程的選擇標(biāo)記就具有很高的內(nèi)在價(jià)值。aad-13與其他芳氧基鏈烷酸酯生長(zhǎng)素除草劑的混雜性提供了將此基因用于htc和/或選擇標(biāo)記目的的許多可能。本發(fā)明的蛋白質(zhì)(和來源分離物)。本發(fā)明提供功能蛋白質(zhì)?！肮δ芑钚浴?或“活性”)在本文中指本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)/酶(單獨(dú)或與其他蛋白質(zhì)組合)具有降解或減弱除草劑活性的能力。產(chǎn)生本發(fā)明蛋白質(zhì)的植物優(yōu)選產(chǎn)生“有效量”的蛋白質(zhì)，從而在用除草劑處理植物時(shí)，蛋白質(zhì)表達(dá)的水平足以給予植物對(duì)除草劑(若無(wú)特別說明則為一般用量；一般應(yīng)用量可見于例如熟知的《herbicidehandbook》(weedsciencesocietyofamerica,第八版,2002))完全或部分的抗性或耐性?？梢砸酝ǔ⑺腊兄参锏挠昧?、正常的大田用量和濃度使用除草劑(由于本發(fā)明，水平和/或濃度可以任選地比先前所使用的更高)。優(yōu)選地，本發(fā)明的植物細(xì)胞和植物被保護(hù)免受除草劑處理引起的生長(zhǎng)抑制或損傷。本發(fā)明的轉(zhuǎn)化植物和植物細(xì)胞優(yōu)選具有對(duì)本文討論的除草劑的抗性或耐性，即轉(zhuǎn)化的植物和植物細(xì)胞能在有效量的一種或多種本文討論的除草劑存在下生長(zhǎng)。本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)具有代謝一種或多種芳氧基鏈烷酸酯化合物的催化活性。不使用動(dòng)詞“耐受”或形容詞“耐性的”，人們就無(wú)法簡(jiǎn)單地討論術(shù)語(yǔ)“抗性”。工業(yè)界已花費(fèi)無(wú)數(shù)的時(shí)間爭(zhēng)論除草劑耐性作物(htc)與除草劑抗性作物(hrc)。htc是工業(yè)界優(yōu)選的術(shù)語(yǔ)。然而，權(quán)威的美國(guó)治草科學(xué)學(xué)會(huì)(weedsciencesocietyofamerica)對(duì)抗性的定義是“植物接觸通常對(duì)野生型致死劑量的除草劑后生存和繁殖的遺傳能力，在植物中抗性可以自然發(fā)生或由諸如遺傳工程的技術(shù)誘導(dǎo)產(chǎn)生或挑選通過組織培養(yǎng)或變異產(chǎn)生的突變體。”除非其他說明，正如《theherbicidehandbook》在本發(fā)明公開遞交之日時(shí)的通用版本所建議的一樣，本文使用的除草劑“抗性”是可遺傳的，并允許植物在除草劑對(duì)給定植物進(jìn)行一般除草劑有效處理的情況下生長(zhǎng)和繁殖。正如本領(lǐng)域中技術(shù)人員認(rèn)可的，即使植物受到除草劑處理的一定損傷程度明顯，植物仍可被認(rèn)為“抗性”。如本文中所用的術(shù)語(yǔ)“耐性”比術(shù)語(yǔ)“抗性”更廣泛，并包括本文定義的“抗性”，以及特定植物具有的抵抗除草劑誘導(dǎo)的各種程度損傷的提高的能力，而在同樣的除草劑劑量下一般導(dǎo)致相同基因型野生型植物損傷。功能活性到植物或細(xì)菌系統(tǒng)的轉(zhuǎn)移可涉及編碼本發(fā)明蛋白質(zhì)氨基酸序列的核酸序列，所述核酸序列整合進(jìn)蛋白質(zhì)表達(dá)載體，所述載體適于其將居留的宿主。獲得編碼具有功能活性的蛋白質(zhì)的核酸序列的一種方法是使用從本文公開的蛋白質(zhì)的氨基酸序列推出的信息，從產(chǎn)生目的蛋白質(zhì)的細(xì)菌物種中分離天然遺傳物質(zhì)。如下文更詳細(xì)討論的，可以優(yōu)化天然序列進(jìn)行例如植物表達(dá)。也可以基于蛋白質(zhì)序列設(shè)計(jì)優(yōu)化的多核苷酸。本發(fā)明提供具有本文所鑒定新活性的蛋白質(zhì)類別。表征這些蛋白質(zhì)類別和編碼它們的多核苷酸的一種方法是通過多核苷酸在一系列特定條件下與示例核苷酸序列(其互補(bǔ)序列和/或來自任一鏈的一種或多種探針)雜交的能力和/或其使用來自示例序列的引物通過pcr被擴(kuò)增的能力來定義多核苷酸。有許多獲得本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)的方法。例如，可以用本文所公開蛋白質(zhì)的抗體從蛋白質(zhì)混合物中鑒定和分離其他蛋白質(zhì)。具體的，可以針對(duì)蛋白質(zhì)中與其他相關(guān)蛋白質(zhì)相比最保守或最特殊的部分產(chǎn)生抗體。接著可使用這些抗體通過免疫沉淀、酶聯(lián)免疫吸附測(cè)定(elisa)或免疫印跡來具體鑒定具有特征活性的等同蛋白質(zhì)?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)方案便利的制備針對(duì)本文公開蛋白質(zhì)、或針對(duì)等同蛋白質(zhì)或針對(duì)這些蛋白質(zhì)的片段的抗體。這樣的抗體是本發(fā)明的一個(gè)方面。本發(fā)明的抗體包括單克隆抗體和多克隆抗體，優(yōu)選針對(duì)示例或提出的蛋白質(zhì)產(chǎn)生。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易認(rèn)識(shí)到，可以從多種來源獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)(和基因)。由于已知完整的除草劑降解操縱子可編碼在轉(zhuǎn)座元件(如質(zhì)粒)上、以及整合在基因組中，因此可以從廣泛的多種微生物(如包括重組和/或野生型細(xì)菌)獲得本發(fā)明的蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域所熟知的方案產(chǎn)生細(xì)菌分離物的突變體。例如，可以通過分離物的甲基磺酸乙酯(ems)誘變來獲得不產(chǎn)孢子突變體?？梢酝ㄟ^本領(lǐng)域熟知的方案使用紫外光和亞硝基胍產(chǎn)生突變株?！皝碜浴被颉暗米浴比我馐茉嚪蛛x物的蛋白質(zhì)在本文中指該蛋白質(zhì)(或相似的蛋白質(zhì))可得自該分離物或其他一些來源，如其他細(xì)菌菌株或植物?！霸醋浴币簿哂羞@一含義，并包括可從經(jīng)修飾用于(例如)在植物中表達(dá)的給定類型的細(xì)菌獲得的蛋白質(zhì)。本領(lǐng)域技術(shù)人員容易理解，在細(xì)菌基因和蛋白質(zhì)公開后就可以改造植物以產(chǎn)生該蛋白質(zhì)?？梢允褂帽疚墓_的多核苷酸和/或氨基酸序列制備抗體制劑、核酸探針(如dna、rna或pna)等，并用于從其他(天然)來源篩選和回收其他相關(guān)基因?？梢允褂脴?biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)克隆和測(cè)序本文所述蛋白質(zhì)和基因。其他信息可見于本文引為參考的sambrook等,1989。多核苷酸和探針。本發(fā)明還提供編碼本發(fā)明用途蛋白質(zhì)的核酸序列。本發(fā)明還提供鑒定和表征編碼具有所需除草劑活性的蛋白質(zhì)的基因的方法。在一個(gè)實(shí)施方案中，本發(fā)明提供可作為雜交探針和/或pcr技術(shù)的引物使用的獨(dú)有核苷酸序列。引物產(chǎn)生可用于鑒定、表征和/或分離特定目的基因的特征性基因片段。本發(fā)明的核苷酸序列編碼與先前已描述蛋白質(zhì)不同的蛋白質(zhì)。本發(fā)明的多核苷酸可用于形成完整“基因”，以在期望的宿主細(xì)胞中編碼蛋白質(zhì)或肽。例如，本領(lǐng)域技術(shù)人員容易了解，可以如本領(lǐng)域所熟知的那樣，在目的宿主中將本發(fā)明的多核苷酸適當(dāng)?shù)刂糜趩?dòng)子的控制之下?；虮磉_(dá)和時(shí)間/組織特異性表達(dá)的水平可極大地影響本發(fā)明的應(yīng)用。一般而言，降解基因蛋白質(zhì)較高水平的表達(dá)會(huì)導(dǎo)致底物(本文中為靶除草劑)更快更完全的降解。除非高表達(dá)對(duì)植物健康具有繼發(fā)的負(fù)面影響，一般期望啟動(dòng)子以高水平表達(dá)靶基因。為了在全部生長(zhǎng)階段中完全保護(hù)植物，一般希望aad-13基因在所有組織中組成型表達(dá)。然而，也可以使用無(wú)性繁殖表達(dá)的抗性基因；這允許在植物中使用靶除草劑進(jìn)行雜草控制，接著通過在開花期使用來控制靶作物的有性繁殖。此外，表達(dá)所需的水平和時(shí)間還依賴于植物的類型和期望的耐性水平。一些的優(yōu)選的實(shí)施方案使用組合轉(zhuǎn)錄增強(qiáng)子等的強(qiáng)組成型啟動(dòng)子來增加表達(dá)水平和增強(qiáng)耐性至所需水平。在實(shí)施例部分之前，一些此類的應(yīng)用會(huì)在下面更詳細(xì)討論。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，dna一般以雙鏈形式存在。在這種排列下，一條鏈與另一條鏈互補(bǔ)，反之亦然。當(dāng)dna在(例如)植物中復(fù)制時(shí)產(chǎn)生了額外的互補(bǔ)dna鏈。本領(lǐng)域中經(jīng)常使用“編碼鏈”指代與反義鏈結(jié)合的鏈。mrna轉(zhuǎn)錄自dna的“反義”鏈?！坝辛x”或“編碼”鏈具有一連串密碼子(密碼子是可以作為三殘基單位閱讀以指定特定氨基酸的三個(gè)核苷酸)，所述密碼子可以作為開放讀碼框(orf)閱讀以形成目的蛋白質(zhì)或多肽。為在體內(nèi)產(chǎn)生蛋白質(zhì)，一般將dna鏈轉(zhuǎn)錄成用作蛋白質(zhì)模板的mrna互補(bǔ)鏈。因此，本發(fā)明包括所附序列表中所示的示例多核苷酸和/或等同物(包括互補(bǔ)鏈)的用途。與示例dna分子功能性等同的rna和pna(肽核酸)也包含于本發(fā)明中。在本發(fā)明的一個(gè)實(shí)施方案中，可以在使微生物高度增殖的條件下培養(yǎng)細(xì)菌分離物。在處理微生物以提供單鏈基因組核酸后，可以用本發(fā)明的引物與dna接觸并進(jìn)行pcr擴(kuò)增。目的基因的特征性片段將通過該操作而得以擴(kuò)增，從而鑒定目的基因的存在。本發(fā)明的其他方面包括使用本文公開的方法和核苷酸序列鑒定的基因和分離物。所鑒定的基因可編碼本發(fā)明的除草劑抗性蛋白質(zhì)?？梢酝ㄟ^如使用寡核苷酸探針鑒定和獲得本發(fā)明用途的蛋白質(zhì)和基因。這些探針為可檢測(cè)的核苷酸序列，所述核苷酸序列由于適當(dāng)?shù)臉?biāo)記可被檢測(cè)或如國(guó)際申請(qǐng)wo93/16094所述使其具有固有的熒光性。探針(和本發(fā)明的多核苷酸)可以是dna、rna或pna。除了腺嘌呤(a)、胞嘧啶(c)、鳥嘌呤(g)、胸腺嘧啶(t)和尿嘧啶(u，rna分子中)之外，本發(fā)明的合成探針(和多核苷酸)還可以含有肌苷(能與全部四種堿基配對(duì)的中性堿基，有時(shí)用于在合成探針中代替全部四種堿基的混合物)和/或其他合成的(非天然)堿基。因此，當(dāng)本文中提到合成的簡(jiǎn)并寡核苷酸時(shí)一般使用“n”或“n”，“n”或“n”可以是g、a、t、c或肌苷。本文使用的多義密碼子與提交本申請(qǐng)時(shí)的標(biāo)準(zhǔn)iupac命名慣例一致(如r為a或g、y為c或t等)。如本領(lǐng)域所熟知，如果探針分子與核酸樣品雜交，可以合理的假設(shè)探針和樣品具有顯著同源性/相似性/同一性。優(yōu)選地，首先進(jìn)行多核苷酸雜交，之后使用本領(lǐng)域所熟知的技術(shù)在低、中或高嚴(yán)格條件下進(jìn)行洗滌，如keller,g.h.,m.m.manak(1987)《dnaprobes》,stocktonpress,newyork,ny,169-170頁(yè)中所述。例如，如文中所述，可以通過首先在室溫用2×ssc(標(biāo)準(zhǔn)檸檬酸鹽水)/0.1％sds(十二烷基硫酸鈉)洗滌15分鐘來得到低嚴(yán)格條件。一般進(jìn)行兩次洗滌。然后可以通過降低鹽濃度和/或通過提高溫度得到較高的嚴(yán)格度。例如，在上述洗滌之后可以接著在室溫用0.1×ssc/0.1％sds洗滌兩次，每次15分鐘，然后在55℃用0.1×ssc/0.1％sds接著洗滌30分鐘。如本領(lǐng)域技術(shù)人員所知，這些溫度可以與本文所示的其他雜交和洗滌方案一起使用(例如可以用sspe代替ssc作為鹽使用)。可以通過向445ml水中加入50ml20×ssc和5ml10％sds制備2×ssc/0.1％sds。可以通過混合nacl(175.3g/0.150m)、檸檬酸鈉(88.2g/0.015m)和水，用10nnaoh調(diào)整ph至7.0，然后將體積調(diào)整至1升來制備20×ssc?？梢酝ㄟ^將10gsds溶解到50ml高壓滅菌水中，然后稀釋到100ml來制備10％sds。檢測(cè)探針提供了用已知方式測(cè)定是否保持了雜交的方法。這樣的探針分析提供了鑒定本發(fā)明基因的快速方法?？梢允褂胐na合成儀和標(biāo)準(zhǔn)程序合成本發(fā)明用作探針的核苷酸片段。這些核苷酸片段還可以用作pcr引物以擴(kuò)增本發(fā)明的基因?？梢杂梅肿拥碾s交特征定義本發(fā)明的多核苷酸。因此本發(fā)明包括與本文示例的多核苷酸雜交的多核苷酸(和/或其互補(bǔ)序列、優(yōu)選其全長(zhǎng)互補(bǔ)序列)。即，定義基因(和其編碼的蛋白質(zhì))的一種方法是通過其與已知或具體示例的基因(在本文具體公開的任意條件下)雜交的能力。本文使用的“嚴(yán)格”雜交條件指實(shí)現(xiàn)與本申請(qǐng)人所使用條件相同或大致相同程度雜交特異性的條件。具體地，通過標(biāo)準(zhǔn)方法進(jìn)行固定在southern(dna雜交)印跡上的dna與32p標(biāo)記的基因特異性探針的雜交(參閱如maniatis等,1982)。一般在允許檢測(cè)靶序列的條件下進(jìn)行雜交和其后的洗滌。對(duì)于雙鏈dna基因探針，在6×sspe、5×denhardt溶液、0.1％sds、0.1mg/ml變性dna中在dna雜合體解鏈溫度(tm)以下20-25℃進(jìn)行過夜雜交。按下式描述解鏈溫度(beltz等,1983)：tm＝81.5℃+16.6log[na+]+0.41(g+c％)-0.61(甲酰胺％)-600/雙鏈體堿基對(duì)長(zhǎng)度一般如下述進(jìn)行洗滌：(1)在1×sspe、0.1％sds中室溫15分鐘洗滌兩次(低嚴(yán)格洗滌)。(2)在0.2×sspe、0.1％sds中在tm-20℃15分鐘洗滌一次(中等嚴(yán)格洗滌)。對(duì)于寡核苷酸探針，在6×sspe、5×denhardt溶液、0.1％sds、0.1mg/ml變性dna中在雜合體解鏈溫度(tm)以下10-20℃進(jìn)行過夜雜交。按下式確定寡核苷酸探針的tm：tm(℃)＝2(t/a堿基對(duì)數(shù))+4(g/c堿基對(duì)數(shù))(suggs等,1981)。一般如下述進(jìn)行洗滌：(1)在1×sspe、0.1％sds中室溫15分鐘洗滌兩次(低嚴(yán)格洗滌)。(2)在1×sspe、0.1％sds中在雜交溫度15分鐘洗滌一次(中等嚴(yán)格洗滌)。一般可以改變鹽和/或溫度以改變嚴(yán)格度。對(duì)于長(zhǎng)度＞70左右堿基的標(biāo)記dna片段，可以使用以下條件：雙鏈體的形成和穩(wěn)定依賴于雜合體兩條鏈間的顯著互補(bǔ)性，且如上文所提到的，某種程度的錯(cuò)配是允許的。因此，本發(fā)明的探針序列包括所述序列的突變(單突變和多重突變均包括在內(nèi))、缺失、插入及其組合，其中所述突變、插入和缺失允許與目的靶多核苷酸形成穩(wěn)定的雜合體?？梢砸远喾N方法在給定的多核苷酸序列中產(chǎn)生突變、插入和缺失，這些方法為本領(lǐng)域普通技術(shù)人員所共知。其他方法可在將來逐漸被了解。pcr技術(shù)。聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)(pcr)是核酸序列的引發(fā)式重復(fù)性酶合成。此方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知并普遍使用(參閱mullis,美國(guó)專利no.4,683,195、4,683,202和4,800,159；saiki等,1985)。pcr是基于目的dna片段的酶擴(kuò)增，所述dna片段兩側(cè)側(cè)接與靶序列相反鏈雜交的兩個(gè)寡核苷酸引物。引物優(yōu)選在3’末端彼此指向?qū)Ψ?。模板熱變性、引物與其互補(bǔ)序列退火和用dna聚合酶延伸退火引物的重復(fù)循環(huán)導(dǎo)致所述pcr引物5’末端所界定片段的擴(kuò)增。每一引物的延伸產(chǎn)物可作為其他引物的模板，因此每個(gè)循環(huán)基本上倍增前一循環(huán)中產(chǎn)生的dna片段數(shù)量。這導(dǎo)致特定靶片段的指數(shù)積累，可在幾小時(shí)內(nèi)多達(dá)數(shù)百萬(wàn)倍。通過使用熱穩(wěn)定的dna聚合酶(如分離自水生棲熱菌(thermusaquaticus)的taq聚合酶)能完全自動(dòng)地完成擴(kuò)增過程。可以使用的其他酶為本領(lǐng)域技術(shù)人員所公知。示例dna序列或其片段能用作pcr擴(kuò)增的引物。在pcr擴(kuò)增中，引物和模板間某種程度的錯(cuò)配是可以接受的。因此，示例引物的突變、缺失和插入(特別是在5’末端加入核苷酸)在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以通過本領(lǐng)域普通技術(shù)人員已知的方法在給定的引物中產(chǎn)生突變、插入和缺失?；蚝偷鞍踪|(zhì)的修飾。本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)能與其他基因和蛋白質(zhì)融合以產(chǎn)生嵌合或融合蛋白。用于本發(fā)明的基因和蛋白質(zhì)不僅包括具體示例的全長(zhǎng)序列，還包括這些序列的部分、區(qū)段和/或片段(包括連續(xù)片段和與全長(zhǎng)分子相比內(nèi)部和/或末端缺失)、其變體、突變體、嵌合體和融合物。只要保留所需的功能活性，本發(fā)明的蛋白質(zhì)可以具有取代的氨基酸?！白凅w”基因具有編碼與示例蛋白質(zhì)具有等同或相似的活性的相同蛋白質(zhì)或等同蛋白質(zhì)的核苷酸序列。術(shù)語(yǔ)“變體蛋白質(zhì)”和“等同蛋白質(zhì)”指對(duì)靶底物具有相同或基本相同的生物/功能活性的蛋白質(zhì)和與示例蛋白質(zhì)具有等同序列的蛋白質(zhì)。本文所使用的“等同”序列指含有提高或不對(duì)活性產(chǎn)生顯著不利影響的氨基酸取代、缺失、添加或插入的序列。保留活性的片段也包含于此定義中。保留了如示例蛋白質(zhì)相應(yīng)片段的相同或相似功能或活性的片段和其他等同物在本發(fā)明的范圍內(nèi)。可以為了多種目的(如(不嚴(yán)重/顯著降低蛋白質(zhì)功能活性地)提高(或降低)蛋白質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性、去除或加入限制性位點(diǎn)等)產(chǎn)生變化，如氨基酸取代或添加。例如，可以使用產(chǎn)生點(diǎn)突變的標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)便利地構(gòu)建基因的變異。另外，如美國(guó)專利no.5,605,793描述了在隨機(jī)或聚焦破碎后通過dna重組裝產(chǎn)生額外的分子多樣性的方法。這可稱為基因“改組”，一般包括混合兩種或更多不同dna分子的(所需大小的)片段，接著重復(fù)若干輪的復(fù)性。這可以改進(jìn)起始基因所編碼蛋白質(zhì)的活性。結(jié)果為具有改進(jìn)的活性、改變的底物特異性、提高的酶穩(wěn)定性、改變的立體特異性或其他特征的嵌合蛋白。得到并檢查目的蛋白質(zhì)的原子3d(三維)坐標(biāo)和晶體結(jié)構(gòu)之后可設(shè)計(jì)并靶向“改組”。因此，可以針對(duì)修飾理想的蛋白質(zhì)的某些片段，如表面暴露的片段進(jìn)行“聚焦改組”，且優(yōu)選不是參與蛋白質(zhì)折疊和基本的3d結(jié)構(gòu)完整性的內(nèi)部片段。可對(duì)酶“活性點(diǎn)位”進(jìn)行特定變化，以影響固有的與活性或立體特異性有關(guān)的功能性(參閱比對(duì)圖2)。mullery等(2006)。利用與其固有的底物牛磺酸結(jié)合時(shí)的已知taud晶體結(jié)構(gòu)作為雙加氧酶模型確定活性位點(diǎn)殘基。elkins等(2002)“x-raycrystalstructureofescerichiacolitaurine/alpha-ketoglutaratedioxygenasecomplexedtoferrousironandsubstrates,”biochemistry41(16):5185-5192。關(guān)于酶活位點(diǎn)的序列優(yōu)化和設(shè)計(jì)參閱chakrabarti等,pnas,(2005年8月23日),102(34):12035-12040。可利用變體基因產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)；可以使用重組宿主產(chǎn)生變體蛋白質(zhì)。使用這些“基因改組”技術(shù)可以構(gòu)建含有本文示例的任何序列中任何5、10或20個(gè)連續(xù)殘基(氨基酸或核苷酸)的等同基因和蛋白質(zhì)。例如，如本領(lǐng)域技術(shù)人員所了解的，可以調(diào)整基因改組技術(shù)以獲得具有如與任何示例或提出的序列(或其互補(bǔ)序列(全長(zhǎng)互補(bǔ)序列))中(相同大小)的片段相對(duì)應(yīng)的3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23、24、25、26、27、28、29、30、31、32、33、34、35、36、37、38、39、40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98、99、100、101、102、103、104、105、106、107、108、109、110、111、112、113、114、115、116、117、118、119、120、121、122、123、124、125、126、127、128、129、130、131、132、133、134、135、136、137、138、139、140、141、142、143、144、145、146、147、148、149、150、151、152、153、154、155、156、157、158、159、160、161、162、163、164、165、166、167、168、169、170、171、172、173、174、175、176、177、178、179、180、181、182、183、184、185、186、187、188、189、190、191、192、193、194、195、196、197、198、199、200、201、202、203、204、205、206、207、208、209、210、211、212、213、214、215、216、217、218、219、220、221、222、223、224、225、226、227、228、229、230、231、232、233、234、235、236、237、238、239、240、241、242、243、244、245、246、247、248、249、250、251、252、253、254、255、256、257、258、259、260、261、262、263、264、265、266、267、268、269、270、271、272、273、274、275、276、277、278、279、280、281、282、283、284、285、286、287或288個(gè)連續(xù)殘基(氨基酸或核苷酸)的等同物。類似大小的片段特別是保守區(qū)的片段也能作為探針和/或引物?？梢愿鶕?jù)標(biāo)準(zhǔn)方法使用市售的外切核酸酶或內(nèi)切核酸酶產(chǎn)生全長(zhǎng)基因的片段。例如，可以使用酶如(bal31)或定點(diǎn)誘變從這些基因的末端系統(tǒng)地切除核苷酸。還可以使用多種限制性酶獲得編碼活性片段的基因?？梢允褂玫鞍酌钢苯荧@得這些蛋白質(zhì)的活性片段。如本文所公開的，可以截短蛋白質(zhì)而仍保留功能活性，這在本發(fā)明的范圍內(nèi)?！敖囟痰牡鞍踪|(zhì)”指蛋白質(zhì)的部分可被切割，而切割后剩下的截短的蛋白質(zhì)仍保留并表現(xiàn)所需活性。可以通過多種蛋白酶進(jìn)行切割。另外，使用分子生物學(xué)技術(shù)能產(chǎn)生有效切割的蛋白質(zhì)，其中通過用限制性內(nèi)切核酸酶消化或本領(lǐng)域技術(shù)人員可使用的其他技術(shù)去除編碼所述蛋白質(zhì)的dna堿基。截短后，可以在異源系統(tǒng)(如大腸桿菌、桿狀病毒、基于植物的病毒系統(tǒng)、酵母等)中表達(dá)所述蛋白質(zhì)，然后置于本文公開的昆蟲實(shí)驗(yàn)中測(cè)定活性。如本領(lǐng)域所熟知，可以成功地產(chǎn)生小于完整的全長(zhǎng)序列而保留功能活性的截短蛋白質(zhì)。例如，可以以截短(核心蛋白質(zhì))形式使用bt蛋白質(zhì)(參閱如等(1989)和adang等,(1985))。本文所使用的術(shù)語(yǔ)“蛋白質(zhì)”包括功能活性的截短物。在一些情況下(特別是植物中的表達(dá))，使用表達(dá)截短蛋白質(zhì)的截短基因是有利的。優(yōu)選的截短基因一般編碼全長(zhǎng)蛋白質(zhì)的40、41、42、43、44、45、46、47、48、49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。本發(fā)明的某些蛋白質(zhì)已在本文中具體示例。由于這些蛋白質(zhì)僅是本發(fā)明蛋白質(zhì)的范例，很顯然本發(fā)明包括具有與示例蛋白質(zhì)相同或相似活性的變體或等同蛋白質(zhì)(和編碼其等同物的核苷酸序列)。等同蛋白質(zhì)與示例蛋白質(zhì)具有氨基酸相似性(和/或同源性)。氨基酸同一性一般至少為60％，優(yōu)選至少為75％，更優(yōu)選至少為80％，甚至更優(yōu)選至少為90％并可以至少為95％。還可以根據(jù)更具體的同一性和/或相似性范圍定義本發(fā)明優(yōu)選的蛋白質(zhì)。例如，與本文示例或提出的序列相比，同一性和/或相似性可以為49、50、51、52、53、54、55、56、57、58、59、60、61、62、63、64、65、66、67、68、69、70、71、72、73、74、75、76、77、78、79、80、81、82、83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99％。上文列出的任意數(shù)字可用于定義上限和下限。除非另有說明，使用如karlin和altschul(1993)中所改良的karlin和altschul(1990)算法測(cè)定本文所用的兩個(gè)核酸的序列同一性和/或相似性百分比。這樣的算法整合在altschul等(1990)的nblast和xblast程序中。使用nblast程序進(jìn)行blast核苷酸搜索，評(píng)分＝100、字寬＝12。可以如altschul等(1997)中所述使用gappedblast。使用blast和gappedblast程序時(shí)，使用程序(nblast和xblast)各自的默認(rèn)參數(shù)。參閱ncbi/nih網(wǎng)址。使用默認(rèn)參數(shù)用vectorntisuite8(informax有限公司,northbethesda,md,u.s.a)中的alignx函數(shù)得到用于比較目的的空位容許比對(duì)。它們是：空位開放罰分15、空位延伸罰分6.66和空位分隔罰分范圍8。還可以改變蛋白質(zhì)的多種特性和三維特征而不對(duì)蛋白質(zhì)的活性/功能性產(chǎn)生不利影響。保守性氨基酸取代是可以接受的/可以進(jìn)行而不對(duì)分子的活性和/或三維構(gòu)型產(chǎn)生不利影響。氨基酸可按以下分類：非極性、極性不帶電荷、堿性和酸性。只要取代不損害化合物的生物活性，則一類氨基酸被同類其他氨基酸替換的保守取代落在本發(fā)明的范圍內(nèi)。表2提供屬于每一類的氨基酸實(shí)例列表。在一些情況下，還可以進(jìn)行非保守取代。然而，優(yōu)選的取代不顯著降低蛋白質(zhì)的功能/生物活性。本文提到的“分離的”多核苷酸和/或“純化的”蛋白質(zhì)是指這些分子不伴隨有與其天然共存的其他分子。因此，提到“分離的”和/或“純化的”表示與本文所述的“人為”相關(guān)。例如，放入植物進(jìn)行表達(dá)的本發(fā)明細(xì)菌“基因”是“分離的多核苷酸”。同樣，植物所產(chǎn)生的來自細(xì)菌蛋白質(zhì)的蛋白質(zhì)是“分離的蛋白質(zhì)”。由于遺傳密碼的簡(jiǎn)并性/冗余性，多種不同的dna序列可以編碼本文公開的氨基酸序列。產(chǎn)生編碼相同或基本相同蛋白質(zhì)的替代dna序列在受本領(lǐng)域訓(xùn)練的技術(shù)人員的能力范圍內(nèi)。這些變體dna序列在本發(fā)明的范圍內(nèi)。在下文標(biāo)題為“用于植物表達(dá)的序列優(yōu)化”的章節(jié)中對(duì)此也有更詳細(xì)的描述。用于植物表達(dá)的序列優(yōu)化。為了在植物中實(shí)現(xiàn)異源基因的高表達(dá)，通常優(yōu)選重新設(shè)計(jì)所述基因以使其在植物細(xì)胞(的胞質(zhì))中更有效的表達(dá)。玉米就是這樣的一種植物，其中在轉(zhuǎn)化前重新設(shè)計(jì)異源基因以提高其在所述植物中的表達(dá)水平可能是優(yōu)選的。因此，在設(shè)計(jì)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因中額外的步驟是使用與靶植物序列(雙子葉或單子葉物種)比對(duì)更接近的密碼子偏好性重新改造異源基因以得到最優(yōu)表達(dá)。還可以優(yōu)化序列以在本文別處討論的更多具體類型植物中的任意一種中進(jìn)行表達(dá)。轉(zhuǎn)基因宿主?？梢詫⒈景l(fā)明的蛋白質(zhì)編碼基因引入多種微生物或植物宿主中。本發(fā)明包括轉(zhuǎn)基因植物細(xì)胞和轉(zhuǎn)基因植物。優(yōu)選的植物(和植物細(xì)胞)為玉米、擬南芥、煙草、大豆、棉花、蕓苔、稻、小麥、草坪草、豆科植物草料(如苜蓿和三葉草)和牧草等等。還可以根據(jù)本發(fā)明產(chǎn)生其他類型的轉(zhuǎn)基因植物，如水果、蔬菜、觀賞植物和樹木。更一般的，雙子葉植物和/或單子葉植物可用于本發(fā)明的多個(gè)方面。在優(yōu)選的實(shí)施方案中，基因的表達(dá)直接或間接導(dǎo)致目的蛋白質(zhì)在細(xì)胞內(nèi)的產(chǎn)生(和保持)。植物可以以這種方式得到除草劑抗性。這類宿主可以指轉(zhuǎn)基因、重組、轉(zhuǎn)化和/或轉(zhuǎn)染的宿主和/或細(xì)胞。在本發(fā)明的一些方面(例如克隆和制備目的基因)，可以受益于本發(fā)明的公開內(nèi)容根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)技術(shù)產(chǎn)生和使用微生物(優(yōu)選細(xì)菌)細(xì)胞。轉(zhuǎn)染了本發(fā)明多核苷酸的植物細(xì)胞可以再生為整個(gè)植株。本發(fā)明包括細(xì)胞培養(yǎng)物，包括組織細(xì)胞培養(yǎng)物、液體培養(yǎng)物和固體平板培養(yǎng)物。由本發(fā)明植物所產(chǎn)生和/或用于再生本發(fā)明植物的種子也包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。其他植物組織和部分也包括在本發(fā)明中。本發(fā)明同樣包括產(chǎn)生含有本發(fā)明多核苷酸的植物或細(xì)胞的方法。產(chǎn)生這類植物的一種優(yōu)選方法為通過種植本發(fā)明的種子。盡管可以優(yōu)選植物，本發(fā)明還包括在如熒光假單胞菌(pseudomonasfluorescens,pf)宿主菌株中產(chǎn)生高活性的重組aad-13。本發(fā)明包括優(yōu)選的生長(zhǎng)溫度、配制方法以及凍干方法：其中所述生長(zhǎng)溫度以在宿主中保持可溶性的活性aad-13；所述配制方法能在溶液中貯存和復(fù)原aad-13活性；而所述凍干方法能長(zhǎng)貯藏期和保質(zhì)期地保留aad-13活性。插入基因以形成轉(zhuǎn)基因宿主。本發(fā)明的一個(gè)方面是用表達(dá)本發(fā)明蛋白質(zhì)的本發(fā)明多核苷酸轉(zhuǎn)化/轉(zhuǎn)染植物、植物細(xì)胞和其他宿主細(xì)胞。以這種方式轉(zhuǎn)化的植物可以獲得對(duì)多種具有不同作用模式的除草劑的抗性?？梢允褂枚喾N方法在允許穩(wěn)定保持和表達(dá)基因的條件下將編碼所需蛋白質(zhì)的基因引入靶宿主。這些方法為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知，并描述于如美國(guó)專利no.5,135,867。含有aad-13多核苷酸的載體包括在本發(fā)明范圍內(nèi)。例如，大量克隆載體可用于將外來基因插入到高等植物中，所述載體含有大腸桿菌復(fù)制系統(tǒng)和允許選擇轉(zhuǎn)化的細(xì)胞的標(biāo)記。載體包括如pbr322、puc系列、m13mp系列、pacyc184等。因此，可以在合適的限制性位點(diǎn)將編碼蛋白質(zhì)的序列插入載體。得到的質(zhì)粒用于轉(zhuǎn)化進(jìn)大腸桿菌中。在合適的營(yíng)養(yǎng)培養(yǎng)基上培養(yǎng)大腸桿菌細(xì)胞，然后收獲并裂解。通過純化從基因組dna中回收質(zhì)粒。作為分析方法，一般進(jìn)行序列分析、限制性分析、電泳和其他生物化學(xué)-分子生物學(xué)方法。每次操作之后，可以限制性消化所使用的dna序列并與下一個(gè)dna序列連接。每個(gè)質(zhì)粒序列都可以克隆到同一個(gè)或其他質(zhì)粒中。取決于將所需基因插入到植物中的方法，其他dna序列可能是必要的。例如，如果使用ti或ri質(zhì)粒轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，則必須連接ti或ri質(zhì)粒t-dna序列的至少右邊界(但常為右邊界和左邊界)作為待插入基因的側(cè)翼區(qū)域。t-dna用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的用途已在ep120516、hoekema(1985)、fraley等(1986)和an等(1985)中有深入的研究和描述。大量技術(shù)可用于將dna插入植物宿主細(xì)胞。這些技術(shù)包括使用根癌農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumefaciens)或發(fā)根農(nóng)桿菌(agrobacteriumrhizogenes)作為轉(zhuǎn)化劑用t-dna轉(zhuǎn)化、融合、注射、生物射彈(微粒轟擊)、碳化硅晶須、氣溶膠柱、peg或電穿孔以及其他可能的方法。如果用農(nóng)桿菌進(jìn)行轉(zhuǎn)化，必須將待插入的dna克隆進(jìn)特殊的質(zhì)粒中，即中間載體或二元載體中。由于存在與t-dna中序列同源的序列，中間載體可以通過同源重組整合進(jìn)ti或ri質(zhì)粒。ti或ri質(zhì)粒還含有轉(zhuǎn)移t-dna所必需的vir區(qū)。中間載體不能在農(nóng)桿菌中自我復(fù)制。可以通過輔助質(zhì)粒(接合)將中間載體轉(zhuǎn)移到根癌農(nóng)桿菌中。二元載體在大腸桿菌和農(nóng)桿菌中都可以自我復(fù)制。它們含有選擇標(biāo)記基因和接頭或多聚接頭，兩側(cè)為右和左t-dna邊界區(qū)。它們可以直接轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌中(holsters等,1978)。作為宿主細(xì)胞的農(nóng)桿菌含有攜帶vir區(qū)的質(zhì)粒。vir區(qū)是將t-dna轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞所必需的。還可以含有額外的t-dna。將這樣轉(zhuǎn)化的細(xì)菌用于轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞?？梢杂欣赜酶┺r(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌培養(yǎng)植物外植體，以將dna轉(zhuǎn)移進(jìn)植物細(xì)胞。然后可以在合適的培養(yǎng)基中從感染的植物材料(如葉碎片、莖節(jié)段、根以及原生質(zhì)體或懸浮培養(yǎng)的細(xì)胞)再生完整植物，所述培養(yǎng)基可以含有用于選擇的抗生素或殺蟲劑。然后可以測(cè)試這樣得到的植物中插入dna的存在。在注射和電穿孔的情況下質(zhì)粒沒有特殊的要求?？梢允褂闷胀ㄙ|(zhì)粒，如puc衍生物。轉(zhuǎn)化細(xì)胞以通常的方式在植物中生長(zhǎng)。它們可以形成生殖細(xì)胞并將轉(zhuǎn)化的性狀傳遞到子代植物。這樣的植物能以正常方式培養(yǎng)并與具有相同轉(zhuǎn)化遺傳因子或其他遺傳因子的植物雜交。得到的雜合個(gè)體具有相應(yīng)的表型特性。在本發(fā)明一些優(yōu)選的實(shí)施方案中，從插入植物基因組的轉(zhuǎn)錄單位表達(dá)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因。優(yōu)選地，所述轉(zhuǎn)錄單位是重組載體，所述重組載體能夠穩(wěn)定整合進(jìn)植物基因組，并使得可以選擇表達(dá)編碼蛋白質(zhì)的mrna的轉(zhuǎn)化植物株系。插入dna一旦整合進(jìn)基因組，則相對(duì)穩(wěn)定(并不再釋放出來)。它一般包含賦予轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞對(duì)殺蟲劑或抗生素(如卡那霉素、g418、博來霉素、潮霉素或氯霉素等)抗性的選擇標(biāo)記。植物選擇標(biāo)記一般還提供對(duì)多種除草劑(如草銨膦(如pat/bar)、草甘膦(epsps)、als抑制劑(如咪唑啉酮類、磺酰脲類、三唑并嘧啶磺酰胺類等)、溴草腈、hppd抑制劑抗性、ppo抑制劑、acc-ase酶抑制劑及許多其他除草劑)的抗性。單獨(dú)使用的標(biāo)記應(yīng)相應(yīng)允許選擇轉(zhuǎn)化細(xì)胞而非不含插入dna的細(xì)胞。目的基因在植物細(xì)胞中優(yōu)選由組成型或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子表達(dá)。mrna一旦表達(dá)之后，就被翻譯成蛋白質(zhì)，從而將目的氨基酸摻入蛋白質(zhì)中。在植物細(xì)胞中表達(dá)的編碼蛋白質(zhì)的基因可以在組成型啟動(dòng)子、組織特異性啟動(dòng)子或誘導(dǎo)型啟動(dòng)子的控制下。存在若干將外來重組載體引入植物細(xì)胞以及獲得穩(wěn)定保持和表達(dá)引入基因的植物的技術(shù)。這類技術(shù)包括將包裹在微粒上的遺傳物質(zhì)直接引入細(xì)胞(cornell的美國(guó)專利no.4,945,050和dowelanco公司現(xiàn)為陶氏益農(nóng)公司(dowagrosciences,llc)的us5,141,131)。此外，可以使用農(nóng)桿菌技術(shù)轉(zhuǎn)化植物，參閱托萊多大學(xué)(universityoftoledo)的美國(guó)專利no.5,177,010；德克薩斯農(nóng)工大學(xué)(texasa&m)的us5,104,310；歐洲專利申請(qǐng)0131624b1；schilperoot的歐洲專利申請(qǐng)120516、159418b1和176112；schilperoot的美國(guó)專利no.5,149,645、5,469,976、5,464,763和4,940,838和4,693,976；maxplanck的歐洲專利申請(qǐng)116718、290799、320500；日本煙草公司(japantobacco)的歐洲專利申請(qǐng)604662和627752和美國(guó)專利no.5,591,616；汽巴-嘉基公司(cibageigy)現(xiàn)為先正達(dá)公司(syngenta)的歐洲專利申請(qǐng)0267159和0292435和美國(guó)專利no.5,231,019；calgene公司的美國(guó)專利no.5,463,174和4,762,785和艾格瑞斯特公司(agracetus)的美國(guó)專利no.5,004,863和5,159,135。其他轉(zhuǎn)化技術(shù)包括晶須技術(shù)。參閱捷利康公司(zeneca)現(xiàn)為先正達(dá)公司(syngenta)的美國(guó)專利no.5,302,523和5,464,765。其他直接dna遞送的轉(zhuǎn)化技術(shù)包括氣溶膠柱技術(shù)。參閱美國(guó)專利no.6,809,232。還可以使用電穿孔技術(shù)轉(zhuǎn)化植物。參閱鮑依斯·湯普森研究所(boycethompsoninstitute)的wo87/06614；迪卡布公司(dekalb)的美國(guó)專利no.5,472,869和5,384,253和植物遺傳系統(tǒng)公司(plantgeneticsystems)的wo92/09696和wo93/21335。另外，也可以用病毒載體產(chǎn)生表達(dá)目的蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)基因植物。例如，可以用麥克津植物科學(xué)有限公司(mycogenplantscience)和汽巴-嘉基公司(ciba-giegy)(現(xiàn)為先正達(dá)公司(syngenta))的美國(guó)專利no.5,569,597以及生物資源公司(biosource)現(xiàn)為大型生物公司(largescalebiology)的美國(guó)專利no.5,589,367和5,316,931中所述的方法用病毒載體轉(zhuǎn)化單子葉植物。如前所述，將dna構(gòu)建體引入植物宿主的方法對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的。任何提供有效轉(zhuǎn)化的方法都可以使用。例如，本文描述了多種植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化的方法并包括使用ti或ri質(zhì)粒等進(jìn)行農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化。在許多情況下，期望用t-dna邊界(更具體地為右邊界)與用于轉(zhuǎn)化的構(gòu)建體的一側(cè)或兩側(cè)相連。這在構(gòu)建體使用根癌農(nóng)桿菌或發(fā)根農(nóng)桿菌作為轉(zhuǎn)化模式時(shí)特別有用，不過t-dna邊界也可在其他轉(zhuǎn)化模式中使用。在將農(nóng)桿菌用于植物細(xì)胞轉(zhuǎn)化時(shí)，可以使用能引入宿主以與宿主中存在的t-dna或ti或ri質(zhì)粒同源重組的載體?？梢酝ㄟ^電穿孔、三親雜交和本領(lǐng)域技術(shù)人員已知的用于轉(zhuǎn)化革蘭氏陰性菌的其他技術(shù)進(jìn)行載體引入。載體轉(zhuǎn)化進(jìn)農(nóng)桿菌宿主的方式對(duì)于本發(fā)明不是關(guān)鍵的。含有用于重組的t-dna的ti或ri質(zhì)粒可以能夠或不能引起瘤形成，只要所述宿主中存在vir基因，這對(duì)本發(fā)明就不是關(guān)鍵的。將農(nóng)桿菌用于轉(zhuǎn)化時(shí)，在一些情況下，將t-dna邊界內(nèi)的表達(dá)構(gòu)建體插入廣譜載體如prk2或其衍生物中，如ditta等(1980)和epo0120515中所述。表達(dá)構(gòu)建體和t-dna內(nèi)包括一個(gè)或多個(gè)如本文所述允許選擇轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌和轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞的標(biāo)記。使用的具體標(biāo)記對(duì)于本發(fā)明并不重要，優(yōu)選的標(biāo)記物取決于所使用的宿主和構(gòu)建體。為了用農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化植物細(xì)胞，可以將外植體與轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌混合并孵育足夠的時(shí)間以允許其轉(zhuǎn)化。轉(zhuǎn)化后，通過用適當(dāng)抗生素的選擇殺死農(nóng)桿菌，并用適當(dāng)?shù)倪x擇培養(yǎng)基培養(yǎng)植物細(xì)胞。一但形成愈傷組織，可以根據(jù)植物組織培養(yǎng)和植物再生領(lǐng)域熟知的方法通過使用適當(dāng)?shù)闹参锛に卮龠M(jìn)芽形成。然而，愈傷組織中間期并不總是必要的。芽形成以后，可以將所述植物細(xì)胞轉(zhuǎn)移到促進(jìn)根形成的培養(yǎng)基，從而完成植物再生。然后可以培養(yǎng)植物產(chǎn)生種子，所述種子可以用于建立將來的世代。不論轉(zhuǎn)化技術(shù)如何，優(yōu)選將編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因整合進(jìn)基因轉(zhuǎn)移載體中，通過在載體中納入植物啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件以及3’非翻譯轉(zhuǎn)錄終止區(qū)(如nos等)使所述轉(zhuǎn)移載體適于在植物細(xì)胞中表達(dá)該基因。除了用于轉(zhuǎn)化植物的大量技術(shù)之外，與外來基因接觸的組織類型也可以多樣化。這樣的組織包括但不僅限于胚胎發(fā)生組織、i、ii和iii型愈傷組織、下胚軸、分生組織、根組織、用于韌皮部表達(dá)的組織等。使用本文所述的適當(dāng)技術(shù)可在去分化過程中轉(zhuǎn)化幾乎所有的植物組織。如上文所述，需要時(shí)可以使用多種選擇標(biāo)記。具體標(biāo)記的優(yōu)選由技術(shù)人員決定，但是任何以下的選擇標(biāo)記以及本文未列出的能發(fā)揮選擇標(biāo)記功能的任意其他基因都可以使用。這些選擇標(biāo)記包括但不僅限于編碼對(duì)抗生素卡那霉素、新霉素和g41的抗性、潮霉素抗性、甲氨碟呤抗性的轉(zhuǎn)座子tn5氨基糖苷磷酸轉(zhuǎn)移酶基因(aphii)以及編碼對(duì)草甘膦、草丁膦(雙丙氨膦或草銨膦)、als-抑制除草劑(咪唑啉酮類、磺酰脲類和三唑并嘧啶類除草劑)、acc-ase酶抑制劑(如芳氧基丙酸酯類或環(huán)己烯酮類)和其他如溴草腈和hppd抑制劑(如硝草酮)等抗性或耐性的基因。除了選擇標(biāo)記以外，可能需要使用報(bào)道基因。在一些情況下，報(bào)道基因可以與或不與選擇標(biāo)記一起使用。報(bào)道基因一般是在受體生物或組織中不存在的基因，一般編碼引起一些表型變化或酶特性的蛋白質(zhì)。weising等1998中提供了這些基因的實(shí)例。優(yōu)選的報(bào)道基因包括大腸桿菌uida基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)、來自大腸桿菌tn9的氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶基因、來自生物發(fā)光水母維多利亞水母(aequoreavictoria)的綠色熒光蛋白和來自北美螢火蟲(photinuspyralis)的熒光素酶基因。接著可以在所述基因引入受體細(xì)胞后的適當(dāng)時(shí)間實(shí)施檢測(cè)報(bào)道基因表達(dá)的試驗(yàn)。優(yōu)選的這類試驗(yàn)可使用編碼jefferson等1987所述的大腸桿菌uida基因座的β-葡糖醛酸糖苷酶(gus)的基因鑒定轉(zhuǎn)化細(xì)胞。除了植物啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件以外，可以在植物細(xì)胞中有效地使用來自多種來源的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件表達(dá)外源基因。例如細(xì)菌來源的啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件，如章魚堿合酶啟動(dòng)子、胭脂堿合酶啟動(dòng)子、甘露堿合酶啟動(dòng)子；病毒來源的啟動(dòng)子，如花椰菜花葉病毒(35s和19s)、35t(再改造的35s啟動(dòng)子，參閱美國(guó)專利no.6,166,302，特別是實(shí)施例7e)等。植物啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件包括但不僅限于核酮醣-1,6-二磷酸(rubp)羧化酶小亞基(ssu)、β-伴大豆球蛋白(conglycinin)啟動(dòng)子、β-菜豆素啟動(dòng)子、adh啟動(dòng)子、熱休克啟動(dòng)子和組織特異性啟動(dòng)子。還可以存在其他元件，如基質(zhì)附著區(qū)、支架附著區(qū)、內(nèi)含子、增強(qiáng)子、多腺苷酸化序列等，從而提高轉(zhuǎn)錄效率或dna整合。盡管這些元件能通過影響轉(zhuǎn)錄、mrna穩(wěn)定性等提供較好的dna表達(dá)或功能，但是它們對(duì)dna功能可能是或不是必需的。這些元件可以如所需包含在dna中，以得到轉(zhuǎn)化dna在植物中的優(yōu)化表達(dá)。典型元件包括但不僅限于adh-內(nèi)含子1、adh-內(nèi)含子6、苜?；ㄈ~病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列、滲調(diào)蛋白(osmotin)utr序列、玉米線條病毒外殼蛋白前導(dǎo)序列以及其他本領(lǐng)域技術(shù)人員可用的元件。還可以使用組成型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件從而指導(dǎo)在所有細(xì)胞類型和所有時(shí)間的持續(xù)基因表達(dá)(如肌動(dòng)蛋白、泛素、camv35s等)。組織特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件負(fù)責(zé)在特定細(xì)胞或組織類型(如葉或種子)中的基因表達(dá)(如玉米醇溶蛋白、油質(zhì)蛋白、napin、acp、球蛋白等)，這些也可以使用。啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件也可以在植物發(fā)育的某些階段有活性(或無(wú)活性)以及在植物組織和器官中有活性。這些的實(shí)例包括但不僅限于花粉特異性、胚胎特異性、玉米穗絲特異性、棉花纖維特異性、根特異性、種子胚乳特異性或無(wú)性繁殖期特異性啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件等。在某些情況下可能需要使用誘導(dǎo)型啟動(dòng)子調(diào)節(jié)元件，其負(fù)責(zé)應(yīng)答于特定信號(hào)(如物理刺激(熱休克基因)、光(rubp羧化酶)、激素(em)、代謝物、化學(xué)品(四環(huán)素應(yīng)答)和脅迫)的基因表達(dá)。可以使用在植物中發(fā)揮功能的其他所需的轉(zhuǎn)錄和翻譯元件。本領(lǐng)域已知大量植物特異性基因轉(zhuǎn)移載體?；谥参飏na病毒的系統(tǒng)也可用于表達(dá)細(xì)菌蛋白質(zhì)。為此，可以將編碼蛋白質(zhì)的基因插入感染目的宿主植物的適當(dāng)植物病毒的外殼啟動(dòng)子區(qū)。然后可以表達(dá)蛋白質(zhì)從而為植物提供對(duì)除草劑損害的保護(hù)?；谥参飏na病毒的系統(tǒng)描述于麥克津植物科學(xué)有限公司(mycogenplantsciences,inc.)的美國(guó)專利no.5,500,360和生物資源公司(biosource)現(xiàn)為大型生物公司(largescalebiology)的美國(guó)專利no.5,316,931和5,589,367。進(jìn)一步增加耐性或抗性水平的方法。本文顯示可賦予本發(fā)明植物新除草劑抗性性狀，并且未觀察到對(duì)表型包括產(chǎn)量的不利影響。這些植物在本發(fā)明范圍之內(nèi)。本文示例和提出的植物能耐受住如至少一種受試除草劑2×、3×、4×和5×一般應(yīng)用水平。這些耐性水平的提高在本發(fā)明范圍之內(nèi)。例如可對(duì)本領(lǐng)域已知的多種技術(shù)進(jìn)行可預(yù)見到的優(yōu)化和進(jìn)一步發(fā)展，以增加給定基因的表達(dá)。這些方法之一包括增加本發(fā)明aad-13基因的拷貝數(shù)(在表達(dá)盒中等)。也可以選擇具有多拷貝基因的轉(zhuǎn)化事件。強(qiáng)啟動(dòng)子和增強(qiáng)子能用于“過度”表達(dá)。這類啟動(dòng)子的實(shí)例包括使用35s增強(qiáng)子的優(yōu)選35t啟動(dòng)子。這類使用包括35s、玉米泛素、擬南芥泛素、擬南芥肌動(dòng)蛋白和csmv啟動(dòng)子。其他強(qiáng)病毒啟動(dòng)子也是優(yōu)選的。增強(qiáng)子包括4ocs和35s雙增強(qiáng)子?；|(zhì)粘附區(qū)(mar)也能用于如增加轉(zhuǎn)化效率和轉(zhuǎn)基因表達(dá)。根據(jù)本發(fā)明，改組(直接進(jìn)化)和轉(zhuǎn)錄因子也能用于實(shí)施方案。還能設(shè)計(jì)多種蛋白質(zhì)，所述蛋白質(zhì)在序列水平變化但是保留相同或相似的全部必需的三維結(jié)構(gòu)、表面電荷分布等等。參閱如美國(guó)專利no.7,058,515；larson等proteinsci.200211:2804-2813,“thoroughlysamplingsequencespace:large-scaleproteindesignofstructuralensembles.”；crameri等naturebiotechnology15,436-438(1997),“molecularevolutionofanarsenatedetoxificationpathwaybydnashuffling.”；stemmer,w.p.c.1994.dnashufflingbyrandomfragmentationandreassembly:invitrorecombinationformolecularevolution.proc.natl.acad.sci.usa91:10747-10751；stemmer,w.p.c.1994.rapidevolutionofaproteininvitrobydnashuffling.nature370:389-391；stemmer,w.p.c.1995.searchingsequencespace.bio/technology13:549-553；crameri,a.,cwirla,s.和stemmer,w.p.c.1996.constructionandevolutionofantibody-phagelibrariesbydnashuffling.naturemedicine2:100-103以及crameri,a.,whitehorn,e.a.,tate,e.和stemmer,w.p.c.1996.improvedgreenfluorescentproteinbymolecularevolutionusingdnashuffling.naturebiotechnology14:315-319。插入植物細(xì)胞的重組多核苷酸活性依賴于與插入物相鄰的內(nèi)源植物dna的影響。因此另一種選擇是利用已知的植物基因組中用于插入的絕佳位置。參閱如wo2005/103266a1，涉及cry1f和cry1ac棉花事件；在這些基因座本發(fā)明aad-13基因可以替代cry1f和/或cry1ac插入。因此，根據(jù)本發(fā)明可以使用如靶向同源重組。這類技術(shù)是例如wo03/080809a2和相應(yīng)的涉及鋅指在靶向重組中的用途的已公開美國(guó)申請(qǐng)(uspa20030232410)的主題。本領(lǐng)域也已知重組酶的用途(例如cre-lox和flp-frt)。確信aad-13的解毒在細(xì)胞質(zhì)中發(fā)生。因此本發(fā)明的方面包括進(jìn)一步穩(wěn)定這種蛋白質(zhì)和mrna(包括阻斷mrna的降解)的方法，并相應(yīng)地應(yīng)用已知的技術(shù)?？梢栽O(shè)計(jì)本發(fā)明蛋白質(zhì)以抵抗蛋白酶的降解等(通過再設(shè)計(jì)蛋白質(zhì)的氨基酸序列能有效去除蛋白酶的切割位點(diǎn))。這些實(shí)施方案包括使用來自滲調(diào)蛋白的5’和3’莖環(huán)結(jié)構(gòu)樣utr及per5(富含au的5’非翻譯序列)。還可以使用類似7-甲基或2’-o-甲基基團(tuán)的5’帽子，如7-甲基鳥苷酸殘基。參閱如proc.natl.acad.sci.usa74卷,7期,2734-2738頁(yè)(1977年7月)importanceof5’-terminalblockingstructuretostabilizemrnaineukaryoticproteinsynthesis。也可以使用蛋白質(zhì)復(fù)合體或配體封閉基團(tuán)。還可以在本發(fā)明范圍內(nèi)進(jìn)行對(duì)于aad-13最適的5’或3’utr的計(jì)算機(jī)設(shè)計(jì)(合成的發(fā)夾)。一般的計(jì)算機(jī)建模以及基因改組和直接進(jìn)化在本文的別處進(jìn)行討論。至于更具體的計(jì)算機(jī)建模和utr，用于預(yù)測(cè)/評(píng)測(cè)本發(fā)明5’和3’utr衍生物的計(jì)算機(jī)建模技術(shù)包括但不僅限于：從geneticscorporationgroup,madison,wi獲得的mfoldversion3.1(參閱zucker等algorithmsandthermodynamicsforrnasecondarystructureprediction:apracticalguide.inrnabiochemistryandbiotechnology,11-43,j.barciszewski&b.f.c.clark編,natoasiseries,kluweracademicpublishers,dordrecht,nl,(1999)；zucker等expandedsequencedependenceofthermodynamicparametersimprovespredictionofrnasecondarystructure.j.mol.biol.288,911-940(1999)；zucker等rnasecondarystructureprediction.incurrentprotocolsinnucleicacidchemistrys.beaucage,d.e.bergstrom,g.d.glick和r.a.jones編,johnwiley&sons,newyork,11.2.1-11.2.10,(2000))，cove(rnastructureanalysisusingcovariancemodels(stochasticcontextfreegrammarmethods))v.2.4.2(eddy&durbin,nucl.acidsres.1994,22:2079-2088)作為源代碼免費(fèi)分發(fā)并可通過進(jìn)入網(wǎng)站genetics.wustl.edu/eddy/software/下載,以及foldalign也是免費(fèi)分發(fā)并可在網(wǎng)站bioinf.au.dk.下載獲得。foldalign/(參閱findingthemostsignificantcommonsequenceandstructuremotifsinasetofrnasequences.j.gorodkin,l.j.heyer和g.d.stormo.nucleicacidsresearch,25卷,18期3724-3732頁(yè),1997；findingcommonsequenceandstructuremotifsinasetofrnasequences.j.gorodkin,l.j.heyer和g.d.stormo.ismb5；120-123,1997)。本發(fā)明的實(shí)施方案可與自然進(jìn)化或化學(xué)誘導(dǎo)的突變體結(jié)合使用(可通過篩選技術(shù)挑選突變體，然后用aad-13和其他可能基因轉(zhuǎn)化)。本發(fā)明的植物可聯(lián)合als抗性和/或進(jìn)化的草甘膦抗性。例如氨草啶抗性也能與aad-13基因聯(lián)合或“疊加”。傳統(tǒng)育種技術(shù)也能聯(lián)合本發(fā)明以有力結(jié)合、基因滲入和提高所需性狀。進(jìn)一步的提高還包括使用合適的安全劑來進(jìn)一步保護(hù)植物和/或增加對(duì)更多除草劑的交叉抗性。(安全劑一般通過活化/表達(dá)cp450發(fā)揮增強(qiáng)植物免疫系統(tǒng)的作用。安全劑是化學(xué)試劑，通過生理或分子機(jī)制降低除草劑對(duì)作物植物的植物毒性，并不損害雜草控制功效。)除草劑安全劑包括解草嗪、解毒喹、解草胺腈、二氯丙烯胺、dicyclonon、dietholate、解草唑、解草啶、解草安、肟草安、解草唑、雙苯唑酸、吡唑解草酯、mephenate、萘酐和解草腈。植物激活劑(通過激活植物的防御機(jī)制保護(hù)植物的新型化合物)也能用于本發(fā)明的實(shí)施方案。激活劑包括阿拉酸式苯和烯丙苯噻唑(probenazole)。商業(yè)安全劑可用于保護(hù)大種子禾本科作物(如玉米、高粱粒和濕地播種稻(wet-sownrice))對(duì)抗種植前摻入土壤的或出土前施用的硫代氨基甲酸酯和氯乙酰苯胺家族除草劑。安全劑還已發(fā)展為保護(hù)冬季谷類作物(如小麥)對(duì)抗出苗后應(yīng)用的芳氧基苯氧丙酸酯類和磺酰脲類除草劑。安全劑在保護(hù)玉米和稻對(duì)抗磺酰脲類、咪唑啉酮類、環(huán)己烯酮類類、異唑類和三酮除草劑中的用途也發(fā)展成熟。在使用安全劑的植物中安全劑誘導(dǎo)的增強(qiáng)除草劑的解毒作為安全劑作用的主要機(jī)制被廣泛接受。安全劑誘導(dǎo)輔因子(如谷胱甘肽)和除草劑解毒酶(如谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶、細(xì)胞色素p450單加氧酶和糖基轉(zhuǎn)移酶)。hatzioskk,burgosn(2004)“metabolism-basedherbicideresistance:regulationbysafeners,”weedscience:52卷,3期454–467頁(yè)。使用疊加aad-13的細(xì)胞色素p450單加氧酶基因是一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案。p450參與除草劑代謝；cp450可以是如哺乳動(dòng)物或植物來源。在高等植物中，已知細(xì)胞色素p450單加氧酶(p450)進(jìn)行次生代謝。p450與nadph-細(xì)胞色素p450氧化還原酶(還原酶)合作在異生物素的氧化代謝中發(fā)揮重要作用。已報(bào)道對(duì)一些除草劑的抗性作為p450和谷胱甘肽s-轉(zhuǎn)移酶代謝的結(jié)果。許多參與哺乳動(dòng)物的異生物素代謝的微粒體p450物質(zhì)已被分子克隆表征。他們中的某些被報(bào)道有效代謝一些除草劑。因此，用植物或哺乳動(dòng)物p450轉(zhuǎn)基因的植物表現(xiàn)出對(duì)一些除草劑的抗性。前述的一個(gè)優(yōu)選的實(shí)施方案是使用cp450抵抗乙草胺(基于乙草胺的產(chǎn)品包括keystonela、和除草劑)和/或氟樂靈(如)。某些優(yōu)選的實(shí)施方案包括在大豆和/或玉米中的這種抗性。關(guān)于這些實(shí)施方案的另外的指導(dǎo)，參閱如inui等“aselectablemarkerusingcytochromep450monooxygenasesforarabidopsistransformation,”plantbiotechnology22,281–286(2005)(涉及通過使用代謝除草劑的人細(xì)胞色素p450單加氧酶的根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化擬南芥的選擇系統(tǒng)；轉(zhuǎn)化除草劑耐性樹苗，并用除草劑乙草胺、甲基胺草磷、氯苯胺靈、氯磺隆、氟草敏和二甲戊樂靈選擇)；siminszky等“expressionofasoybeancytochromep450monooxygenasecdnainyeastandtobaccoenhancesthemetabolismofphenylureaherbicides,”pnas96卷,4期,1750-1755,1999年2月16日；sheldon等weedscience:48卷,3期,291-295頁(yè),“acytochromep450monooxygenasecdna(cyp71a10)confersresistancetolinuronintransgenicnicotianatabacum”和“phytoremediationoftheherbicidesatrazineandmetolachlorbytransgenicriceplantsexpressinghumancyp1a1,cyp2b6,andcyp2c19,”jagricfoodchem.2006年4月19日；54(8):2985-91(涉及在稻中測(cè)試人細(xì)胞色素p450單加氧酶，其中稻植物被報(bào)道顯示對(duì)氯乙酰胺類(乙草胺、甲草胺、異丙草胺、丙草胺和噻吩草胺)、氧乙酰胺類(苯噻草胺)、噠嗪酮類(氟草敏)、2,6-二硝基苯胺類(氟樂靈和二甲戊樂靈)、磷酰胺類(甲基胺草磷、硫代氨基甲酸酯類(稗草畏)和尿素類(綠麥隆))高耐性。改變或使用不同的2,4-滴化學(xué)反應(yīng)令本發(fā)明aad-13基因更有效也是可能的。這種可能的改變包括創(chuàng)造更好的底物和更好的離去基團(tuán)(更高的電負(fù)性)。植物生長(zhǎng)素運(yùn)輸抑制劑(如氟吡草腙)也能用于增加2,4-滴除草劑活性。除非具體說明或暗示，如本文中所用，術(shù)語(yǔ)“一”、“一個(gè)/一種”和“所述”表示“至少一個(gè)”。本文提到或引用的所有專利、專利申請(qǐng)、臨時(shí)申請(qǐng)和出版物整體引為參考，引用程度不與本說明書的明確教導(dǎo)相沖突。以下為說明本發(fā)明操作方法的實(shí)施例。這些實(shí)施例不應(yīng)理解為限制性的。除非另有說明，所有的百分比均以重量計(jì)并且所有的溶劑混合物比例以體積計(jì)。實(shí)施例1－鑒定在植物中賦予除草劑抗性的基因的方法作為鑒定在植物中具有除草劑降解活性的基因的方法，可以發(fā)掘現(xiàn)有的公共數(shù)據(jù)庫(kù)如ncbi(美國(guó)國(guó)家生物技術(shù)信息中心)。為開始此過程，需要有已鑒定為編碼具有所需特征(即α-酮戊二酸雙加氧酶活性)的蛋白質(zhì)的功能基因序列。接著將此蛋白質(zhì)序列用作blast(基本局部比對(duì)檢索工具)(altschul等,1997)算法的輸入，以與存儲(chǔ)的可用ncbi蛋白質(zhì)序列進(jìn)行比較。使用默認(rèn)設(shè)置，此檢索返回不同水平的100個(gè)以上同源蛋白質(zhì)序列。它們?cè)诎被崴降姆秶鷱母咄恍?85％-98％)到極低同一性(23％-35％)。通常僅高同源性的序列可預(yù)期保留與輸入序列相似的特性。在這種情況下僅選擇具有≤50％的同源性的序列。如本文示例，克隆和重組表達(dá)低至35％氨基酸保守性的同源物(相對(duì)于來自于真養(yǎng)雷氏菌的tfda)不僅可用于賦予對(duì)計(jì)劃內(nèi)的除草劑的商品水平的抗性，還可用于對(duì)以前從未用這些酶測(cè)試過的底物賦予商品水平的抗性。從ncbi數(shù)據(jù)庫(kù)鑒定了單個(gè)基因(sdpa)，其作為與tfda僅有35％氨基酸同一性的同源物(參閱ncbi.nlm.nih.gov站點(diǎn)，登錄號(hào)aj628860)。通過首先將數(shù)據(jù)庫(kù)中保存的sdpa和tfdadna序列翻譯成蛋白質(zhì)，然后用vectornti軟件包中的clustalw進(jìn)行多重序列比對(duì)來測(cè)定同一性百分比。實(shí)施例2－在植物和細(xì)菌中表達(dá)的序列優(yōu)化2.1－背景為了在植物中得到異源基因的高表達(dá)，可以優(yōu)選重新改造基因的蛋白質(zhì)編碼序列以使其在植物細(xì)胞中更有效的表達(dá)。玉米就是這樣的一種植物，其中在轉(zhuǎn)化前重新設(shè)計(jì)異源蛋白質(zhì)編碼區(qū)域以提高在植物中的基因表達(dá)水平和編碼蛋白質(zhì)的水平可能是優(yōu)選的。因此，在設(shè)計(jì)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因中額外的步驟是重新改造異源基因以得到最優(yōu)表達(dá)。重新改造在玉米中表達(dá)的細(xì)菌基因的一個(gè)原因是由于天然基因的非最優(yōu)g+c含量。例如，許多天然細(xì)菌基因極低的g+c含量(和因此高a+t含量的偏移傾向)引起產(chǎn)生模擬或復(fù)制已知為高度富含a+t的植物基因控制序列的序列。在引入植物的基因dna中存在一些富含a+t的序列(如一般見于基因啟動(dòng)子中的tata盒區(qū))可能引起基因的異常轉(zhuǎn)錄。另一方面，轉(zhuǎn)錄的mrna中其他調(diào)節(jié)序列(如多腺苷酸化信號(hào)序列(如aauaaa)或與參與前mrna剪接的小核rna互補(bǔ)的序列)的存在可能導(dǎo)致rna的不穩(wěn)定性。因此，設(shè)計(jì)用于玉米表達(dá)的編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因(更優(yōu)選稱為植物優(yōu)化基因)的一個(gè)目的是產(chǎn)生具有g(shù)+c含量(優(yōu)選與編碼代謝酶的玉米基因具有接近的g+c含量)的dna序列。設(shè)計(jì)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因的另一個(gè)目的是產(chǎn)生其序列修飾不阻礙翻譯的dna序列。表3展示了玉米基因的g+c含量。對(duì)于表ex2-1中的數(shù)據(jù)，基因的編碼區(qū)出自genbank(第71次發(fā)布)條目，并用macvectortm程序(accelerys公司,sandiego,california)計(jì)算堿基組成。計(jì)算中忽略了內(nèi)含子序列。a每一類基因的數(shù)目在括號(hào)內(nèi)給出。b標(biāo)準(zhǔn)差在括號(hào)內(nèi)給出。c平均值計(jì)算中忽略了混合組平均值。存在多個(gè)可公開利用的dna序列數(shù)據(jù)庫(kù)，其中可以發(fā)現(xiàn)關(guān)于植物基因組或多種植物基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)的g+c含量的信息。一個(gè)此類數(shù)據(jù)庫(kù)位于萬(wàn)維網(wǎng)的urlhttp://www.kazusa.or.jp/codon/。在該網(wǎng)站，可以發(fā)現(xiàn)例如煙草(nicotianatabacum)蛋白質(zhì)編碼序列的平均g+c含量為43.3％(分析了包含453,797個(gè)密碼子的1268個(gè)序列)。還可以發(fā)現(xiàn)玉米(zeamays)蛋白質(zhì)編碼序列的平均g+c含量為54.9％(包含973,578個(gè)密碼子的2280個(gè)序列的分析)。相比，在seqidno:2中公開的sphingobiumherbicidovoransaad-13蛋白質(zhì)編碼序列的g+c含量為67.2％。從而，設(shè)計(jì)用于在玉米或雙子葉植物中表達(dá)以將蛋白質(zhì)編碼區(qū)的g+c含量降低到40-55％的范圍時(shí)是有利的。因此，在編碼用于植物表達(dá)的細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因，更優(yōu)選稱作植物優(yōu)化基因的設(shè)計(jì)中的一個(gè)目的是產(chǎn)生g+c含量?jī)?yōu)選與編碼代謝酶的天然宿主植物基因的g+c含量接近的dna序列。由于遺傳密碼的冗余性/簡(jiǎn)并性(即一些氨基酸由多于一個(gè)密碼子指定)提供的可塑性，基因組在不同生物或不同綱的生物中的進(jìn)化引起了對(duì)冗余密碼子不同的使用。在蛋白質(zhì)編碼區(qū)的平均堿基組成中反映了這種“密碼子偏好”。例如，具有相對(duì)低g+c含量的生物使用冗余密碼子的第三個(gè)位置上為a或t的密碼子，而具有較高g+c含量的使用第三個(gè)位置上為g或c的密碼子。mrna中“少見”密碼子的存在被認(rèn)為可降低該mrna的絕對(duì)翻譯率，特別是對(duì)應(yīng)于少見密碼子的載荷trna的相對(duì)豐度低時(shí)。這一事實(shí)可擴(kuò)展為：對(duì)于多個(gè)少見密碼子，單個(gè)少見密碼子對(duì)翻譯率的降低將至少是累加的。因此，具有相對(duì)高含量少見密碼子的mrna將相應(yīng)的具有低翻譯率。該翻譯率將進(jìn)而反映為低水平的編碼蛋白質(zhì)。在設(shè)計(jì)編碼用于在玉米(或其他植物，如棉花或大豆)中表達(dá)的細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因中，有幫助的是確定了預(yù)期的宿主植物的密碼子偏倚?？梢詫⒚艽a子偏倚計(jì)算為單個(gè)密碼子相對(duì)于所有氨基酸的密碼子使用的頻率。備選地，如表ex2-2第c,d,i和j列中公開的，可以將密碼子偏倚計(jì)算為單個(gè)密碼子用于編碼特定氨基酸的頻率(相對(duì)于該氨基酸的所有其他密碼子(同義密碼子))。玉米的密碼子偏倚是植物用來編碼其蛋白質(zhì)的統(tǒng)計(jì)學(xué)密碼子分布，并且從706種玉米基因計(jì)算的密碼子選擇在表ex2-2的c和i列中顯示。在設(shè)計(jì)編碼用于植物表達(dá)的細(xì)菌蛋白質(zhì)的基因的編碼區(qū)中，應(yīng)該確定植物優(yōu)選的主要(“第一選擇”)密碼子，當(dāng)存在多個(gè)選擇時(shí)，也應(yīng)該確定優(yōu)選密碼子的第二個(gè)、第三個(gè)、第四個(gè)選擇等。然后設(shè)計(jì)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的氨基酸序列的新dna序列，但新dna序列由于用植物(第一優(yōu)選，第二優(yōu)選、第三優(yōu)選或第四優(yōu)選等)密碼子進(jìn)行取代以指定蛋白質(zhì)氨基酸序列內(nèi)每個(gè)位置的氨基酸而區(qū)別于(編碼蛋白質(zhì)的)天然細(xì)菌dna序列。然后分析新序列中可能由修飾產(chǎn)生的限制性酶切位點(diǎn)。通過用第一、第二、第三或第四選擇的優(yōu)選密碼子替換該密碼子來進(jìn)一步修飾鑒定出的位點(diǎn)。序列中可能影響目的基因轉(zhuǎn)錄或翻譯的其他位點(diǎn)為外顯子－內(nèi)含子接合處(5’或3’)、多腺苷酸添加信號(hào)或rna聚合酶終止信號(hào)。進(jìn)一步分析和修飾序列，以降低ta或cg雙聯(lián)體的頻率。除了雙聯(lián)體之外，具有多于約六個(gè)相同殘基的g或c序列嵌段也能影響序列的轉(zhuǎn)錄或翻譯。因此，有利地通過用下一優(yōu)選的密碼子選擇替換首選或次選等密碼子來修飾這些嵌段。因此，為了設(shè)計(jì)編碼細(xì)菌蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化基因，使用建立自密碼子偏好表的冗余遺傳密碼設(shè)計(jì)編碼所述蛋白質(zhì)的氨基酸序列的dna序列，所述偏好表整理自特定的一種或多種植物的基因序列。得到的dna序列具有較高程度的密碼子多樣性、所需的堿基組成，可含有策略性放置的限制性酶識(shí)別位點(diǎn)并缺少可能干擾基因轉(zhuǎn)錄或產(chǎn)物mrna翻譯的序列。功能性等同于本發(fā)明基因/蛋白質(zhì)的此類合成基因可用于轉(zhuǎn)化包括植物在內(nèi)的宿主。關(guān)于合成基因產(chǎn)生的其他指導(dǎo)可見于如美國(guó)專利no.5,380,831和pct申請(qǐng)wo97/13402。為了設(shè)計(jì)編碼aad-13蛋白質(zhì)的植物優(yōu)化的基因中，利用從特定宿主植物(玉米和雙子葉植物)的蛋白質(zhì)編碼序列編撰的密碼子偏倚表建立的冗余遺傳密碼，設(shè)計(jì)編碼aad-13氨基酸序列的dna序列。在表ex2-2中，c、d、i和j列給出了每種氨基酸的同義密碼子的分布(以該氨基酸的所有密碼子的％選擇表示)，如在706種玉米編碼區(qū)和154種雙子葉植物基因中發(fā)現(xiàn)的[ref:murray,e.e.,lotzer,j.,eberle,m.(1989)codonusageinplantgenes.nucl.acidsres.17:477-497]。每種植物類型最優(yōu)選的密碼子以粗體表示，當(dāng)存在多個(gè)選擇時(shí)，可以鑒定密碼子的第二個(gè)、第三個(gè)或第四個(gè)選擇。顯然一些氨基酸的一些同義密碼子在植物中僅僅很少見(例如，玉米中的agt和雙子葉植物中的ccg)。而且，玉米和雙子葉植物的各自密碼子選擇不同(例如，丙氨酸密碼子gcg在玉米基因中比在雙子葉植物基因中更經(jīng)常地發(fā)現(xiàn)，而精氨酸密碼子aga在雙子葉植物基因中比玉米基因更經(jīng)常地使用)。從而，顯而易見的是，被設(shè)計(jì)用來反映一個(gè)植物物種的基因的最優(yōu)密碼子組成的蛋白質(zhì)編碼區(qū)對(duì)于在另一植物物種中的表達(dá)可能具有次優(yōu)的密碼子組成。在產(chǎn)生接近玉米和雙子葉植物基因兩者的平均密碼子分布的編碼蛋白質(zhì)的dna序列的設(shè)計(jì)方法中，排除這樣的密碼子，其相對(duì)于任一類型植物中的該氨基酸的其他同義密碼子而言不經(jīng)常使用(通過表ex2-2中的f和l列中的dnu指出)。通常，如果密碼子在編碼任一植物類型的基因中相關(guān)氨基酸的次數(shù)為約10％或更少，那么該密碼子不常使用(通過表ex2-2的e和k列中的na表示)。為了平衡氨基酸的剩余密碼子選擇的分布，使用下式計(jì)算每個(gè)密碼子的加權(quán)平均表示：c1的加權(quán)平均％＝1/(％c1+％c2+％c3+等)x％c1x100，其中c1是所討論的密碼子，％c2,％c3等代表對(duì)于玉米和雙子葉植物而言表ex2-2的剩余同義密碼子的％平均值(相關(guān)密碼子的％平均值來自e和k列)。每個(gè)密碼子的加權(quán)平均％值在表ex2-2的f和l列中給出。表ex2-2.706種玉米基因(c和i列)和154種雙子葉植物基因(d和j列)的編碼區(qū)中的同義密碼子表示。在f和l列為對(duì)植物優(yōu)化的合成基因設(shè)計(jì)設(shè)置的平衡偏倚的密碼子表示值。為在玉米和雙子葉植物細(xì)胞中均最優(yōu)表達(dá)，使用在玉米和雙子葉植物基因中發(fā)現(xiàn)的經(jīng)常使用的密碼子的平衡密碼子分布，設(shè)計(jì)基本上編碼seqidno:2的sphingobiumherbicidovoransaad-13蛋白質(zhì)的氨基酸序列的新的dna序列。2.2－aad-13植物重建分析對(duì)aad-13的天然dna序列編碼區(qū)(seqidno:1)的861個(gè)堿基對(duì)(bp)的深入分析顯示存在若干認(rèn)為不利于最佳植物表達(dá)的序列基序以及非最佳密碼子組成。seqidno:1(aad-13)編碼的蛋白質(zhì)如seqidno:2所示。為改善重組蛋白在玉米和雙子葉植物中的生產(chǎn)，產(chǎn)生了“植物優(yōu)化”dna序列(aad-13v1)(seqidno:3)，其編碼的蛋白質(zhì)(seqidno:4)除了在第二個(gè)位置(在seqidno:4中以下劃線標(biāo)出)加入丙氨酸殘基外，它與seqidno:2中公開的天然蛋白質(zhì)相同。額外的丙氨酸密碼子(gct，在seqidno:3中以下劃線標(biāo)出)編碼跨越atg翻譯起始密碼子的部分ncoi限制性酶識(shí)別位點(diǎn)(ccatgg)。因此，它服務(wù)于雙重目的，即在改善atg起始密碼子周圍的序列以優(yōu)化翻譯起始的同時(shí)，促進(jìn)其后的克隆操作。天然和植物優(yōu)化(v1)的編碼區(qū)所編碼的蛋白質(zhì)99.3％相同，僅2號(hào)氨基酸不同。相反，天然和植物優(yōu)化(v1)的編碼區(qū)的dna序列僅77.3％相同。進(jìn)行了天然和植物優(yōu)化的dna的序列比對(duì)，表ex2-3顯示天然(列a和d)和植物優(yōu)化序列(列b和e)密碼子組成的差異，并允許與理論上植物優(yōu)化的序列(列c和f)比較，所述理論上植物優(yōu)化的序列將精確地具有表ex2-2的f和l列指出的密碼子組成。表ex2-3.天然aad-13、植物優(yōu)化的形式(v1)和理論上植物優(yōu)化的形式的編碼區(qū)的密碼子組成比較。表ex2-3的研究清楚得出天然和植物優(yōu)化編碼區(qū)盡管編碼幾乎相同的蛋白質(zhì)，但是二者之間有顯著的不同。植物優(yōu)化形式(v1)接近模擬編碼aad-13蛋白的理論植物優(yōu)化編碼區(qū)的密碼子組成。2.3大腸桿菌表達(dá)的重建特定設(shè)計(jì)的大腸桿菌菌株和相關(guān)的載體系統(tǒng)經(jīng)常用來產(chǎn)生相對(duì)大量的蛋白質(zhì)，用于生物化學(xué)和分析研究。時(shí)常發(fā)現(xiàn)編碼所需蛋白質(zhì)的天然基因(即使基因的來源生物是另一種細(xì)菌生物)不是很適合在大腸桿菌中高水平表達(dá)。在這樣的情況下，重新改造基因的蛋白質(zhì)編碼區(qū)使其更適合在在大腸桿菌中表達(dá)是可能和需要的。大腸桿菌ii類基因定義為在大腸桿菌細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期可高水平和持續(xù)表達(dá)的基因[ref:henaut,a.和danchin,a.(1996)inescherichiacoliandsalmonellatyphimuriumcellularandmolecularbiology,卷2,2047–2066頁(yè)。neidhardt,f.,curtissiii,r.,ingraham,j.,lin,e.,low,b.,magasanik,b.,reznikoff,w.,riley,m.,schaechter,m.和umbarger,h.(編)americansocietyformicrobiology,washington,dc]。通過研究大腸桿菌ii類基因編碼區(qū)的密碼子組成，可以對(duì)這些大腸桿菌ii類基因編碼區(qū)設(shè)計(jì)平均密碼子組成。認(rèn)為具有模擬大腸桿菌ii類基因密碼子組成的平均密碼子組成的蛋白質(zhì)編碼區(qū)將適宜在大腸桿菌細(xì)胞的指數(shù)生長(zhǎng)期表達(dá)。使用這些指導(dǎo)，根據(jù)大腸桿菌ii類基因編碼區(qū)的平均密碼子組成，設(shè)計(jì)編碼aad-13蛋白(seqidno:4)的新dna序列；包括，如上面所提到的第二個(gè)位置上的額外的丙氨酸。將最初僅基于密碼子組成設(shè)計(jì)的序列，進(jìn)一步改造為包括適合于克隆進(jìn)大腸桿菌表達(dá)載體的一些限制性酶識(shí)別序列。避免有害的序列特征如高度穩(wěn)定的莖環(huán)結(jié)構(gòu)、以及與16s核糖體rna的3’末端同源的基因內(nèi)序列(如shinedalgarno序列)。大腸桿菌優(yōu)化序列(v2)作為seqidno:5公開，并且編碼seqidno:4公開的蛋白質(zhì)。天然和大腸桿菌優(yōu)化(v2)dna序列具有80.2％同一性，而植物優(yōu)化(v1)和大腸桿菌優(yōu)化(v2)dna序列具有84.4％同一性。表ex2-4顯示天然aad-13編碼區(qū)(列a和d)、在大腸桿菌中表達(dá)的優(yōu)化aad-13編碼區(qū)(v2；列b和e)的密碼子組成，以及具有大腸桿菌ii類基因優(yōu)化密碼子組成的aad-13蛋白的理論編碼區(qū)的密碼子組成(列c和f)。表ex2-4.天然aad-13、大腸桿菌優(yōu)化的形式(v2)和理論大腸桿菌ii類優(yōu)化的形式的編碼區(qū)的密碼子組成比較。表ex2-4的研究清楚得出天然和大腸桿菌優(yōu)化編碼區(qū)盡管編碼幾乎相同的蛋白質(zhì)，但是二者之間有顯著的不同。大腸桿菌優(yōu)化形式(v2)接近模擬編碼aad-13蛋白的理論大腸桿菌優(yōu)化編碼區(qū)的密碼子組成。實(shí)施例3-表達(dá)和轉(zhuǎn)化載體的克隆3.1大腸桿菌pet表達(dá)載體的構(gòu)建。使用與加入額外克隆接頭位點(diǎn)相應(yīng)的限制性酶(xbai、xhoi)將aad-13(v2)從picoscript載體中切出并連接進(jìn)pet280鏈霉素/壯觀霉素抗性載體中。然后將連接產(chǎn)物轉(zhuǎn)化進(jìn)top10f’大腸桿菌，并涂在luriabroth+50μg/ml鏈霉素&壯觀霉素(lbs/s)瓊脂平板上。為區(qū)分aad-13(v2):pet280和pcr2.1:pet280連接，挑取約20個(gè)分離菌落至6mllb-s/s中，并在37℃搖動(dòng)培養(yǎng)4小時(shí)。然后將每個(gè)培養(yǎng)物點(diǎn)種到lb+50μg/ml卡那霉素平板上，在37℃過夜孵育。假定在lb-k上生長(zhǎng)的菌落具有連接進(jìn)的pcr2.1載體，將其棄去。如前述從剩余的培養(yǎng)物提取質(zhì)粒，用fsp1消化檢驗(yàn)正確性。最終表達(dá)構(gòu)建體被命名為pdab4115。3.3–雙元載體的完成植物優(yōu)化基因aad-13(v1)從picoscript獲得(完成了基因重建設(shè)計(jì)(見上文)并外包給picoscript進(jìn)行構(gòu)建)。將aad-13(v1)基因作為ncoi–saci片段克隆到pdab4055中。將所得的構(gòu)建體稱作pdab4113，含有：[atubi10啟動(dòng)子:aad-13(v1):atuorf13’utr](用ncoi和saci限制酶消化驗(yàn)證)。然后將含有所述盒的noti-noti片段克隆到雙元載體pdab3038的noti位點(diǎn)中。對(duì)所得的雙元載體pdab4114進(jìn)行限制性消化(用saci)以驗(yàn)證正確的方向，所述載體含有下面的盒[atubi10啟動(dòng)子:aad-13(v1):atuorf13’utr:csvmv啟動(dòng)子:pat:orf25/263’utr]。所驗(yàn)證的完成的構(gòu)建體(pdab4114)用于轉(zhuǎn)化到農(nóng)桿菌中(見實(shí)施例6)。實(shí)施例4-重組aad-13在熒光假單胞菌中的表達(dá)和純化4.1-熒光假單胞菌發(fā)酵對(duì)于搖瓶實(shí)驗(yàn)，將200μl攜帶aad-13(v1)構(gòu)建體(3.2節(jié))的熒光假單胞菌菌株甘油保藏物接種到50ml添加了30μg/ml四環(huán)素/hcl的新鮮lb培養(yǎng)基中。將培養(yǎng)物(在250ml擋板錐形瓶中)置于振蕩器(newbrunswickscientificmodelinnova44)上，將在300rpm和30℃培養(yǎng)16小時(shí)。20ml種子培養(yǎng)物將被轉(zhuǎn)移進(jìn)2.8l擋板錐形瓶中1l添加了20μg/ml四環(huán)素/hcl和250μlpluronicl61(抗發(fā)泡)的熒光假單胞菌培養(yǎng)基(酵母膏,5g/l；k2hpo4,5g/l；(nh4)2po4,7.5g/l；(nh4)2so4；mgso4-7h2o,1g/l；kcl,0.5g/l；cacl2-2h2o,0.5g/l；二水合檸檬酸鈉,15g/l；甘油,95g/l；微量元素溶液,10ml/l；微量元素溶液：fecl3-6h2o,5.4g/l；mncl2-4h2o,1g/l；znso4-7h2o,1.45g/l；cuso4-5h2o,0.25g/l；h3bo3,0.1g/l；(nh4)6mo7o24,0.1g/l；濃鹽酸,13ml/l)中。培養(yǎng)物將在30℃和300rpm培養(yǎng)24小時(shí)。在培養(yǎng)物中將加入終濃度為1mm的異丙基-β-d-1-硫代吡喃半乳糖苷(iptg)，在25℃繼續(xù)培養(yǎng)約48小時(shí)。4℃,7krpm離心15分鐘收集細(xì)胞，細(xì)胞糊置于-80℃保存或立即進(jìn)行純化。對(duì)于發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，1ml每種甘油保藏物將接種到含有添加了30μg/ml四環(huán)素/hcl的200mllb培養(yǎng)基的1l擋板燒瓶中，300rpm和32℃培養(yǎng)16-24小時(shí)。然后將來自三個(gè)燒瓶的混合培養(yǎng)物(600ml)無(wú)菌轉(zhuǎn)入含有10l用于支持高細(xì)胞密度生長(zhǎng)的dowproprietary已知成分培養(yǎng)基(來自teknova,hollister,ca)的20l發(fā)酵罐(b.braunbioreactorsystems)中。生長(zhǎng)溫度維持在32℃，并通過加入氨水將ph控制在所需的設(shè)定點(diǎn)。通過調(diào)節(jié)噴射氣流和攪拌速率將液體培養(yǎng)物中的溶解氧維持在正水平。分批補(bǔ)料發(fā)酵過程進(jìn)行大約24小時(shí)至細(xì)胞密度達(dá)到170-200od575。加入1mm的iptg誘導(dǎo)重組蛋白質(zhì)的表達(dá)，使用循環(huán)的冷水供給降低溫度并維持在25℃。使發(fā)酵的誘導(dǎo)期再持續(xù)24小時(shí)。收集樣品(30ml)進(jìn)行多種分析，以檢測(cè)在誘導(dǎo)后6、12和18小時(shí)時(shí)間點(diǎn)的細(xì)胞密度和蛋白質(zhì)表達(dá)水平。發(fā)酵過程的最后，10krpm離心30分鐘收集細(xì)胞。細(xì)胞沉淀凍存于-80℃用于進(jìn)一步的處理。4.2-純化aad-13用于生物化學(xué)表征和抗體產(chǎn)生融化大約100-200g冷凍(或新鮮)的假單胞菌細(xì)胞并重懸于1-2l含有20mmtris-hcl,ph8.5和25ml蛋白酶抑制劑混合物(sigmacat#p8465)的抽提緩沖液中。在冰上使用微射流儀(型號(hào)m110l或110y)(microfluidics,newton,ma)以11,000-12,000psi一次性通過來裂解細(xì)胞。將裂解物24,000rpm離心20分鐘。將轉(zhuǎn)移上清并在4℃用10倍體積的20mmtris-hcl,ph8.5過夜透析，或在使用層析柱分離之前用這種緩沖液滲濾并經(jīng)0.45μm的膜過濾。使用法瑪西亞(pharmacia)aktaexplorer100進(jìn)行隨后所有蛋白質(zhì)的分離且在4℃操作。在上柱之前，用20mmtris-hcl,ph8.5的緩沖液平衡qsepharosefastflow層析柱(pharmaciaxk50/00,柱床體積500ml)。樣品以15ml/min加到層析柱上，然后用這種緩沖液洗滌直到洗脫液的od280回到基線。用2l0到0.3m的線性梯度nacl以15ml/min的流速洗脫蛋白質(zhì)，同時(shí)收集45ml級(jí)分。合并用比色酶檢測(cè)法確定為含aad-13活性的級(jí)分，以及和預(yù)知的aad-13蛋白分子量(在sds-page上大約32kda的條帶)對(duì)應(yīng)的級(jí)分。在樣品中加入終濃度為0.5m的固體硫酸銨，然后施加于在0.5m硫酸銨(溶于20mmtris-hcl,ph8.0)中平衡的phenylhp層析柱(pharmaciaxk50/20,柱床體積250ml)。該層析柱用10ml/min的結(jié)合緩沖液洗滌，直到洗脫液的od280回到基線，蛋白質(zhì)用2倍柱體積0.5m到0的線性梯度硫酸銨(溶于20mmtris-hcl,ph8.0)以10ml/min洗脫，收集12.5ml的級(jí)分。將合并含有aad-13的主峰級(jí)分，如果必要的話，使用mwco10kda截留膜離心過濾裝置(millipore)濃縮。在一些情況下，樣品還用pbs緩沖液以1ml/min的流速施加于superdex75gelfiltration層析柱(pharmaciaxk16/60,柱床體積110ml)。合并含有純aad-13的峰級(jí)分并儲(chǔ)存在-80℃?zhèn)溆?。?shí)施例5-體外測(cè)定aad-13活性5.1-通過比色酚檢測(cè)測(cè)定。將通過產(chǎn)物酚的比色檢測(cè)測(cè)量酶活性，其中使用由fukumori和hausinger(1993)(j.biol.chem.268:24311-24317)的改良方案以允許使用96孔微孔板形式的方案。已有描述將比色測(cè)定用于測(cè)量雙加氧酶的活性，其裂解2,4-滴和2,4-滴丙酸以釋放產(chǎn)物2,4-二氯苯酚。使用前述檢測(cè)方法將來自若干酚的顏色與2,4-二氯苯酚的進(jìn)行比較，以確定哪種酚產(chǎn)物便于檢測(cè)。在含有200μmnh4(feso4)2、200μm抗壞血酸鈉的0.15ml20mmmopsph6.75中以100μm終濃度檢測(cè)酚和酚類似物。來自氟草煙和綠草定的吡啶酚未產(chǎn)生明顯的顏色。在高至約500μm的測(cè)定中，2,4-二氯苯酚的顏色產(chǎn)生是線性的，并與酚濃度成正比。在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件(160μl終測(cè)定體積)下得到的校正曲線表明從17.2μm酚可得到510nm處0.1的吸收。在含有200μmnh4feso4、200μm抗壞血酸鈉、1mmα-酮戊二酸、適當(dāng)?shù)孜?以dmso中制備的100mm原液加入)和酶的總體積0.16ml的20mmmopsph6.75中進(jìn)行酶測(cè)定。在零時(shí)間點(diǎn)加入芳氧基鏈烷酸酯底物、酶或α-酮戊二酸起始反應(yīng)。在25℃孵育5分鐘后，通過加入30μl1:1:1混合的50mmnaedta、ph10緩沖液(3.09g硼酸+3.73gkcl+44ml1nkoh)和0.2％4-氨基安替比林終止反應(yīng)。再加入10μl0.8％鐵氰化鉀。5或10分鐘之后，在分光光度微孔板讀數(shù)器中記錄510nm處的吸收?？瞻缀谐敢酝獾乃性噭越忉尩孜锉簧倭糠釉斐傻呐既坏妮p微污染。5.2-通過氯吡啶酚檢測(cè)測(cè)定aad-13作用于潛在的底物如包含取代吡啶(而非苯環(huán))的除草劑綠草定，在斷裂芳氧基鏈烷酸酯鍵時(shí)，將釋放吡啶酚。使用前面章節(jié)中所述的氨基安替吡啉/鐵氰化苯酚測(cè)定法不能檢測(cè)吡啶酚。然而，發(fā)現(xiàn)產(chǎn)物氯吡啶酚在近uv處有強(qiáng)吸收，其中λmax出現(xiàn)在ph7325nm處(消光系數(shù)～8,400m-1.cm-1)。這用于創(chuàng)建連續(xù)的基于微孔板的分光光度檢測(cè)法。在總體積為0.2ml，ph6.75的20mmmops中進(jìn)行測(cè)定，其中含200μmnh4feso4、200μm抗壞血酸鈉、1mmα-酮戊二酸、適當(dāng)?shù)牡孜?加入配制在dmso中的100mm的貯液)和酶。在零時(shí)間點(diǎn)通過加入芳氧基鏈烷酸酯底物、酶或α-酮戊二酸起始測(cè)定，并在酶標(biāo)儀中對(duì)325nm處吸光度的增加進(jìn)行10分鐘的跟蹤檢測(cè)。反應(yīng)最初2分鐘將用于確定初始速率。5.3-使用2-(2-氯,4-硝基苯氧基)丙酸酯的比色測(cè)定法使用2-(2-氯,4-硝基苯氧基)丙酸酯(cnpp)作為底物，發(fā)明了方便的aad-13測(cè)定法。aad-13斷裂將cnpp釋放2-氯,4-硝基苯酚。苯酚在ph7、410nm處有亮黃吸收，使反應(yīng)隨后能進(jìn)行連續(xù)或終點(diǎn)分析。不需要加入另外的試劑，能可視監(jiān)測(cè)aad-13活性的存在。在總體積為0.2ml，ph6.75的20mmmops中進(jìn)行基于微孔板的分光光度測(cè)定，其中含200μmnh4feso4、200μm抗壞血酸鈉、1mmα-酮戊二酸、適量的cnpp(加入配制在dmso中的10mm貯液)和酶。在零時(shí)間點(diǎn)通過加入cnpp、酶或α-酮戊二酸起始測(cè)定，并在酶標(biāo)儀中對(duì)410nm處吸光度的增加進(jìn)行10分鐘的跟蹤檢測(cè)。反應(yīng)最初2分鐘將用于確定初始速率。在標(biāo)準(zhǔn)測(cè)定條件下(200μl最終測(cè)定體積)進(jìn)行的校正曲線表明從25.1μm2-氯,4-硝基苯酚獲得410nm處的吸光度為0.1。使用這種測(cè)定法，確定cnpp作為底物的動(dòng)力學(xué)常數(shù)是km＝31±5.5μm，而kcat＝16.2±0.79min-1。5.4–偶聯(lián)的測(cè)定法為了測(cè)試寬范圍的底物，使用基于luoet.al.(2006)(anal.biochem.353:69-74)的方法的方案，通過分光光度法檢測(cè)從α-酮戊二酸分解產(chǎn)生琥珀酸。如圖3中所述，通過aad-13對(duì)α-酮戊二酸和目的底物的同時(shí)分解，導(dǎo)致產(chǎn)生琥珀酸。琥珀酸被琥珀酰輔酶a合成酶進(jìn)一步修飾成琥珀酰輔酶a，該酶消耗atp并產(chǎn)生adp。atp然后被常用的琥珀酸激酶/乳酸脫氫酶酶促偶聯(lián)系統(tǒng)(sigmap0294)消耗。通過分光光度法在340nm處監(jiān)測(cè)所導(dǎo)致的nadh向nad的轉(zhuǎn)化。5.4.1–his-標(biāo)記的琥珀酰輔酶a合成酶和aad-13(v2)的克隆和表達(dá)從invitrogen的大腸桿菌的top10菌株作為單個(gè)擴(kuò)增子擴(kuò)增出編碼合成酶succ和sucd的兩種大腸桿菌基因。通過煮沸細(xì)胞的等分試樣10分鐘，然后離心，并保留含有dna的上清液，得到基因組dna。使用以前產(chǎn)生的pet克隆pdab4115作為aad-13(v2)的模板。為了擴(kuò)增succd基因，使用下面的引物：suc-nde(seqid9)5’catatgaacttacatgaatatcaggcaaaac3’和suc-xho(seqid10)5’ctcgagtttcagaacagttttcagtgcttc3’。對(duì)于aad-13(v2)，使用下面的引物：aad-13f(seqid11)5’catatggcgagcccggcg3’和aad-13r(seqid12)5’ctcgaggtgtgccagtgcggtctc3’。這些加入了用于下游克隆的合適的限制酶位點(diǎn)并除去了終止密碼子以允許his標(biāo)記。對(duì)于該反應(yīng)，熱循環(huán)儀條件為：96℃2min,然后35個(gè)循環(huán)的:96℃30sec,53℃30sec,72℃1.5min,接著是最后一個(gè)循環(huán)72℃5min。將所得的擴(kuò)增子亞克隆以驗(yàn)證正確序列。將每個(gè)含有正確插入片段的克隆用nde1/xho1消化并將插入片段克隆到pet-26b(+)表達(dá)載體中。為了表達(dá)，將經(jīng)轉(zhuǎn)化的bl-21大腸桿菌菌苔刮入到50mllb+kan(50μg/ml)中并在37℃生長(zhǎng)2小時(shí)。將2毫升該培養(yǎng)基轉(zhuǎn)移到100mllb+kan中。這些培養(yǎng)瓶在37℃培養(yǎng)4小時(shí)。細(xì)胞用50μmiptg誘導(dǎo)，在25℃過夜生長(zhǎng)。離心培養(yǎng)物，并將細(xì)胞沉淀用于蛋白質(zhì)純化。5.4.2–純化aad-13和his標(biāo)記的琥珀酰輔酶a合成酶用于體外底物鑒定用金屬親和層析方案，基于柱生產(chǎn)商的指導(dǎo)純化his標(biāo)記的aad-13。將從1l培養(yǎng)物收獲并在-80℃保存的細(xì)胞沉淀解凍并重懸浮在20ml提取緩沖液(100mmtris-hcl,ph8；200-300μl蛋白酶抑制劑混合物(sigmap8849),1mg/ml溶菌酶,和1mmmgcl2)中。重懸浮的細(xì)胞在室溫培養(yǎng)10-15min后用dna酶處理以降低粘度。在4℃進(jìn)行所有的隨后步驟。將提取物以20,000xg離心20分鐘進(jìn)行澄清。使用1ml/min的流速，將所得的上清液加到事先用緩沖液a(25mmtrisph8.0,0.5mnacl)平衡的2個(gè)連續(xù)的1mlco-mactmcartridges(emd/novagen71650)中。裝載提取物后，用緩沖液a中的5mm咪唑洗滌柱子直到od280返回到基線。用緩沖液a中的50mm咪唑洗脫蛋白質(zhì)。使用bg-10脫鹽柱(bio-rad)，將如通過在sds-page上約30kda帶指示的主要含有aad-13的級(jí)分交換到緩沖液c(20mmtrisph8.0,100mmnacl,2mmdtt)中。然后根據(jù)體外偶聯(lián)測(cè)定法通過分光光度法測(cè)定緩沖液c中的aad-13。利用連續(xù)1mlco-mactmcartridges(emd/novagen71650)和基于生產(chǎn)商的指導(dǎo)的方案純化his標(biāo)記的琥珀酰輔酶a合成酶。將在-80℃保存的細(xì)胞沉淀解凍并重懸浮在50ml提取緩沖液(100mmtrisph7.2,200-300μl蛋白酶抑制劑混合物(sigmap8849),1mg/ml溶菌酶,和1mmmgcl2)/l細(xì)胞培養(yǎng)物。重懸浮的細(xì)胞在室溫培育10－15分鐘后用dna酶處理以降低粘度。除非另外指出，所有的隨后步驟都在4℃進(jìn)行。將提取物以20,000xg離心20分鐘進(jìn)行澄清。在此時(shí)，可以將上清液直接加到用結(jié)合緩沖液(0.5mnacl,20mmtris-hclph7.9和5mm咪唑)預(yù)先平衡的co-mactmcartridges或者置于80％硫酸銨中。然后將硫酸銨處理的樣品在20,000xg下離心20分鐘以沉淀蛋白質(zhì)。將沉淀物重懸浮在緩沖液a(20mmtris-hclph8.0和0.5mnacl)中并使用以緩沖液a預(yù)平衡的bg-10脫鹽柱(bio-rad)除去殘留的硫酸銨。所得的樣品加到用結(jié)合緩沖液預(yù)平衡的co-mactmcartridges，流速為1ml/min。加入提取的蛋白質(zhì)后，用10個(gè)柱體積的0.5％緩沖液b(20mmtris-hcl,0.5mnacl,和1m咪唑)沖洗柱子。接著是5個(gè)柱體積的6％緩沖液b的不連續(xù)梯度和額外10個(gè)柱體積的50％緩沖液b的不連續(xù)梯度。用6％緩沖液b梯度洗脫多數(shù)希望的蛋白質(zhì)。通過sdspage檢測(cè)到對(duì)應(yīng)于琥珀酰輔酶a合成酶亞基(～40&33kda)的兩條帶來鑒定含有琥珀酰輔酶a合酶的級(jí)分，并檢測(cè)對(duì)應(yīng)的體外活性。使用下面的體外偶聯(lián)測(cè)定法的修改版本證實(shí)琥珀酰輔酶a合成酶活性。簡(jiǎn)言之，在100mmtrisph8.0,1mmpep0.4mmnadh10mmmgcl2,0.2mmcoa,0.2mmatp,3.5u/mlpk,5u/mlldh,和scs存在下，通過分光光度法在340nm處監(jiān)測(cè)反應(yīng)進(jìn)展。通過加入1mm琥珀酸啟動(dòng)反應(yīng)。5.4.3-體外偶聯(lián)測(cè)定法在體外aad-13(v2)底物的鑒定是基于在96孔微量滴定板中0.2ml反應(yīng)體積的連續(xù)分光光度監(jiān)測(cè)期間檢測(cè)到的酶促活性。反應(yīng)條件如下：100mmmopsph7.0,0.4mmnadh,0.4mmatp,0.4mmcoa,1mmpep,10mmmgcl2,0.1mmfeso4(hcl中溶解),和0.1mm抗壞血酸鹽,1mmα-酮戊二酸和足夠的aad-13(v2)以在2,4-滴存在下產(chǎn)生可觀察到的速率。分批調(diào)節(jié)偶聯(lián)酶(scs/pk/ldh)以確保足夠偶聯(lián)，一般在1mm下測(cè)定潛在底物。如需要進(jìn)行底物濃度的改變以進(jìn)行溶解度調(diào)節(jié)。通過加入aad-13(v2)或潛在的底物啟動(dòng)反應(yīng)。在上面的測(cè)定條件下監(jiān)測(cè)aad將-酮戊二酸向琥珀酸轉(zhuǎn)化的底物獨(dú)立轉(zhuǎn)化速率并從所觀察到的反應(yīng)速率扣除。將用丙酸底物觀察到的反應(yīng)速率除以2以對(duì)通過aad對(duì)這些化合物的切割得到的丙酮酸的產(chǎn)生進(jìn)行調(diào)節(jié)。此外，通過分光光度法監(jiān)測(cè)在化合物和pk/ldh存在下nadh的消耗來檢查丙酸化合物的丙酮酸污染。5.4.4體外篩選結(jié)果表ex5顯示了通過體外偶聯(lián)測(cè)定法用多種化學(xué)方法觀察到的aad-13(v2)反應(yīng)速率。反應(yīng)速率以相同的樣品組中得到的2,4-滴反應(yīng)速率的百分比報(bào)告。該數(shù)據(jù)用于從非底物定性分離底物，以及鑒定底物效率趨勢(shì)。應(yīng)注意到取決于消耗的可用底物的百分比，較快的速率更難以準(zhǔn)確比較。對(duì)于丙酸鹽化合物尤其是這樣，對(duì)于相等數(shù)目的酶轉(zhuǎn)化，丙酸鹽化合物顯示出非丙酸鹽化合物速率的兩倍。結(jié)果，當(dāng)與低效率底物比較時(shí)，高效的底物將被正確分組。然而，在高效底物分組內(nèi)，通過使用底物和aad的單一速率篩選，不能定性分離化合物。由于較高濃度下的吸光度干擾，在0.5mm而不是1mm下測(cè)試以星號(hào)表示的化合物。表ex5aad-13不像其他報(bào)導(dǎo)的具有2,4-滴降解活性的依賴a-酮戊二酸的加雙氧酶。關(guān)鍵的不同是多種芳氧基和烷氧基－鏈烷酸底物，許多吡啶氧基取代基是有效的除草劑和底物(例如，氟草煙)，但是其他除草劑像定草酯是差得多的底物。這產(chǎn)生了使用備選除草劑控制使用aad-13底物的轉(zhuǎn)基因植物的新的機(jī)會(huì)。還提供了在植物中互補(bǔ)相似的基因以擴(kuò)寬耐受性或者增加植物耐受的底物的寬度。實(shí)施例6－轉(zhuǎn)化進(jìn)擬南芥并選擇6.1-擬南芥培養(yǎng)條件將野生型擬南芥種子懸于0.1％瓊脂糖(希格瑪化學(xué)公司，sigmachemicalco.,st.louis,mo)溶液中。將懸浮的種子在4℃保存2天以完成對(duì)休眠的需要并保證種子同步萌發(fā)(層積)。用細(xì)蛭石覆蓋sunshinemixlp5(sungrohorticulture公司,bellevue,wa)并用hoagland溶液地下灌溉至濕潤(rùn)。使土壤混合物排水24小時(shí)。將層積的種子種在蛭石上并用保濕罩(kordproducts公司,bramalea,ontario,canada)覆蓋7天。使種子萌發(fā)并在恒溫(22℃)恒濕(40-50％)光強(qiáng)度為120-150μmol/m2秒的長(zhǎng)日照條件(16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗)下在conviron(型號(hào)cmp4030和cmp3244,controlledenvironmentslimited公司,winnipeg,manitoba,canada)中培養(yǎng)植物。開始用hoagland溶液灌溉植物，接著用去離子水灌溉，保持土壤潮濕但不濕透。6.2-農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化帶有劃線接種的dh5α菌落的含紅霉素(希格瑪化學(xué)公司，sigmachemicalco.,st.louis,mo)(200mg/l)或壯觀霉素(100mg/l)的lb+瓊脂平板用于提供菌落，接種到4ml小量制備培養(yǎng)物(液體lb+紅霉素)中。將培養(yǎng)物在37℃持續(xù)搖動(dòng)孵育過夜。按照生產(chǎn)商的說明使用qiagen(valencia,ca)旋轉(zhuǎn)小量制備試劑盒(spinminipreps)純化質(zhì)粒dna。使用來自weigel和glazebrook(2002)的方案制備電感受態(tài)的根癌農(nóng)桿菌(菌株z707、eha101和lba4404)細(xì)胞。使用修改自weigel和glazebrook(2002)的電穿孔方法轉(zhuǎn)化感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞。在冰上融化50μl感受態(tài)農(nóng)桿菌細(xì)胞并在細(xì)胞中加入10-25ng所需的質(zhì)粒。將dna和細(xì)胞混合物加入預(yù)冷的電穿孔杯(2mm)中。用以下條件使用eppendorf電穿孔儀2510進(jìn)行轉(zhuǎn)化：電壓：2.4kv，脈沖長(zhǎng)度：5毫秒。電穿孔后，向杯中加入1mlyep培養(yǎng)液(每升:10g酵母膏、10gbacto蛋白胨、5gnacl)并將細(xì)胞－yep懸液轉(zhuǎn)移到15ml培養(yǎng)管中。將細(xì)胞在水浴中持續(xù)搖動(dòng)以28℃孵育4小時(shí)。孵育后，將培養(yǎng)物涂到含紅霉素(200mg/l)或壯觀霉素(100mg/l)和鏈霉素(希格瑪化學(xué)公司，sigmachemicalco.,st.louis,mo)(250mg/l)的yep+瓊脂板上。28℃孵育平板2－4天。選取菌落并劃線接種到含紅霉素(200mg/l)或壯觀霉素(100mg/l)和鏈霉素(250mg/l)的新鮮yep+瓊脂平板上，在28℃孵育1－3天。選取菌落使用載體特異性引物進(jìn)行pcr分析，以確認(rèn)基因插入片段的存在。按照生產(chǎn)商的說明使用qiagenspinminiprep從選取的農(nóng)桿菌菌落純化質(zhì)粒dna，例外是另將15ml過夜小量制備培養(yǎng)物(液體yep+紅霉素(200mg/l)或壯觀霉素(100mg/l)和鏈霉素(250mg/l))的4ml等分式樣用于dna純化。使用qiagenspinminiprepdna的替代是裂解轉(zhuǎn)化的農(nóng)桿菌細(xì)胞，在100℃于10μl水中懸浮5分鐘。來自農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化中使用的二元載體的質(zhì)粒dna納入作為對(duì)照。以0.5×的濃度按照生產(chǎn)商的說明使用takaramirusbioinc.(madison,wisconsin)的taqdna聚合酶完成pcr反應(yīng)。按以下條件設(shè)置程序在mjresearchpeltier熱循環(huán)儀中進(jìn)行pcr反應(yīng)：1)94℃3分鐘，2)94℃45秒，3)55℃30秒，4)72℃1分鐘，共29個(gè)循環(huán)，其后是72℃10分鐘的一個(gè)循環(huán)。循環(huán)后將反應(yīng)物保持在4℃。通過1％瓊脂糖凝膠電泳分析擴(kuò)增產(chǎn)物，并通過溴化乙錠染色顯像。選擇了其pcr產(chǎn)物與質(zhì)粒對(duì)照相同的菌落。6.3-擬南芥轉(zhuǎn)化。使用花浸泡法轉(zhuǎn)化擬南芥。用選取的菌落接種一份或多份15－30ml含紅霉素(200mg/l)或壯觀霉素(100mg/l)和鏈霉素(250mg/l)的yep培養(yǎng)液的預(yù)培養(yǎng)物。以220rpm將培養(yǎng)物在28℃恒速搖動(dòng)孵育過夜。每個(gè)預(yù)培養(yǎng)物用于接種兩份500ml含紅霉素(200mg/l)或壯觀霉素(100mg/l)和鏈霉素(250mg/l)的yep培養(yǎng)液的培養(yǎng)物并將培養(yǎng)物在28℃持續(xù)搖動(dòng)孵育過夜。室溫以約8700×g離心10分鐘沉淀細(xì)胞，棄去得到的上清液。將細(xì)胞沉淀輕柔重懸于500ml滲透培養(yǎng)基中，所述滲透培養(yǎng)基含有1/2×murashige和skoog鹽/gamborgb5維生素、10％(重量/體積)蔗糖、0.044μm芐氨基嘌呤(10μl/升(1mg/mldmso中的原液)和300μl/升silwetl-77。將約1月齡的植物在培養(yǎng)基中浸泡15秒，確保浸沒最新的花序。接著將植物側(cè)面放倒并覆蓋(透明或不透明)24小時(shí)，接著用水洗滌并豎直放置。在22℃以16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期培養(yǎng)植物。浸泡約4周后收獲種子。6.4-轉(zhuǎn)化植物的選擇將新收獲的[(aad-13(v1)基因]t1種子在室溫干燥7天。將種子種在26.5×51cm萌發(fā)盤(t.o.plasticsinc.有限公司,clearwater,mn)中，每盤接受200mg等分式樣的層積t1種子(～10,000個(gè)種子)，所述種子事先已懸于40ml0.1％瓊脂糖溶液并在4℃保存2天以完成休眠需要并保證同步的種子萌發(fā)。用蛭石覆蓋sunshinemixlp5(sungrohorticultureinc.有限公司,bellevue,wa)并用hagland溶液地下灌溉至濕透，利用重力排水。用移液管將層積種子的每個(gè)40ml等分式樣均勻地種到蛭石上，并用保濕罩(kordproducts,bramalea,ontario,canada)覆蓋4－5天。在使用出苗后噴灑草銨膦(選擇共轉(zhuǎn)化的pat基因)進(jìn)行最初轉(zhuǎn)化體選擇前1天移去罩。在7個(gè)種植后天數(shù)(dap)并于11dap再次使用devilbiss壓縮空氣噴嘴以10ml/盤(703l/ha)的噴灑體積用liberty除草劑(200gai/l的草銨膦,拜耳作物科學(xué)集團(tuán)(bayercropsciences),kansascity,mo)的0.2％溶液噴灑t1植物(分別為子葉期和2－4葉期)，以提供每次應(yīng)用280gai/ha有效量的草銨膦。在最后噴灑后4－7天鑒定存活株(活躍生長(zhǎng)的植物)，并分別移植到用盆栽基質(zhì)(metromix360)制備的3英寸盆中。用保濕罩覆蓋移植的植物3－4天，并如前置于22℃培養(yǎng)室中或直接移入溫室。接著移去罩并在測(cè)試aad-13(v1)提供苯氧基生長(zhǎng)素除草劑抗性的能力之前至少1天將植物栽種到溫室(22±5℃,50±30％rh,14小時(shí)光照:10小時(shí)黑暗,最小500μe/m2s1天然+補(bǔ)充光)。然后將t1植物隨機(jī)分配到多個(gè)用量的2,4-滴。對(duì)于擬南芥，50gae/ha2,4-滴是將敏感植物與具有平均抗性水平的植物區(qū)分開的有效劑量。還使用提高的用量(280、560、1120或2240gae/ha)確定抗性的相對(duì)水平。表11和12顯示與先前在pct/us2006/042133中描述的芳氧基鏈烷酸酯除草劑抗性基因(aad-12(v1))的比較。如上述使用devilbiss噴霧器實(shí)現(xiàn)所有的生長(zhǎng)素除草劑應(yīng)用，以應(yīng)用703l/ha的噴灑體積(0.4ml溶液/3英寸盆)，或者通過履帶式噴霧機(jī)以187l/ha的噴灑體積應(yīng)用。使用的2,4-滴為溶于dmso并稀釋于水中(<1％dmso終濃度)的工業(yè)級(jí)(希格瑪sigma,st.louis,mo)或?yàn)樯逃枚装符}制劑(456gae/l,nufarm,stjoseph,mo)。使用的2,4-滴丙酸是商業(yè)級(jí)制備成r-2,4-滴丙酸鉀鹽(600gai/l,ahmarks)。隨著除草劑的量提高到超過800gae/ha，噴灑溶液的ph變的極度酸性，燒傷擬南芥植物的幼小嫩葉，并使評(píng)估除草劑的首效變得復(fù)雜。使一些t1個(gè)體接受代替苯氧基生長(zhǎng)素的備選商品除草劑。一個(gè)興趣點(diǎn)是測(cè)定吡啶氧乙酸生長(zhǎng)素除草劑、綠草定和氟草煙在植物中是否可被有效降解。使用履帶式噴霧機(jī)以187l/ha的噴灑體積對(duì)t1植物應(yīng)用除草劑。對(duì)2,4-滴二甲胺鹽表現(xiàn)出耐性的t1植物可進(jìn)一步在t2代使用。6.5-轉(zhuǎn)化植物的選擇結(jié)果用aad-13(v1)(植物優(yōu)化基因)進(jìn)行首次擬南芥轉(zhuǎn)化。首先使用草銨膦選擇方案從未轉(zhuǎn)化種子背景中選擇t1轉(zhuǎn)化體。篩選了超過160,000個(gè)t1種子并鑒定了238個(gè)草銨膦抗性植物(pat基因)，等于0.15％的轉(zhuǎn)化/選擇頻率，該轉(zhuǎn)化頻率處于構(gòu)建體選擇頻率的正常范圍內(nèi)，其中pat+liberty用于選擇。其后將上述選擇的t1植物移植到單個(gè)盆中并用多個(gè)用量的商品芳氧基鏈烷酸酯除草劑噴灑。表11比較了aad-13(v1)和對(duì)照基因賦予擬南芥t1轉(zhuǎn)化體2,4-滴抗性的應(yīng)答。以目測(cè)損傷百分比2wat顯示應(yīng)答。以表現(xiàn)小或無(wú)損傷(<20％)、中度損傷(20-40％)或嚴(yán)重?fù)p傷(>40％)的個(gè)體的直方圖顯示數(shù)據(jù)。顯示了每種處理的算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。還在最后一列標(biāo)出了每一用量和轉(zhuǎn)化的個(gè)體應(yīng)答的范圍。轉(zhuǎn)化pat/crylf的擬南芥用作為生長(zhǎng)素敏感型轉(zhuǎn)化對(duì)照。aad-13(v1)基因賦予個(gè)體擬南芥植物除草劑抗性。在給定的處理內(nèi)，植物應(yīng)答的水平變化顯著，這可能是由于每個(gè)植物代表獨(dú)立的轉(zhuǎn)化事件的事實(shí)。特別需要注意在測(cè)試的每個(gè)2,4-滴用量中都存在未受影響的個(gè)體，而另一些則受到嚴(yán)重的影響?？傮w種群平均損傷率示于表11，僅證明轉(zhuǎn)化aad-13(v1)與aad-12(v1)或轉(zhuǎn)化pat/crylf的對(duì)照之間的顯著差異。高用量下，如果不進(jìn)行緩沖則噴灑溶液變成高酸性，因此，一些損傷可以歸因于噴霧溶液的酸性。主要在生長(zhǎng)室中培養(yǎng)的擬南芥角質(zhì)層很薄，嚴(yán)重的燒傷效應(yīng)會(huì)使這些提高劑量下的測(cè)試復(fù)雜化。盡管如此，仍有一些個(gè)體在2,240gae/ha2,4-滴的情況下小損傷或無(wú)損傷的存活下來。表12顯示t1擬南芥對(duì)苯氧丙酸、2,4-滴丙酸類似的劑量應(yīng)答。數(shù)據(jù)顯示除草劑活性的2,4-滴丙酸(r-)同分異構(gòu)體不能作為aad-13(v1)或aad-12(v1)的合適的底物。事實(shí)上aad-1(v3)將代謝r-2,4-滴丙酸足以賦予商業(yè)上可接受的耐性，這是區(qū)分三種基因一個(gè)顯著特征(表12和pct/us2006/042133(wrightetal.,2006年10月27日申請(qǐng))的實(shí)施例7)。認(rèn)為aad-1和aad-13分別是r-和s-特異性的α-酮戊二酸雙加氧酶。6.6–aad-13(v1)作為選擇標(biāo)記將用如上述轉(zhuǎn)化的擬南芥分析使用aad-13(v1)作為選擇標(biāo)記的能力，其中使用2,4-滴作為選擇劑。將大約50顆t4代擬南芥種子(aad-13(v1)純合)摻入大約5000顆野生型(敏感)種子。將比較一些處理，每盤植物將按以下處理方案中的一種接受一次或兩次應(yīng)用2,4-滴的時(shí)間：7dap、11dap或7dap之后11dap再次應(yīng)用。由于所有個(gè)體在同一轉(zhuǎn)化載體中也含有pat基因，用2,4-滴選擇的aad-13能直接與用草銨膦選擇的pat進(jìn)行比較。將如前面所述用devilbiss噴嘴實(shí)施處理。在17dap鑒定植物為抗性或敏感。最佳處理是在種植后7和11天(dap)運(yùn)用2,4-滴(75gae/ha)，在選擇頻率上同等有效，并導(dǎo)致對(duì)轉(zhuǎn)化個(gè)體的除草劑損傷比liberty選擇方案小。這些結(jié)果將表明對(duì)于轉(zhuǎn)化的擬南芥群，aad-13(v1)能有效作為替代的選擇標(biāo)記使用。6.7–遺傳力。使多個(gè)t1事件自花授粉產(chǎn)生t2種子。通過對(duì)100株隨機(jī)t2同胞應(yīng)用liberty(280gae/ha)對(duì)這些種子進(jìn)行子代測(cè)試。在噴灑應(yīng)用(187l/ha的應(yīng)用量的履帶式噴霧機(jī))之前，先將每個(gè)t2個(gè)體植物移植到7.5cm見方的盆中?？ǚ椒治?p>0.05)確定50％的t1家系(t2植物)以預(yù)期的孟德爾遺傳單基因座顯性遺傳的3抗性:1敏感模式分離。收集12到20個(gè)t2個(gè)體的種子(t3種子)。如前述對(duì)8個(gè)隨機(jī)選擇t2家系按每個(gè)家系25個(gè)t3同胞進(jìn)行子代測(cè)試。在每個(gè)株系中約半數(shù)的測(cè)試為純合的t2家系(未分離種群)。這些數(shù)據(jù)將顯示aad-13(v1)穩(wěn)定整合，且以孟德爾方式遺傳至少3代。6.8-aad-13擬南芥中其它除草劑抗性的葉敷應(yīng)用。通過葉敷應(yīng)用多種底物測(cè)定aad-13(v1)在轉(zhuǎn)基因擬南芥中提供對(duì)其他芳氧基鏈烷酸酯生長(zhǎng)素除草劑的抗性的能力。使t2代擬南芥種子層積并種到與擬南芥相似的選擇盤(實(shí)施例6.4)中。以類似的方式種植含有pat和昆蟲抗性基因cry1f的轉(zhuǎn)化對(duì)照株系。將苗轉(zhuǎn)移到溫室中單獨(dú)的3英寸盆中。以187l/ha用履帶式噴霧機(jī)對(duì)所有植物噴灑。對(duì)植物噴灑一系列吡啶氧乙酸類除草劑：200-800gae/ha綠草定(garlon3a,陶氏益農(nóng)，dowagrosciences)和200-800gae/ha氟草煙(starane,陶氏益農(nóng)，dowagrosciences)；以及由aad-13活性引起的2,4-滴代謝物2,4-二氯苯酚(dcp,希格瑪，sigma)(摩爾數(shù)等于280-2240gae/ha2,4-滴,將也測(cè)試工業(yè)級(jí))。所有的應(yīng)用配制到水中。每個(gè)處理重復(fù)3－4次。在處理后第3和第14天評(píng)估植物。aad-13-轉(zhuǎn)化的植物也清楚地受到保護(hù)而免于在轉(zhuǎn)化的對(duì)照株系pat/cry1f中看到的氟草煙除草劑損傷(見表13)；然而，aad-13-轉(zhuǎn)化的植物受到定草酯的嚴(yán)重?fù)p傷。這些結(jié)果證實(shí)擬南芥中的aad-13(v1)提供了對(duì)測(cè)試的吡啶氧基乙酸生長(zhǎng)素的耐受性。aad-13(v1)基因提供了高達(dá)400gae/ha氟草煙的強(qiáng)烈耐受性，而aad-12(v1)基因僅僅提供了低至200g/ha的中等水平耐受性。aad-13(v1)基因比aad-12(v1)基因提供了對(duì)定草酯顯著更低的耐受性。對(duì)氟草煙的顯著更高的耐受性是出乎意料的并且允許區(qū)分aad-13(v1)-型活性與aad-12(v1)并且得到實(shí)施例5的酶數(shù)據(jù)的支持。實(shí)施例7–額外作物種類的轉(zhuǎn)化通過利用以前在wo2007/053482(pct/us2006/042133(wrightetal.)的實(shí)施例#8中描述的相同技術(shù)，可以轉(zhuǎn)化玉米以提供對(duì)2,4-滴和氟草煙的高水平抗性。通過利用以前在wo2007/053482(pct/us2006/042133(wrightetal.))的實(shí)施例#11或?qū)嵤├?13中描述的相同技術(shù)，可以轉(zhuǎn)化大豆以提供對(duì)2,4-滴和氟草煙的高水平抗性。通過利用以前在專利申請(qǐng)pct/us2005/014737(wrightetal.,2005年5月2日申請(qǐng))的實(shí)施例#14或wo2007/053482(wrightetal.)的實(shí)施例#12中描述的相同技術(shù)，可以轉(zhuǎn)化棉花以提供對(duì)2,4-滴和氟草煙的高水平抗性。通過利用以前在專利申請(qǐng)pct/us2005/014737(wrightetal.,2005年5月2日申請(qǐng))的實(shí)施例#26或wo2007/053482(wrightetal.)的實(shí)施例#22中描述的相同技術(shù)，可以轉(zhuǎn)化蕓苔以提供對(duì)2,4-滴和氟草煙的高水平抗性。實(shí)施例8–通過抗體對(duì)來自轉(zhuǎn)化植物的蛋白質(zhì)檢測(cè)可以如wo2007/053482(wrightetal.)的實(shí)施例9所述的開發(fā)和實(shí)現(xiàn)抗體和隨后的elisa測(cè)定法。實(shí)施例9–煙草轉(zhuǎn)化通過與已發(fā)表的方法(horsch等,1988)類似但不完全相同的方法用根癌農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化煙草。為提供用于轉(zhuǎn)化的來源組織，將煙草種子(nicotianatabacum栽培種ky160)表面滅菌并種到tob培養(yǎng)基的表面上，tob培養(yǎng)基是用瓊脂固化的無(wú)激素murashige和skoog培養(yǎng)基(murashige和skoog,1962)。在有光照的培養(yǎng)室中在28-30℃培養(yǎng)植物6-8周，無(wú)菌收集葉用于轉(zhuǎn)化方案。從這些葉上無(wú)菌切下約1平方厘米不含中脈的塊。將在設(shè)置為250rpm振蕩器上，28℃瓶中培養(yǎng)過夜的農(nóng)桿菌菌株(含有pdab3278,akapdas1580,aad-13(v1)+pat的eha101s)培養(yǎng)物離心沉淀并重懸于無(wú)菌murashige&skoog鹽中，調(diào)整至600nm處的終光密度為0.5。將葉塊在此細(xì)菌懸液中浸泡約30秒，接著在無(wú)菌紙巾上蘸干，右側(cè)朝上放在tob+培養(yǎng)基(含有1mg/l吲哚乙酸和2.5mg/l芐基腺嘌呤的murashige和skoog培養(yǎng)基)上并在28℃在黑暗中孵育。兩天后將葉塊移至含有250mg/l頭孢噻肟(agri-bio,northmiami,florida)和5mg/l草銨膦(basta的活性成分，拜耳作物科學(xué)集團(tuán)(bayercropsciences))的tob+培養(yǎng)基并在28-30℃光照條件下孵育。前兩周每周兩次將葉塊轉(zhuǎn)移到含有頭孢噻肟和basta的新鮮tob+培養(yǎng)基，其后每周一次。用農(nóng)桿菌處理葉塊四到六周后，從此組織制備物中取出從轉(zhuǎn)化灶發(fā)出的小植物并種到phytatraytmii管(sigma)中含有250mg/l頭孢噻肟和10mg/lbasta的培養(yǎng)基tob中。在光照孵育室中培養(yǎng)這些小植株。3周后，進(jìn)行枝插并在相同的培養(yǎng)基中重新生根。再過2-3周后，植物即可移出至溫室。通過以下步驟將植物移至溫室中：從根上洗掉瓊脂，移植到13.75cm見方盆的土壤中，將盆放在袋子(scjohnson&son,inc.)中，在袋子的底部放入自來水并在30℃溫室中間接光照下放置一周。3-7天后，打開袋子，給植物施肥并使其在打開的袋子中生長(zhǎng)直至植物適應(yīng)溫室，此時(shí)去掉袋子。在普通溫暖溫室條件(30℃，16小時(shí)白天、8小時(shí)黑夜、最小自然光+補(bǔ)充光＝500μe/m2s1)下培養(yǎng)植物。繁殖前，對(duì)t0植物取樣用于dna分析以測(cè)定其插入物拷貝數(shù)。為方便起見，測(cè)定與aad-13(v1)分子連接的pat基因。將新鮮組織置于管中并在4℃凍干兩天。組織完全干燥后，將鎢珠(valenite)放入管中并使用kelco玻珠研磨機(jī)干磨樣品1分鐘。然后遵循標(biāo)準(zhǔn)dneasydna分離方法(qiagen,dneasy69109)。接著用picogreen(molecularprobesp7589)對(duì)提取的dna的等分試樣進(jìn)行染色，并與已知標(biāo)準(zhǔn)品一起在熒光計(jì)(biotek)中讀數(shù)，以得到以ng/μl計(jì)的濃度。將dna樣品稀釋到約9ng/μl，接著通過在熱循環(huán)儀中以95℃孵育10分鐘變性。然后使用提供的寡核苷酸混合物和mgcl2(thirdwavetechnologies)制備信號(hào)探針混合物。在侵入物測(cè)定板的每個(gè)孔中加入7.5μl的等分試樣，接著加入7.5μl對(duì)照、標(biāo)準(zhǔn)品和20ng/μl稀釋的未知樣品的等分試樣。用15μl礦物油(希格瑪，sigma)覆蓋每個(gè)孔。然后將平板在63℃孵育1.5小時(shí)并在熒光計(jì)(biotek)上讀數(shù)。計(jì)算的靶探針信號(hào)占背景的百分比除以內(nèi)參探針信號(hào)占背景的百分比得出比率。使用用southern印跡分析獲得和確認(rèn)的已知拷貝數(shù)標(biāo)準(zhǔn)品的比率來鑒定未知事件的估計(jì)拷貝數(shù)。還使用相同的提取的dna樣品通過pcr測(cè)定所有事件中aad-13(v1)基因的存在。使用總計(jì)100ng總dna作為模板。使用20mm的每種引物和takaraextaqpcr聚合酶試劑盒。用于植物轉(zhuǎn)錄單位(ptu)pcraad-13的引物為(sdpacodf:atggctcatgctgccctcagcc)(seqidno:6)和(sdpacodr:cgggcaggcctaactccaccaa)(seqidno:7)。在9700geneamp熱循環(huán)儀(appliedbiosystems)中進(jìn)行pcr反應(yīng)，將樣品置于94℃3分鐘，接著是94℃30秒、64℃30秒和72℃1分45秒的35個(gè)循環(huán)，接著是72℃10分鐘。在溴化乙錠染色的1％瓊脂糖凝膠上通過電泳分析pcr產(chǎn)物。9.1–轉(zhuǎn)化植物的選擇在溫室中適應(yīng)后，將t0植物以4倍增量隨機(jī)分配2,4-滴dma的從140到2240gae/ha的不同施用率。對(duì)于煙草，140gae/ha2,4-滴是區(qū)分敏感植物與具有有意義水平抗性的植物的有效劑量。表14顯示了用草銨膦除草劑抗性基因轉(zhuǎn)化的t0植物(pat/cry1f-轉(zhuǎn)化的煙草)的比較。數(shù)據(jù)表明aad-13(v1)當(dāng)在煙草植物中轉(zhuǎn)化時(shí)提供了對(duì)至少2240gae/ha的2,4-滴dma的強(qiáng)烈耐受性。保存了來自各t0轉(zhuǎn)化體的t1種子并將種子分層并像實(shí)施例5中一樣播種在溫室中的選擇盤中。在測(cè)試2,4-滴dma的升高比率之前，通過將2,4-滴dma(560gae/ha)應(yīng)用到100個(gè)隨機(jī)t1同胞，測(cè)試每個(gè)t1株系的后代。用校準(zhǔn)到187l/ha的應(yīng)用率的軌道噴霧器如以前所述的進(jìn)行噴霧應(yīng)用。如通過卡方分析，43％的t0家族(t1植物)以預(yù)期的3抗性:1敏感模型分離，所述模型用于具有孟德爾遺傳的顯性遺傳的單基因座(p>0.05)。從12到20個(gè)t2個(gè)體收集種子(t2種子)。將如前述測(cè)試來自8個(gè)隨機(jī)選擇的t2家族每一個(gè)的25個(gè)t3同胞的后代。預(yù)期t2家族的約1/3在每個(gè)株系中是純合的(非分離的群體)。這些數(shù)據(jù)將表明aad-13(v1)穩(wěn)定整合并以孟德爾方式遺傳至少三代。然后將存活的t1植物隨機(jī)分配不同的2,4-滴施用率。對(duì)于煙草，140gae/ha2,4-滴是區(qū)分敏感植物與具有有意義水平抗性的植物的有效劑量。也應(yīng)用升高的比率以確定相對(duì)抗性水平(140,560,或2240gae/ha)。表15顯示了與煙草的未轉(zhuǎn)化對(duì)照(ky160)品種的比較。通過軌道噴霧器以187l/ha噴霧體積應(yīng)用所有生長(zhǎng)素除草劑施用。使用的2,4-滴是商業(yè)上的二甲胺鹽制劑(456gae/l,nufarm,stjoseph,mo)。一些個(gè)體施用備選的商業(yè)除草劑代替苯氧基生長(zhǎng)素。一個(gè)興趣點(diǎn)是確定吡啶基氧基乙酸生長(zhǎng)素除草劑定草酯和氟草煙是否可以在植物中被有效降解。使用軌道噴霧器以187l/ha噴霧體積對(duì)t1植物應(yīng)用除草劑。在t2代中進(jìn)一步評(píng)估顯示出耐受2,4-滴dma的t1植物。9.2–轉(zhuǎn)化植物的選擇結(jié)果首先使用2,4-滴選擇方案從未轉(zhuǎn)化植物背景選擇t1轉(zhuǎn)化體。表15比較了aad-13(v1)和對(duì)照基因的應(yīng)答以賦予煙草t1轉(zhuǎn)化體的2,4-滴抗性。應(yīng)答以％視覺損傷2wat給出。數(shù)據(jù)作為顯示出很少損傷或無(wú)損傷(<20％)、中度損傷(20-40％)或嚴(yán)重?fù)p傷(>40％)的個(gè)體的直方圖給出。對(duì)于每次處理給出了算術(shù)平均值和標(biāo)準(zhǔn)差。對(duì)于每個(gè)比率和轉(zhuǎn)化也在最后一列指出個(gè)體應(yīng)答范圍。ky160未轉(zhuǎn)化的煙草作為生長(zhǎng)素敏感對(duì)照。aad-13(v1)基因賦予個(gè)體t1煙草植物的除草劑耐受性。9.3–aad-13煙草中額外的葉施用除草劑抗性通過對(duì)葉子施用多種底物來確定aad-13(v1)在轉(zhuǎn)基因煙草中提供對(duì)其他芳氧基鏈烷酸生長(zhǎng)素除草劑抗性的能力。t1后代測(cè)試后額外的t1代植物用軌道噴霧器以187l/ha進(jìn)行噴霧。植物用不同的吡啶氧基乙酸除草劑噴霧：140-1120gae/ha定草酯(garlon3a,dowagrosciences)和280-1120gae/ha氟草煙(starane,dowagrosciences)。所有的應(yīng)用都以水配制。每個(gè)處理重復(fù)三次。處理后3和14天評(píng)估植物。aad-13-轉(zhuǎn)化的植物受到保護(hù)免于定草酯的損傷程度很弱但是受到良好保護(hù)而免于氟草煙損傷，該損傷可在未轉(zhuǎn)化的對(duì)照株系中看到(見表16)。這些結(jié)果證實(shí)煙草中的aad-13(v1)提供了對(duì)某些所選的測(cè)試吡啶氧基乙酸生長(zhǎng)素的抗性。aad-13(v1)基因提供了高達(dá)1120gae/ha氟草煙的顯著耐受性，而該基因僅僅提供了對(duì)定草酯的中等水平的耐受性，其低至280g/ha。這些數(shù)據(jù)證實(shí)aad-13(v1)在多個(gè)物種中提供了相對(duì)于吡啶氧基生長(zhǎng)素類的定草酯對(duì)氟草煙的選擇性偏倚。該出人意料的觀察結(jié)果進(jìn)一步將aad-13(v1)基因從相似機(jī)理的其他除草劑耐受性酶區(qū)分出來并且在多個(gè)植物物種中觀察到。實(shí)施例10–蕓苔中的aad-13(v1)和其他作物的轉(zhuǎn)化10.1–蕓苔轉(zhuǎn)化使用農(nóng)桿菌介導(dǎo)的轉(zhuǎn)化，用pat作為選擇標(biāo)記，賦予2,4-滴抗性的aad-13(v1)基因可以用于轉(zhuǎn)化歐洲油菜(brassicanapus)。用10％商品漂白劑可以對(duì)種子進(jìn)行10分鐘表面滅菌并用無(wú)菌蒸餾水洗滌3次。然后種子將被置于半濃度ms基礎(chǔ)培養(yǎng)基(murashige和skoog,1962)上并在設(shè)置為25℃和16小時(shí)光照/8小時(shí)黑暗的光周期的生長(zhǎng)方案下維持。將從5－7天齡的幼苗上切下下胚軸段(3－5mm)并置于愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基k1d1(含1mg/l激動(dòng)素和1mg/l2,4-滴的ms培養(yǎng)基)上3天作為預(yù)處理。接著將下胚軸段轉(zhuǎn)移進(jìn)皮氏平板，用含有pdab3759的農(nóng)桿菌z707s或lba4404菌株處理。農(nóng)桿菌在28℃黑暗中150rpm的振蕩器上過夜培養(yǎng)，并接著重懸于培養(yǎng)基中。用農(nóng)桿菌處理下胚軸段30分鐘后，其將被放回愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基3天。共培養(yǎng)之后片段將被置于k1d1tc(含有250mg/l羧芐青霉素和300mg/l特美汀的愈傷組織誘導(dǎo)培養(yǎng)基)恢復(fù)1周或2周?；蛘撸苯訉⑾屡咻S段置于選擇培養(yǎng)基k1d1h1(帶有1mg/l好必思(herbiace)的上文培養(yǎng)基)。羧芐青霉素和特美汀抗生素將被用于殺死農(nóng)桿菌。選擇劑好必思允許轉(zhuǎn)化細(xì)胞生長(zhǎng)。接著將形成愈傷組織的下胚軸段置于b3z1h1(ms培養(yǎng)基、3mg/l芐氨基嘌呤、1mg/l玉米醇溶蛋白、0.5mg/lmes[2-(n-嗎啉代)乙磺酸],5mg/l硝酸銀、1mg/l好必思、羧芐青霉素和特美汀)芽再生培養(yǎng)基。2-3周后芽再生并將下胚軸片段與芽一起轉(zhuǎn)移到b3z1h3培養(yǎng)基(ms培養(yǎng)基、3mg/l芐氨基嘌呤、1mg/l玉米醇溶蛋白、0.5mg/lmes[2-(n-嗎啉代)乙磺酸]、5mg/l硝酸銀、3mg/l好必思、羧芐青霉素和特美汀)再過三周。將從下胚軸片段上剪下芽并轉(zhuǎn)移到芽伸長(zhǎng)培養(yǎng)基mesh5或mesh10(ms、0.5mg/lmes、5或10mg/l好必思、羧芐青霉素、特美汀)上2-4周。將伸長(zhǎng)的芽在msi.1(含0.1mg/l吲哚丁酸的ms)上進(jìn)行根誘導(dǎo)培養(yǎng)。待植物具有良好建立的根系時(shí)其將被移植到土壤中。轉(zhuǎn)移到溫室之前，植物在conviron中受控環(huán)境條件下適應(yīng)1-2周。10.2–其他作物的農(nóng)桿菌轉(zhuǎn)化按照本文公開的內(nèi)容，可以根據(jù)本發(fā)明使用本領(lǐng)域已知的技術(shù)轉(zhuǎn)化其他作物。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的黑麥轉(zhuǎn)化，參閱如popelka和altpeter(2003)。參閱如hinchee等,1988。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的高粱轉(zhuǎn)化，參閱如zhao等,2000。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的大麥轉(zhuǎn)化，參閱如tingay等,1997。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的小麥轉(zhuǎn)化，參閱如cheng等,1997。對(duì)于農(nóng)桿菌介導(dǎo)的稻轉(zhuǎn)化，參閱如hiei等,1997。下文給出了這些和其他植物的拉丁名。應(yīng)該明確，這些和其他(非農(nóng)桿菌)轉(zhuǎn)化技術(shù)可用于將例如aad-13(v1)轉(zhuǎn)化進(jìn)這些植物和其他植物，包括但不僅限于玉蜀黍(zeamays)、小麥(小麥屬物種(triticumspp.))、稻(稻屬物種(oryzaspp.)和菰屬物種(zizaniaspp.))、大麥(大麥屬物種(hordeumspp.))、棉花(水麻(abromaaugusta)和棉花屬物種(gossypiumspp.))、大豆(glycinemax)、甜菜以及食用甜菜(甜菜屬物種(betaspp.))、甘蔗(桄榔(arengapinnata))、番茄(番茄(lycopersiconesculentum)和番茄屬其他物種)、粘果酸漿(physalisixocarpa)、solariumincanum和茄屬其他物種，以及樹番茄(cyphomandrabetacea))、馬鈴薯(solanumtubersoum)、甘薯(ipomoeabetatas)、黑麥(黑麥屬物種(secalespp.))、胡椒(辣椒(capsicumannuum)、c.sinense和鳥辣椒(c.frutescens))、萵苣(生菜(lactucasativa)、山萵苣(l.perennis)和野萵苣(l.pulchella))、卷心菜(蕓苔屬物種(brassicaspp.))、芹菜(旱芹(apiumgraveolens))、茄子(solanummelongena)、花生(arachishypogea)、高粱(所有高粱屬(sorghum)物種)、苜蓿(紫花苜蓿(medicagosativum))、胡蘿卜(daucuscarota)、豆類(菜豆屬物種(phaseolusspp.)和其他屬)、燕麥(燕麥(avenasativa)和粗燕麥(a.strigosa))、豌豆(豌豆屬(pisum)、豇豆屬(vigna)和四棱豆屬物種(tetragonolobusspp.))、向日葵(helianthusannuus)、南瓜(南瓜屬物種(cucurbitaspp.))、黃瓜(cucumissativa)、煙草(煙草屬物種(nicotianaspp.))、擬南芥(arabidopsisthaliana)、草坪草(黑麥草屬(lolium)、剪股穎屬(agrostis)、早熟禾屬(poa)、狗牙根屬(cynadon)和其他屬)、三葉草(三葉草屬(tifolium))、野豌豆(野豌豆屬(vicia))。帶有如aad-13(v1)基因的這些植物包括于本發(fā)明中。在許多落葉和常綠木材的耕作制度中，aad-13(v1)具有增加主要生長(zhǎng)素除草劑應(yīng)季使用的實(shí)用性的潛能。綠草定、2,4-滴和/或氟草煙抗性木材物種增加了過分使用這些除草劑而不擔(dān)心損傷的靈活性。這些物種包括但不局限于：榿木(榿木屬物種(alnusspp.))、梣(梣屬物種(fraxinusspp.))、白楊和楊木物種(楊屬物種(populusspp.))、山毛櫸(水青岡屬物種(fagusspp.))、樺(樺木屬物種(betulaspp.))、櫻桃(李屬物種(prunusspp.))、桉樹(桉屬物種(eucalyptusspp.))、山核桃樹(山核桃屬物種(caryaspp.))、楓樹(楓屬物種(acerspp.))、橡樹(櫟屬物種(quercusspp.))和松樹(松屬物種(pinusspp.))。在觀賞性和結(jié)果物種中利用生長(zhǎng)素抗性進(jìn)行選擇性雜草控制也在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)例包括但不局限于：玫瑰(薔薇屬物種(rosaspp.))、地膚(burningbush)(衛(wèi)矛屬物種(euonymusspp.))、矮牽牛(矮牽牛屬物種(petuniaspp.))、秋海棠(秋海棠屬物種(begoniaspp.))、杜鵑(杜鵑屬物種(rhododendronspp.))、山楂或蘋果(蘋果屬物種(malusspp.))、梨(梨屬物種(pyrusspp.))、桃(李屬物種)和萬(wàn)壽菊(萬(wàn)壽菊屬物種(tagetesspp.))。實(shí)施例11–令人驚奇的結(jié)果的進(jìn)一步證據(jù):aad-13對(duì)aad-2種植新鮮收集的用植物優(yōu)化的aad-13(v1)或天然aad-2(v1)基因(見pct/us2005/014737)轉(zhuǎn)化的t1擬南芥種子，然后將選擇的如前述草銨膦抗性植物隨機(jī)分配多種劑量的2,4-滴(50-3200gae/ha)。通過噴霧體積為187l/ha的履帶式噴霧機(jī)應(yīng)用除草劑。使用的2,4-滴是商業(yè)二甲胺鹽制劑(456gae/l,nufarm,stjoseph,mo)混合到200mmtris緩沖液(ph9.0)或200mmhepes緩沖液(ph7.5)中。相對(duì)于轉(zhuǎn)化和未轉(zhuǎn)化對(duì)照株系，aad-13(v1)和aad-2(v1)確實(shí)提供了可檢測(cè)到的2,4-滴抗性，然而，個(gè)體在其向個(gè)體t1擬南芥植物賦予2,4-滴抗性的能力上存在可變性。令人驚奇地，從高耐性植物的頻率和整體平均損傷來看，aad-2(v1)和aad-2(v2)轉(zhuǎn)化體對(duì)2,4-滴的抗性都比aad-13(v1)基因差很多。aad-2(v1)轉(zhuǎn)化的植物不能在200gae/ha2,4-滴下相對(duì)無(wú)損傷(<20％的目測(cè)損傷)地存活，且總體種群損傷約為83％(參閱pct/us2005/014737)。相反，用2,240gae/ha2,4-滴處理aad-13(v1)時(shí)，其種群平均損傷約為15％(表11)。aad-13和aad-2植物優(yōu)化基因的比較表明aad-13(v1)在植物中具有顯著的優(yōu)勢(shì)?？紤]到aad-2(v1)(參閱pct/us2005/014737)和aad-13(v1)的體外比較表明二者都高效降解2,4-滴，并且均享有對(duì)手性芳氧基鏈烷酸酯底物的s型特異性，這些結(jié)果是未曾預(yù)料到的。在個(gè)體t1植物中aad-2(v1)以變化的水平表達(dá)，然而，這種表達(dá)的蛋白質(zhì)幾乎不提供對(duì)2,4-滴損傷的保護(hù)。天然和植物優(yōu)化的aad-2基因(參閱pct/us2005/014737)的蛋白質(zhì)表達(dá)水平(在植物中)沒有明顯的實(shí)質(zhì)性差異。這些數(shù)據(jù)證實(shí)了早前的發(fā)現(xiàn)，即在植物中產(chǎn)生aad-13(v1)的功能性表達(dá)并得到對(duì)2,4-滴和所選的吡啶氧乙酸類除草劑的除草劑抗性是未預(yù)料的。實(shí)施例12–種植前滅生性應(yīng)用此實(shí)施例和其后的實(shí)施例是本發(fā)明aad-13可能帶來的新除草劑用途的具體實(shí)例。種植前滅生性除草劑應(yīng)用旨在在種植給定作物前殺死在冬天或早春出現(xiàn)的雜草。一般在種植前未完成物理除草的非耕地或減少的耕地管理系統(tǒng)中應(yīng)用。因此除草劑程序必須控制種植時(shí)存在的非常廣譜的闊葉和禾本科雜草。草甘膦、克無(wú)蹤和草銨膦是種植前滅生性除草劑應(yīng)用中廣泛使用的非選擇性無(wú)殘留除草劑的實(shí)例。然而，由于以下一種或多種原因使這個(gè)季節(jié)的一些雜草很難控制：雜草物種或生物型對(duì)除草劑的內(nèi)在不敏感性、冬季一年生雜草的相對(duì)較大的尺寸和限制除草劑攝取和活性的涼爽的天氣條件。一些除草劑選擇可以與這些除草劑罐混以提高對(duì)雜草的譜系和活性，而非選擇性除草劑對(duì)雜草不太有效。實(shí)例為2,4-滴與草甘膦罐混應(yīng)用以輔助控制小飛蓬(conyzacanadensis)(加拿大飛蓬)。用于出現(xiàn)的多數(shù)雜草的種植前滅生控制的草甘膦用量可從420到1680gae/ha，更一般的從560到840gae/ha；然而，可以應(yīng)用280-1120gae/ha的2,4-滴以輔助控制許多闊葉雜草物種(如加拿大飛蓬)。2,4-滴是精選的除草劑，因?yàn)樗鼘?duì)范圍非常廣泛的闊葉雜草有效、甚至在低溫下也有效并且非常廉價(jià)。然而，如果其后的作物為敏感性雙子葉作物，則土壤中的2,4-滴殘留(盡管殘留很短)可能對(duì)作物產(chǎn)生負(fù)影響。大豆是敏感性作物，需要在滅生應(yīng)用和種植之間存在7天(對(duì)于280gae/ha的2,4-滴用量)到至少30天(對(duì)于1120gae/ha的2,4-滴應(yīng)用)的最小時(shí)間周期。在棉花種植前禁止用2,4-滴進(jìn)行滅生性處理(參閱聯(lián)邦說明(federallabels)，多數(shù)通過cpr，2005提供或在cdms.net/manuf/manuf.asp在線提供)。使用aad-13(v1)轉(zhuǎn)化的棉花或大豆，這些作物在土壤中來自之前甚至在種植后作物出苗前的滅生性應(yīng)用的2,4-滴殘留下存活。罐混(或商品預(yù)混)伴侶提高的靈活性和降低的費(fèi)用可改善雜草控制的選擇并提高在重要的非耕地和減少耕地的地點(diǎn)滅生性應(yīng)用的強(qiáng)度。此實(shí)例是可利用的多種選擇之一。通過使用聯(lián)邦除草劑說明(cpr,2005)中所述產(chǎn)品和例如agriliancecropprotectionguide(2003)所描述的用途，雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)注意到多種其他應(yīng)用，包括但不僅限于克無(wú)蹤+2,4-滴或草銨膦+2,4-滴。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)認(rèn)識(shí)到，以上實(shí)例可應(yīng)用于任何由aad-13(v1)基因(如果穩(wěn)定轉(zhuǎn)化)保護(hù)的2,4-滴敏感性(或其他苯氧基生長(zhǎng)素除草劑)作物。同樣，aad-13降解氟草煙的獨(dú)特性質(zhì)增強(qiáng)其效用，分別通過取代或罐混35-560gae/ha的氟草煙來增加譜系和/或提高控制多年生或藤本雜草物種的能力。實(shí)施例13－生長(zhǎng)素除草劑在僅轉(zhuǎn)化aad-13(v1)的大豆、棉花和其他雙子葉作物中的作物內(nèi)應(yīng)用aad-13(v1)使得可以在通常對(duì)2,4-滴敏感的作物中使用苯氧基生長(zhǎng)素除草劑(如2,4-滴和mcpa)和吡啶氧基生長(zhǎng)素(氟草煙)直接控制廣譜闊葉雜草。280到2240gae/ha的2,4-滴應(yīng)用可控制農(nóng)業(yè)環(huán)境中存在的多數(shù)闊葉雜草物種。更一般地使用560-1120gae/ha。對(duì)于氟草煙，應(yīng)用劑量范圍一般為35-560gae/ha,更一般70-280gae/ha。這種額外的工具的優(yōu)勢(shì)是闊葉除草劑成分極低的費(fèi)用和以較高用量使用時(shí)較高用量的2,4-滴、和氟草煙提供的可能的短期殘留雜草控制，而非殘留除草劑如草甘膦不提供對(duì)后來萌發(fā)的雜草的控制。這種工具還提供了除草劑作用模式聯(lián)合htc便利性的機(jī)制，作為將除草劑抗性與雜草演替有機(jī)整合在一起的管理策略。該工具提供的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是將廣譜闊葉雜草控制除草劑(如，2,4-滴和氟草煙)和通常使用的殘留雜草控制除草劑罐混的能力。這些除草劑一般在種植前或種植期應(yīng)用，但是通常對(duì)種植前在大田中存在的已出現(xiàn)和確定的雜草低效。通過擴(kuò)展這些芳氧基生長(zhǎng)素除草劑的效用(包括種植期、出苗前或種植前應(yīng)用)，增加了殘留雜草控制程序的靈活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到殘留除草劑程序?qū)⒁蚰康淖魑锒?，但是一般的程序包括氯乙酰?chloracetmide)除草劑和二硝基苯胺除草劑家系，還包括諸如異草松和甲磺草胺的除草劑以及多種als-抑制、ppo-抑制和hppd-抑制除草劑。其他益處包括(提供)在芳氧基乙酸生長(zhǎng)素除草劑應(yīng)用之后，種植前所必須的對(duì)2,4-滴或氟草煙的耐性(參閱前述實(shí)施例)；且由未完全清潔的含有2,4-滴或氟草煙的大罐引起的對(duì)雙子葉作物的污染損傷問題較小。麥草畏、r-2,4-滴丙酸，和一些其他除草劑仍可用于繼續(xù)控制轉(zhuǎn)化了aad-13(v1)的雙子葉作物自生作物。本領(lǐng)域技術(shù)人員還會(huì)認(rèn)識(shí)到，以上實(shí)例可用于被aad-13(v1)基因(如果穩(wěn)定轉(zhuǎn)化)保護(hù)的任何2,4-滴(或其他芳氧基生長(zhǎng)素除草劑)敏感性作物。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，aad-13(v1)轉(zhuǎn)化使得可以使用單獨(dú)或與除草劑聯(lián)合的多種商品苯氧基或吡啶氧基生長(zhǎng)素除草劑。可以通過《作物保護(hù)參考》(cropprotectionreference,cpr)書籍中匯編的除草劑說明或類似的匯編或任何商品或?qū)W術(shù)作物保護(hù)參考文獻(xiàn)(如來自agriliance(2005)的《作物保護(hù)指南》(cropprotectionguide))確定這些化學(xué)中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于aad-13(v1)可在htc中使用(無(wú)論單獨(dú)、罐混或相繼使用)的可選除草劑都在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)施例14－苯氧基生長(zhǎng)素和吡啶氧基生長(zhǎng)素除草劑在僅轉(zhuǎn)化aad-12(v1)的玉米、稻和其他單子葉物種中的作物內(nèi)用途以類似的方式用aad-13(v1)轉(zhuǎn)化禾本科物種(例如但不僅限于玉米、稻、小麥、大麥或草坪草和牧草)將使得在通常選擇性不確定的作物中使用高效的苯氧基和吡啶氧基生長(zhǎng)素。多數(shù)禾本科物種對(duì)生長(zhǎng)素除草劑如苯氧基生長(zhǎng)素(即2,4-滴)具有天然耐性。然而，由于應(yīng)用時(shí)間窗口變短或無(wú)法接受的損傷風(fēng)險(xiǎn)，相對(duì)低水平的作物選擇性導(dǎo)致了在這些植物中應(yīng)用的減少。因此轉(zhuǎn)化了aad-13(v1)的單子葉作物能使用已述用于雙子葉作物的相似處理組合，如應(yīng)用280到2240gae/ha的2,4-滴控制多數(shù)闊葉雜草物種。更一般地使用560-1120gae/ha。對(duì)于氟草煙，一般應(yīng)用劑量范圍是35-560gae/ha，更一般是70-280ae/ha。這種額外的工具的優(yōu)勢(shì)是闊葉除草劑成分極低的費(fèi)用和較高用量的2,4-滴或氟草煙提供的可能的短期殘留雜草控制。相比之下，非殘留除草劑(如草甘膦)不提供對(duì)后來萌發(fā)的雜草的控制。這種工具還提供了將除草劑作用模式與htc的便利性進(jìn)行輪換的機(jī)制，在草甘膦耐性作物/aad-13(v1)htc聯(lián)合策略中作為將除草劑抗性與雜草演替有機(jī)整合在一起的管理策略(無(wú)論是否輪作作物物種)。該工具提供的另一個(gè)優(yōu)點(diǎn)是將廣譜闊葉雜草控制除草劑(如，2,4-滴和氟草煙)和通常使用的殘留雜草控制除草劑罐混的能力。這些除草劑一般在種植前或種植期應(yīng)用，但是通常對(duì)種植前在大田中存在的已出現(xiàn)和確定的雜草低效。通過擴(kuò)展這些芳氧基生長(zhǎng)素除草劑的效用(包括種植期、出苗前或種植前應(yīng)用)，增加了殘留雜草控制程序的靈活性。本領(lǐng)域技術(shù)人員認(rèn)識(shí)到殘留除草劑程序?qū)⒁蚰康淖魑锒?，但是一般的程序包括氯乙酰胺除草劑和二硝基苯胺除草劑家系，還包括諸如異草松和甲磺草胺的除草劑以及多種als-抑制、ppo-抑制和hppd-抑制除草劑。玉米、稻和其它單子葉植物對(duì)苯氧基或吡啶氧基生長(zhǎng)素的增加的耐性使得能作物內(nèi)使用這些除草劑，沒有生長(zhǎng)階段的限制或作物倒伏的可能性，展開的現(xiàn)象如鼠尾(“rat-tailing”)、玉米中生長(zhǎng)調(diào)控因子誘導(dǎo)的莖脆性或變形的支柱根。通過aad-13(v1)能用于htc的每種可選的除草劑，不論是單獨(dú)、罐混或相繼使用，認(rèn)為在本發(fā)明范圍之內(nèi)。實(shí)施例15－在任意作物中與草甘膦耐性性狀疊加的aad-13(v1)北美大田種植的絕大多數(shù)棉花、蕓苔、玉米和大豆含有草甘膦耐性(gt)性狀，并且對(duì)gt玉米的采用正在增加。其他gt作物(如小麥、稻、甜菜和草坪草)已在開發(fā)中，但目前尚未上市。許多其他草甘膦抗性物種正處在實(shí)驗(yàn)至開發(fā)階段(如苜蓿、甘蔗、向日葵、甜菜、豌豆、胡蘿卜、黃瓜、萵苣、洋蔥、草莓、番茄和煙草；林業(yè)物種如白楊和香楓以及園藝物種如萬(wàn)壽菊、牽牛花和秋海棠，萬(wàn)維網(wǎng)上的isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm,2005)。gtc是有價(jià)值的工具，在于受控雜草的范圍以及此系統(tǒng)提供的便利性和費(fèi)用效益。然而，草甘膦作為目前標(biāo)準(zhǔn)的基礎(chǔ)處理的用途正在選擇草甘膦抗性雜草。此外，在實(shí)行僅用草甘膦化學(xué)品程序的大田中草甘膦固有效力較低的雜草正在演替為主要物種。通過常規(guī)育種或共同作為新轉(zhuǎn)化事件將aad-13(v1)與gt性狀疊加可以改進(jìn)雜草控制的效力、靈活性和管理雜草演替及除草劑抗性發(fā)展的能力。如前述實(shí)施例中所提到的，通過用aad-13(v1)轉(zhuǎn)化作物，單子葉作物將具有較高的苯氧基或吡啶氧基生長(zhǎng)素安全余地，并可以在雙子葉作物中選擇性應(yīng)用苯氧基生長(zhǎng)素。可以設(shè)想改善的雜草控制選擇的一些方案，其中在任意單子葉或雙子葉作物物種中疊加了aad-13(v1)和gt性狀：a)可以以標(biāo)準(zhǔn)出苗后用量(420至2160gae/ha，優(yōu)選560至840gae/ha)應(yīng)用草甘膦，用于控制多數(shù)禾本科和闊葉雜草物種。為控制草甘膦抗性闊葉雜草如小飛蓬或內(nèi)在難以用草甘膦控制的雜草(如鴨跖草屬物種(commelinaspp.)、番薯屬物種(ipomoeaspp.)等)，可以相繼、罐混或作為預(yù)混料與草甘膦一起應(yīng)用280-2240gae/ha(優(yōu)選560-1120gae/ha)2,4-滴以提供有效控制。對(duì)于氟草煙，一般用量范圍是35-560gae/ha，更一般是70-280ae/ha。b)目前，應(yīng)用于gtc的草甘膦用量范圍一般為每個(gè)應(yīng)用時(shí)間560至2240gae/ha。草甘膦對(duì)于禾本科物種的效力遠(yuǎn)高于闊葉雜草物種。aad-13(v1)+gt疊加性狀可允許禾本科有效的草甘膦用量(105-840gae/ha，更優(yōu)選210-420gae/ha)。接著可以相繼、罐混或作為預(yù)混料與禾本科有效用量的草甘膦一起應(yīng)用2,4-滴(280-2240gae/ha，更優(yōu)選560-1120gae/ha)以提供必要的闊葉雜草控制。上文提到的劑量水平上的氟草煙是處理方案中可接受的成分。草甘膦的低用量還可為闊葉雜草控制提供一些益處；然而初期控制可來自2,4-滴或氟草煙。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，aad-13(v1)轉(zhuǎn)化進(jìn)作物使得可以單獨(dú)或組合(相繼或獨(dú)立地)使用一種或多種商品芳氧基生長(zhǎng)素除草劑。通過cpr《作物保護(hù)參考》書中匯編的除草劑說明或類似的匯編、在線(如cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的說明或任意商品或?qū)W術(shù)作物保護(hù)指南(如agriliance的《作物保護(hù)指南》(2005))可以確定這些化學(xué)物質(zhì)中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于aad-13(v1)而可以在htc中使用(無(wú)論單獨(dú)、罐混或相繼使用)的可選除草劑都考慮在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)施例16－在任意作物中與草銨膦耐性性狀疊加的aad-13(v1)草銨膦耐性(pat,bar)目前作為輸入性狀(如昆蟲抗性蛋白)的選擇標(biāo)記或具體作為htc性狀存在于北美種植的大量作物中。作物包括但不僅限于草銨膦耐性蕓苔、玉米和棉花。其他的草銨膦耐性作物(如稻、甜菜、大豆和草坪草)已在開發(fā)中，但目前尚未準(zhǔn)予上市。與草甘膦相似，草銨膦是相對(duì)非選擇性廣譜禾本科和闊葉除草劑。草銨膦的作用方式與草甘膦不同。其作用較快，在除草劑應(yīng)用24－48小時(shí)后導(dǎo)致受到處理的葉的脫水和“燒傷”。這對(duì)于表觀快速雜草控制是有利的。然而，這也限制了草銨膦向靶植物分生組織區(qū)的轉(zhuǎn)移，導(dǎo)致較弱的雜草控制，這被兩種化合物在許多物種中的相對(duì)雜草控制性能評(píng)定所證明(agriliance,2005)。通過常規(guī)育種或共同作為新轉(zhuǎn)化事件將aad-13(v1)與草銨膦耐性性狀疊加可以改進(jìn)雜草控制的效力、靈活性和管理雜草演替及除草劑抗性發(fā)展的能力。可以設(shè)想改善的雜草控制選擇的一些方案，其中在任意單子葉或雙子葉作物物種中疊加了aad-13(v1)和草銨膦耐性性狀：a)可以以標(biāo)準(zhǔn)出苗后用量(200至1700gae/ha，優(yōu)選350至500gae/ha)應(yīng)用草銨膦，用于控制多種禾本科和闊葉雜草物種。目前尚未確認(rèn)草銨膦抗性雜草；然而固有對(duì)草銨膦更有耐性的雜草數(shù)目多于草甘膦。i)內(nèi)在耐性闊葉雜草物種(如田薊(cirsiumarvensis)、加拿大麻(apocynumcannabinum)和小飛蓬)的控制可通過罐混280-2240gae/ha(更優(yōu)選560-2240gae/ha)的2,4-滴以有效控制這些更難以控制的多年生物種并改進(jìn)對(duì)一年生闊葉雜草物種的控制強(qiáng)度。在雜草控制方案中，認(rèn)為氟草煙是可接受的成分。對(duì)于氟草煙，一般用量范圍是35-560gae/ha，更一般是70-280ae/ha。b)多重組合(如草銨膦(200-500gae/ha)+/-2,4-滴(280-1120gae/ha)+/-氟草煙(以上文所列用量))可提供更強(qiáng)的重疊雜草控制譜。另外，重疊譜提供管理或延緩除草劑抗性雜草的另一種機(jī)制。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，aad-13(v1)轉(zhuǎn)化進(jìn)作物使得可以單獨(dú)或組合(相繼或獨(dú)立地)使用一種或多種商品芳氧基乙酸生長(zhǎng)素除草劑。通過cpr《作物保護(hù)參考》書中匯編的除草劑說明或類似的匯編、在線(如cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的說明或任意商品或?qū)W術(shù)作物保護(hù)指南(如agriliance的《作物保護(hù)指南》(2005))可以確定這些化學(xué)物質(zhì)中其他代表性除草劑的具體用量。每種由于aad-13(v1)而可以在htc中使用(無(wú)論單獨(dú)、罐混或相繼使用)的可選除草劑都考慮在本發(fā)明的范圍內(nèi)。本發(fā)明從而包括轉(zhuǎn)基因植物(和植物細(xì)胞)，其包含與pct/us2007/086813(2007年12月7日提交)“疊加”的本發(fā)明的aad-13基因。此類dsm-2基因包括該申請(qǐng)的seqidnos:1和3。那些基因編碼包含那個(gè)申請(qǐng)的seqidnos:2和4的蛋白質(zhì)。此外，額外的除草劑耐受基因可以包括在包含三個(gè)或更多此類基因的多個(gè)“疊加”中。實(shí)施例17–任一作物中與aad-1(v3)性狀疊加的aad-13(v1)純合aad-13(v1)和aad-1(v3)(對(duì)于后者見pct/us2005/014737)可以反交并收集f1種子。來自每種基因的兩個(gè)反交的f1種子分層并且每次雜交的所處理的4個(gè)重復(fù)在與用于其他測(cè)試相同的噴霧方案下用下面處理之一進(jìn)行處理：70,140,280gae/ha氟草煙(選擇aad-12(v1)基因)；280,560,1120gae/har-2,4-滴丙酸(選擇aad-1(v3)基因)；或560,1120,2240gae/ha2,4-滴dma(以證實(shí)2,4-滴耐受性)。還種植每種基因的純合t2植物用作對(duì)照。在3和14dat對(duì)植物分級(jí)。噴霧結(jié)果在表24中顯示。結(jié)果證實(shí)aad-13(v1)可以與aad-1(v3)成功地疊加，從而增加可以應(yīng)用于目的作物的除草劑范圍(對(duì)于aad-1和aad-13分別為苯氧基乙酸+苯氧基丙酸對(duì)苯氧基乙酸+吡啶氧基乙酸)。除草劑雜交抗性模式的互補(bǔ)性質(zhì)允許方便地使用這兩種基因作為互補(bǔ)的和可疊加的大田選擇標(biāo)記。在其中使用單個(gè)基因的耐受性不重要的作物中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以通過對(duì)相同除草劑疊加第二種耐受性基因增加耐受性。這可以使用相同基因用相同或不同的啟動(dòng)子來進(jìn)行，然而，如本文觀察到的，通過區(qū)分雜交保護(hù)與苯氧基丙酸(來自[aad-1(v3)]或吡啶氧基乙酸[aad-13(v1)]，可以促進(jìn)疊加和追蹤兩種互補(bǔ)的性狀。本發(fā)明從而包括轉(zhuǎn)基因植物(和植物細(xì)胞)，其包含與wo2005/107437(2005年11月17日公開；pct/us2005/014737(2005年5月2日申請(qǐng)))的aad-1基因“疊加”的本發(fā)明的aad-13基因。此類aad-1基因包括該申請(qǐng)的seqidnos:3,4,5和12。這些基因編碼包含該申請(qǐng)的seqidnos:9,10,11和13的蛋白質(zhì)。此外，額外的除草劑耐受基因可以包括在包含三個(gè)或更多此類基因的多個(gè)“疊加”中。實(shí)施例18–在任一作物中與aad-12(v1)性狀疊加的aad-13(v1)可以將純合aad-13(v1)和aad-12(v1)植物(后者見wo2007/053482)雜交并收集f1種子?？梢圆シN來自每種基因的兩次反交的f1種子并在與用于其他測(cè)試的相同噴霧方案下使用下面的處理之一處理f1植物：70,280,1120gae/ha氟草煙(選擇aad-12(v1)基因)；70,280,1120gae/ha定草酯(選擇aad-13(v1)基因)；或560,1120,2240gae/ha2,4-滴dma(以證實(shí)2,4-滴耐受性)。aad-13(v1)可以與aad-12(v1)疊加，從而增加可應(yīng)用于目的作物的除草劑范圍(對(duì)于aad-12和aad-13分別為苯氧基乙酸+定草酯對(duì)苯氧基乙酸+氟草煙)。除草劑雜交抗性模式的互補(bǔ)性質(zhì)允許方便地使用這兩種基因作為互補(bǔ)的和可疊加的大田選擇標(biāo)記。在其中使用單個(gè)基因的耐受性不重要的作物中，本領(lǐng)域技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到可以通過對(duì)相同除草劑疊加第二種耐受性基因增加耐受性。這可以使用相同基因用相同或不同的啟動(dòng)子來進(jìn)行，然而，如本文觀察到的，通過區(qū)分雜交保護(hù)與氟草煙[來自aad-13(v1)]或定草酯[aad-12(v1)]，可以方便疊加和追蹤兩種互補(bǔ)的性狀。本發(fā)明從而包括轉(zhuǎn)基因植物(和植物細(xì)胞)，其包含與wo2007/053482(2007年5月10日公開；pct/us2006/042133(2006年10月27日申請(qǐng))的aad-12基因“疊加”的本發(fā)明的aad-13基因。此類aad-12基因包括該申請(qǐng)的seqidnos:1,3,和5。這些基因編碼包含該申請(qǐng)的seqidnos:2和4的蛋白質(zhì)。此外，額外的除草劑耐受基因可以包括在包含三個(gè)或更多此類基因的多個(gè)“疊加”中。實(shí)施例19－在任意作物中與ahas性狀疊加的aad-13(v1)咪唑啉酮除草劑耐性(ahas等)目前存在于北美種植的大量作物中，包括但不僅限于玉米、稻和小麥。其他的咪唑啉酮耐性作物(如棉花和甜菜)已在開發(fā)中，但目前尚未上市。目前將許多咪唑啉酮類除草劑(如甲氧咪草煙、咪草煙、滅草喹和甲咪唑煙酸)選擇性用于多種常規(guī)作物中。通過咪唑啉酮耐性性狀如ahas等使得可以使用咪草煙、甲氧咪草煙和非選擇性的咪唑煙酸。這類化學(xué)品還具有顯著的土壤殘留活性，因此與基于草甘膦或草銨膦的系統(tǒng)不同，它能提供超過應(yīng)用時(shí)間的延長(zhǎng)的雜草控制。然而，咪唑啉酮類除草劑控制的雜草譜不如草甘膦廣泛(agriliance,2005)。另外，針對(duì)咪唑啉酮類除草劑具有的作用模式(抑制乙酰乳酸合酶，als)，許多雜草已經(jīng)發(fā)展出抗性(heap,2007)。通過常規(guī)育種或共同作為新轉(zhuǎn)化事件將aad-13(v1)與咪唑啉酮耐性性狀疊加可以改進(jìn)雜草控制的效力、靈活性和管理雜草演替及除草劑抗性發(fā)展的能力。如前述實(shí)施例中所提到的，通過用aad-13(v1)轉(zhuǎn)化作物，單子葉作物將具有較高的苯氧基或吡啶氧基生長(zhǎng)素安全余地，并可以在雙子葉作物中選擇性應(yīng)用這些生長(zhǎng)素?？梢栽O(shè)想改善的雜草控制選擇的一些方案，其中在任意單子葉或雙子葉作物物種中疊加了aad-13(v1)和咪唑啉酮耐性性狀：a)可以以標(biāo)準(zhǔn)出苗后用量(35至280gae/ha，優(yōu)選70-140gae/ha)應(yīng)用咪唑啉酮，用于控制許多禾本科和闊葉雜草物種。i)可以通過罐混280-2240gae/ha(更優(yōu)選560-2240gae/ha)的2,4-滴來控制als抑制劑抗性闊葉雜草(如amaranihusrudis、三裂葉豚草(ambrosiatrifida)、藜(chenopodiumalbum)(等等，heap,2005))。對(duì)于氟草煙，一般用量范圍是35-560gae/ha，更一般是70-280ae/ha。ii)也可以通過罐混280-2240gae/ha(更優(yōu)選560-2240gae/ha)的2,4-滴來控制固有對(duì)咪唑啉酮類除草劑更具耐性的闊葉物種(如番薯屬物種)。參閱上文綠草定或氟草煙的用量。b)多重組合(如咪草煙(35至280gae/ha，優(yōu)選70-140gae/ha)+/-2,4-滴(280-1120gae/ha)+/-氟草煙(以上文所列用量))可提供更強(qiáng)的重疊雜草控制譜。另外，重疊譜提供管理或延緩除草劑抗性雜草的另一種機(jī)制。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員會(huì)認(rèn)識(shí)到，通過aad-13(v1)轉(zhuǎn)化并通過常規(guī)育種或遺傳工程與任意咪唑啉酮耐性性狀疊加使得可以單獨(dú)或以多種組合使用多種商品咪唑啉酮類除草劑、苯氧乙酸或吡啶氧乙酸生長(zhǎng)素除草劑的任意一種。代表這些化學(xué)品的其他除草劑的特定比率可以通過如下除草劑標(biāo)簽確定：通過在cpr(農(nóng)作物保護(hù)參考)書或類似的編輯物中編撰的除草劑標(biāo)簽、在線編撰的標(biāo)簽(例如，cdms.net/manuf/manuf.asp)或者任何商業(yè)或?qū)W術(shù)作物保護(hù)指導(dǎo)，如來自agriliance的作物保護(hù)手冊(cè)(2005)。能夠被aad-13(v1)用于htc的每種備選除草劑，無(wú)論其單獨(dú)使用、罐混合還是順序使用，都認(rèn)為在本發(fā)明的范圍內(nèi)。實(shí)施例20—在任意作物中aad-13(v1)與昆蟲抗性(ir)或其他輸入性狀疊加作物中由轉(zhuǎn)基因性狀提供的昆蟲抗性在北美及全球的玉米和棉花產(chǎn)品中是普遍的。多家種子公司已開發(fā)具有聯(lián)合ir和ht性狀的商業(yè)產(chǎn)品。這些包括btir性狀(如在網(wǎng)址lifesci.sussex.ac.uk列出的bt毒素，2006)和任一或所有上文提到的htc性狀。這種性狀提供帶來的價(jià)值是通過單次性狀提供的遺傳方法控制多種害蟲問題的能力。如果雜草控制和昆蟲控制彼此獨(dú)立完成，這種性狀提供的便利性將受到限制。單獨(dú)或與一個(gè)或多個(gè)其他htc性狀疊加的aad-13(v1)，通過常規(guī)育種或共同作為新的轉(zhuǎn)化事件，能與一個(gè)或多個(gè)其他輸入性狀(如昆蟲抗性、真菌抗性或脅迫耐受性等)(isb.vt.edu/cfdocs/fieldtests1.cfm,2005)疊加。除了由aad-13提供的改良的雜草控制和相關(guān)的除草劑耐性之外，益處包括前面實(shí)施例所述的便利性和靈活性，以及控制昆蟲害蟲和/或其他農(nóng)事脅迫的能力。因此，本發(fā)明可用于提供完整的改良作物品質(zhì)的農(nóng)事工具包，其具有靈活和低本高效控制許多農(nóng)事問題的能力。ir和ht的聯(lián)合性狀應(yīng)用于大部分的農(nóng)事和園藝/觀賞性作物以及林業(yè)。aad-13和它相稱的除草劑耐性的聯(lián)合以及任意數(shù)量的bt或非btir基因給予的昆蟲抗性可應(yīng)用到實(shí)施例13列出的作物種類(但不局限于此)。雜草控制領(lǐng)域的技術(shù)人員將認(rèn)識(shí)到aad-13(v1)轉(zhuǎn)化和通過常規(guī)育種或基因工程與相應(yīng)的ht性狀或ir性狀疊加，使之能夠利用單獨(dú)或多種組合的任何在實(shí)施例18-20中描述的多種商業(yè)除草劑、苯氧乙酸或吡啶氧乙酸類植物生長(zhǎng)素除草劑。通過cpr《作物保護(hù)參考》書中匯編的除草劑說明或類似的匯編、在線(如cdms.net/manuf/manuf.asp)匯編的說明或任意商品或?qū)W術(shù)作物保護(hù)指南(如agriliance的《作物保護(hù)指南》(2005))可以確定這些化學(xué)品中其他代表性除草劑的具體用量。通過aad-32(v1)，能在htc中使用(不管單獨(dú)使用、罐混還是相繼使用)的每種可選的除草劑，被認(rèn)為在本發(fā)明范圍內(nèi)。實(shí)施例21–作為體外雙子葉植物選擇標(biāo)記的aad-13(v1)使用合適的遞送方法將目的基因插入植物細(xì)胞的過程起始植物細(xì)胞、組織、器官和植物或細(xì)胞器(如質(zhì)體)的遺傳改造。然而，當(dāng)基因遞送進(jìn)入植物細(xì)胞中，只有極少百分比的細(xì)胞將異源基因整合到其基因組中。為了選擇這些已整合了目的基因的少數(shù)細(xì)胞，研究人員將可選擇或篩選的“標(biāo)記基因”與載體中的目的基因(goi)連接。含有這些標(biāo)記的細(xì)胞可從遞入dna質(zhì)粒載體的全體細(xì)胞群/組織中鑒定出來。通過選擇那些表達(dá)標(biāo)記基因的細(xì)胞，研究人員能鑒定可能將goi整合進(jìn)其基因組的少數(shù)細(xì)胞。aad-13(v1)當(dāng)如專利申請(qǐng)wo2007/053482(wrightetal.)中的實(shí)施例#24所用時(shí)可以作為選擇標(biāo)記發(fā)揮功能。序列表<110>j·m·里拉e·m·斯諾德萊a·e·羅賓遜t·r·萊特d·j·默洛<120>新除草劑抗性基因<130>das-142xc1pct<140>pct/us08/63212<141>2008-05-09<150>60/928,303<151>2007-05-09<160>7<170>patentin版本3.3<210>1<211>864<212>dna<213>sphingobiumherbicidovorans<400>1atgtcacccgccttcgacatcgccccgctcgacgccacgttcggcgccgtcgtcaccggc60gtgaagctcgccgatctcgatgatgccggatggctcgacctgcaggctgcctggctcgag120tacgcactcctcgttttccccgatcagcatctcacgcgcgagcagcagatcgcctttgcc180cgtcgcttcgggccactcgagttcgagatggccgcgatcagcaacgtgcggcccgacggc240agcctgcgggtcgagagcgacaacgacgacatgatgaagatcctgaagggcaacatgggc300tggcatgccgacagcacctacatgccggtccaggccaagggcgcggtgttcagtgccgaa360gtggttcctagcgtcggcggccagaccggcttcgccgacatgcgcgcggcctacgacgcg420ctcgacgaggatctgaaggcgcgcgtcgagacgctgcaggcccggcactcgctgcattac480agccagtcgaagctcggccaccagaccaaggcggccgacggtgaatatagcggctacggg540ctgcatgacgggccggtgccgctgcggccgctggtgaagatccatcccgagaccggccgc600aagtcgctgctgatcggccgccacgcccacgccattcccggcttggagccagccgagtcc660gaacgcttgctgcagcagctgatcgacttcgcctgccagccgccgcgaatctatcatcac720gactgggcgccgggcgacgccgtgctgtgggacaatcgctgcctgctgcaccaggcgacg780ccgtgggacatgacccagaagcgcatcatgtggcacagccgcatcgccggcgacccggcc840agcgagaccgcgctggcgcattga864<210>2<211>287<212>prt<213>sphingobiumherbicidovorans<400>2metserproalapheaspilealaproleuaspalathrpheglyala151015valvalthrglyvallysleualaaspleuaspaspalaglytrpleu202530aspleuglnalaalatrpleuglutyralaleuleuvalpheproasp354045glnhisleuthrarggluglnglnilealaphealaargargphegly505560proleuglupheglumetalaalaileserasnvalargproaspgly65707580serleuargvalgluseraspasnaspaspmetmetlysileleulys859095glyasnmetglytrphisalaaspserthrtyrmetprovalglnala100105110lysglyalavalpheseralagluvalvalproservalglyglygln115120125thrglyphealaaspmetargalaalatyraspalaleuaspgluasp130135140leulysalaargvalgluthrleuglnalaarghisserleuhistyr145150155160serglnserlysleuglyhisglnthrlysalaalaaspglyglutyr165170175serglytyrglyleuhisaspglyprovalproleuargproleuval180185190lysilehisprogluthrglyarglysserleuleuileglyarghis195200205alahisalaileproglyleugluproalaglusergluargleuleu210215220glnglnleuileaspphealacysglnproproargiletyrhishis225230235240asptrpalaproglyaspalavalleutrpaspasnargcysleuleu245250255hisglnalathrprotrpaspmetthrglnlysargilemettrphis260265270serargilealaglyaspproalasergluthralaleualahis275280285<210>3<211>867<212>dna<213>人工序列<220><223>植物優(yōu)化的(v1)<400>3atggcttcacctgccttcgacattgccccacttgatgccacatttggggcagttgtcact60ggggtcaagttggctgatcttgatgacgctggatggttggacctccaagctgcctggctt120gaatatgccctccttgtcttccctgaccagcacttgacaagggaacagcaaatagctttc180gctcgcagattcggaccacttgagttcgagatggcagccatctccaatgttagacccgat240ggcagcttgagggttgagtctgacaatgatgacatgatgaagatcctcaaaggcaacatg300ggatggcacgctgacagcacctacatgccagtgcaagcaaagggtgcagtgttctcagct360gaagtggttccctctgtgggtggccagactggttttgctgacatgagagctgcctatgat420gcacttgatgaagacttgaaggctcgtgtcgagacattgcaagcccgtcactccctccat480tactcccagagcaagctcggacaccagaccaaggctgcagatggtgagtactctggttat540ggcctccatgatgggcctgttcccttgaggccacttgtgaagatccatccagagactggc600agaaaatcccttctcataggccgtcatgcccatgccattcctggattggagccagctgag660tcagaaaggttgctccagcaactcattgattttgcttgtcaaccccctaggatctaccac720catgactgggctcctggagatgcagtgctctgggacaaccgctgcctccttcaccaagcc780actccctgggacatgacccagaaacgcatcatgtggcacagccgcattgctggtgaccca840gcatctgagaccgcacttgcacattga867<210>4<211>288<212>prt<213>人工序列<220><223>植物優(yōu)化的(v1)<400>4metalaserproalapheaspilealaproleuaspalathrphegly151015alavalvalthrglyvallysleualaaspleuaspaspalaglytrp202530leuaspleuglnalaalatrpleuglutyralaleuleuvalphepro354045aspglnhisleuthrarggluglnglnilealaphealaargargphe505560glyproleuglupheglumetalaalaileserasnvalargproasp65707580glyserleuargvalgluseraspasnaspaspmetmetlysileleu859095lysglyasnmetglytrphisalaaspserthrtyrmetprovalgln100105110alalysglyalavalpheseralagluvalvalproservalglygly115120125glnthrglyphealaaspmetargalaalatyraspalaleuaspglu130135140aspleulysalaargvalgluthrleuglnalaarghisserleuhis145150155160tyrserglnserlysleuglyhisglnthrlysalaalaaspglyglu165170175tyrserglytyrglyleuhisaspglyprovalproleuargproleu180185190vallysilehisprogluthrglyarglysserleuleuileglyarg195200205hisalahisalaileproglyleugluproalaglusergluargleu210215220leuglnglnleuileaspphealacysglnproproargiletyrhis225230235240hisasptrpalaproglyaspalavalleutrpaspasnargcysleu245250255leuhisglnalathrprotrpaspmetthrglnlysargilemettrp260265270hisserargilealaglyaspproalasergluthralaleualahis275280285<210>5<211>867<212>dna<213>人工序列<220><223>大腸桿菌優(yōu)化的(v2)<400>5atggcgagcccggcgttcgacattgcgccactggatgctacctttggcgcagttgtaact60ggcgtaaaactggcggatctggatgacgctggctggctggacctgcaggctgcgtggctg120gaatatgcactgctggtattcccggaccagcacctgacccgtgaacagcagatcgctttc180gcacgccgcttcggtccactggagttcgaaatggcagcgatctccaacgttcgtccggat240ggcagcctgcgtgttgaatctgacaacgatgacatgatgaaaatcctgaaaggcaacatg300ggttggcacgctgactctacctacatgccagttcaggcaaagggtgcagtgttcagcgct360gaagtggttccgtctgtgggtggccagactggttttgcggacatgcgcgctgcttatgat420gcactggatgaagacctgaaagctcgtgttgaaaccctgcaagcgcgtcactccctgcat480tactcccagtccaagctgggtcaccagaccaaagctgcggatggtgagtactctggttac540ggcctgcatgatggtccggttccgctgcgtccgctggtgaaaatccatccggaaactggc600cgcaaatccctgctgatcggccgtcatgcgcacgcgattccgggcctggaaccggctgag660tctgaacgtctgctgcaacagctgattgattttgcttgtcagccgccgcgtatctaccac720cacgactgggcgccgggtgatgcagtgctgtgggacaaccgctgcctgctgcaccaagcg780actccgtgggacatgacccagaaacgcatcatgtggcacagccgcattgcgggtgacccg840gcatctgagaccgcactggcacactaa867<210>6<211>22<212>prt<213>人工序列<220><223>aad-13ptu引物<400>6alathrglyglycysthrcysalathrglycysthrglycyscyscys151015thrcysalaglycyscys20<210>7<211>22<212>dna<213>人工序列<220><223>aad-13ptu引物<400>7cgggcaggcctaactccaccaa22當(dāng)前第1頁(yè)12當(dāng)前第1頁(yè)12