本發(fā)明涉及生物化工技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種低分子量肝素鈉的生產(chǎn)方法。

背景技術(shù)：

肝素是廣泛存在于動物器官和組織(如小腸粘膜、肺等)中提取的硫酸化的葡糖胺聚糖化合物，具有抗凝、抗炎、抗過敏、抗病毒、抗癌、降血脂等多種生物學(xué)功能。而低分子肝素是由普通肝素經(jīng)物理、化學(xué)或酶解聚方法而得，分子量范圍為3000～8000，具有較肝素更優(yōu)的抗血栓活性，且與肝素相比，出血副作用少、生物利用度高、半衰期長、抗凝效果可以預(yù)測且無需實驗室監(jiān)測，目前臨床適應(yīng)癥不斷擴大。

目前，低分子量肝素(包括低分子量肝素鈉和低分子量肝素鈣)的生產(chǎn)均是使用肝素鈉精品作為起始原料，通過降解得到的小分子肝素制品，具有生物利用率高、血漿半衰期長等優(yōu)點，特別是其引起的出血副作用大幅降低。目前，低分子量肝素(鈉)的生產(chǎn)制備多是以精品肝素鈉作為起始原料，制得低分子量肝素鈉的成本較高；現(xiàn)有技術(shù)cn103214596a公開了一種由肝素鈉粗品直接生產(chǎn)低分子量肝素鈉的方法，該方法采用肝素鈉粗品為原料制備低分子量肝素鈉，但是其制備工藝中僅使用超濾器對肝素中的蛋白等大分子物質(zhì)進行截留，這樣的處理工藝難免會使肝素鈉成品中殘留一定量的小分子蛋白等雜質(zhì)，使得最終低分子量肝素鈉的蛋白含量偏高，從而影響低分子量肝素鈉的質(zhì)量。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明提供了一種低分子量肝素鈉的生產(chǎn)方法。

本發(fā)明的技術(shù)方案為：

一種低分子量肝素鈉的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)稱取80～120g的粗品肝素鈉，用純化水溶解，并控制溶液溫度為30℃以下，攪拌溶解，制備成10％～20％(w/v)的粗品肝素鈉溶液；

(2)步驟(1)得到的粗品肝素鈉溶加入濃度為2％的nacl溶液，制成5％～10％(w/v)的粗品肝素鈉溶液，再加入堿性蛋白酶，于35～50℃下保溫酶解3～6h，得到酶解液；

(3)將步驟(2)所得酶解液升溫至90～96℃滅活，降溫至40～50℃，滴加naoh溶液調(diào)節(jié)ph為11～12，加入蒙脫土，攪拌后高速離心，取上層清液；

(4)將步驟(3)所得層清液降溫至0～4℃之間，加入聚合硅酸鋁鹽，用hcl溶液調(diào)節(jié)ph值至2～3，高速離心，棄去不溶雜質(zhì)；

(5)步驟(4)所得清液加naoh溶液調(diào)節(jié)ph為5.8～7.0，加入0.3～0.8倍溶液體積的無水乙醇沉淀，調(diào)整溫度至0～4℃，放置5～12h，收集沉淀物，并將沉淀物溶于4～8倍體積的蒸餾水中，完全溶解后，加入溶液體積0.5％～1.2％的過氧化氫氧化8～12h，用濾膜過濾，加入溶液體積2倍量的濃度為95％乙醇沉淀，沉淀放置6～15h，得到沉淀物；

(6)將步驟(5)所得沉淀物溶于蒸餾水中，攪拌下緩慢加入亞硝酸鈉降解肝素鈉，直至降解反應(yīng)結(jié)束，加入用氫氧化鈉，再加入硼氫化鈉對肝素鈉進行還原；

(7)在步驟(6)還原結(jié)束后使用超濾器進行大分子截留，超濾液中加入乙醇沉淀，用乙醇脫水干燥后即得低分子量肝素鈉。

進一步地，步驟(2)中，所述堿性蛋白酶用量為粗品肝素鈉溶液的0.5％～1％。

進一步地，步驟(3)中，所述蒙脫土的量為步驟(2)所得酶解液質(zhì)量的0.10～0.15％，所述蒙脫土的目粒度為150～650目。

進一步地，步驟(6)中，所述亞硝酸鈉降解肝素鈉的反應(yīng)條件為：hcl溶液調(diào)節(jié)ph值2.6～3.5，溫度15～22℃，添加亞硝酸鈉直至使用淀粉指示劑檢測溶液不變藍(lán)色為止。

進一步地，步驟(7)中，還原結(jié)束后采用1萬分子量的超濾器對大分子進行截留，調(diào)節(jié)超濾液的ph到6.2～7.0，再加入超濾液體積1.5倍的乙醇沉淀3～12小時，最后用濃度為95％的乙醇脫水干燥，即得低分子量肝素鈉。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術(shù)相比具有如下優(yōu)點：

1、本發(fā)明采用了超濾器進行大分子量的截留，使用超濾法也使得生產(chǎn)出的低分子量肝素中的殘留蛋白質(zhì)等大分子物質(zhì)一同被截留掉，提高了低分子量肝素的安全性。

2、本發(fā)明采用粗品肝素鈉作為原料制備低分子量肝素鈉，制備成本低；在制備低分子量肝素鈉的工藝中，使用堿性蛋白酶酶解粗品肝素鈉中含有的蛋白質(zhì)，目的是進一步純化肝素鈉；在肝素鈉粗品中，有部分肝素分子是和蛋白質(zhì)分子通過一定的化學(xué)鍵連接在一起的，在堿性蛋白酶的作用下，能水解這種連接，從而使肝素游離出來，進一步提高產(chǎn)品的收率，并且，有助于除去這部分蛋白質(zhì)，獲得純度更高的肝素鈉；使用蒙脫土對堿性蛋白進行加速吸附沉淀，蒙脫土對蛋白質(zhì)有吸附作用；選用絮凝劑中的聚合硅酸鋁鹽對酸性蛋白進行加速吸附沉淀，在低ph值條件下，聚合硅酸鋁鹽能快速吸附溶液中的酸性蛋白，采用蒙脫土及聚合硅酸鋁鹽吸附蛋白質(zhì)后再通過高速離心，能很好且更迅速的除去溶液中的各種蛋白成分；綜上所述，該粗品肝素鈉生產(chǎn)低分子量肝素鈉的方法的優(yōu)點是低分子量肝素鈉制備成本低，所得低分子量肝素鈉蛋白含量低、純度高，而且收率高。

具體實施方式

實施例1

本實施例提供一種低分子量肝素鈉的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)稱取80g的粗品肝素鈉，用純化水溶解，并控制溶液溫度為30℃以下，攪拌溶解，制備成10％(w/v)的粗品肝素鈉溶液；

(2)步驟(1)得到的粗品肝素鈉溶加入濃度為2％的nacl溶液，制成5％(w/v)的粗品肝素鈉溶液，在加入堿性蛋白酶，于35℃下保溫酶解3h，得到酶解液；

(3)將步驟(2)所得酶解液升溫至90℃滅活，降溫至40℃，滴加naoh溶液調(diào)節(jié)ph為11，加入蒙脫土，攪拌后高速離心，取上層清液；

(4)將步驟(3)所得層清液降溫至0℃之間，加入聚合硅酸鋁鹽，用hcl溶液調(diào)節(jié)ph值至2，高速離心，棄去不溶雜質(zhì)；

(5)步驟(4)所得清液加naoh溶液調(diào)節(jié)ph為5.8，加入0.3倍溶液體積的無水乙醇沉淀，調(diào)整溫度至0℃，放置5h，收集沉淀物，并將沉淀物溶于4倍體積的蒸餾水中，完全溶解后，加入溶液體積0.5％的過氧化氫氧化8h，用濾膜過濾，加入溶液體積2倍量的濃度為95％乙醇沉淀，沉淀放置6h，得到沉淀物；

(6)將步驟(5)所得沉淀物溶于蒸餾水中，攪拌下緩慢加入亞硝酸鈉降解肝素鈉，直至降解反應(yīng)結(jié)束，加入用氫氧化鈉，再加入硼氫化鈉對肝素鈉進行還原；

(7)在步驟(6)還原結(jié)束后使用超濾器進行大分子截留，超濾液中加入乙醇沉淀，用乙醇脫水干燥后即得低分子量肝素鈉。

進一步地，步驟(2)中，所述堿性蛋白酶用量為粗品肝素鈉溶液的0.5％。

進一步地，步驟(3)中，所述蒙脫土的量為步驟(2)所得酶解液質(zhì)量的0.10％，所述蒙脫土的目粒度為150目。

進一步地，步驟(6)中，所述亞硝酸鈉降解肝素鈉的反應(yīng)條件為：hcl溶液調(diào)節(jié)ph值2.6，溫度15℃，添加亞硝酸鈉直至使用淀粉指示劑檢測溶液不變藍(lán)色為止。

進一步地，步驟(7)中，還原結(jié)束后采用1萬分子量的超濾器對大分子進行截留，調(diào)節(jié)超濾液的ph到6.2，再加入超濾液體積1.5倍的乙醇沉淀3小時，最后用濃度為95％的乙醇脫水干燥，即得低分子量肝素鈉。

實施例2

一種低分子量肝素鈉的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)稱取120g的粗品肝素鈉，用純化水溶解，并控制溶液溫度為30℃以下，攪拌溶解，制備成20％(w/v)的粗品肝素鈉溶液；

(2)步驟(1)得到的粗品肝素鈉溶加入濃度為2％的nacl溶液，制成10％(w/v)的粗品肝素鈉溶液，在加入堿性蛋白酶，于50℃下保溫酶解6h，得到酶解液；

(3)將步驟(2)所得酶解液升溫至96℃滅活，降溫至50℃，滴加naoh溶液調(diào)節(jié)ph為12，加入蒙脫土，攪拌后高速離心，取上層清液；

(4)將步驟(3)所得層清液降溫至4℃之間，加入聚合硅酸鋁鹽，用hcl溶液調(diào)節(jié)ph值至3，高速離心，棄去不溶雜質(zhì)；

(5)步驟(4)所得清液加naoh溶液調(diào)節(jié)ph為7.0，加入0.8倍溶液體積的無水乙醇沉淀，調(diào)整溫度至4℃，放置12h，收集沉淀物，并將沉淀物溶于8倍體積的蒸餾水中，完全溶解后，加入溶液體積1.2％的過氧化氫氧化12h，用濾膜過濾，加入溶液體積2倍量的濃度為95％乙醇沉淀，沉淀放置15h，得到沉淀物；

(6)將步驟(5)所得沉淀物溶于蒸餾水中，攪拌下緩慢加入亞硝酸鈉降解肝素鈉，直至降解反應(yīng)結(jié)束，加入用氫氧化鈉，再加入硼氫化鈉對肝素鈉進行還原；

(7)在步驟(6)還原結(jié)束后使用超濾器進行大分子截留，超濾液中加入乙醇沉淀，用乙醇脫水干燥后即得低分子量肝素鈉。

進一步地，步驟(2)中，所述堿性蛋白酶用量為粗品肝素鈉溶液的1％。

進一步地，步驟(3)中，所述蒙脫土的量為步驟(2)所得酶解液質(zhì)量的0.15％，所述蒙脫土的目粒度為650目。

進一步地，步驟(6)中，所述亞硝酸鈉降解肝素鈉的反應(yīng)條件為：hcl溶液調(diào)節(jié)ph值3.5，溫度22℃，添加亞硝酸鈉直至使用淀粉指示劑檢測溶液不變藍(lán)色為止。

進一步地，步驟(7)中，還原結(jié)束后采用1萬分子量的超濾器對大分子進行截留，調(diào)節(jié)超濾液的ph到7.0，再加入超濾液體積1.5倍的乙醇沉淀12小時，最后用濃度為95％的乙醇脫水干燥，即得低分子量肝素鈉。

實施例3

一種低分子量肝素鈉的生產(chǎn)方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)稱取100g的粗品肝素鈉，用純化水溶解，并控制溶液溫度為30℃以下，攪拌溶解，制備成15％(w/v)的粗品肝素鈉溶液；

(2)步驟(1)得到的粗品肝素鈉溶加入濃度為2％的nacl溶液，制成8％(w/v)的粗品肝素鈉溶液，在加入堿性蛋白酶，于40℃下保溫酶解4.5h，得到酶解液；

(3)將步驟(2)所得酶解液升溫至93℃滅活，降溫至45℃，滴加naoh溶液調(diào)節(jié)ph為11.5，加入蒙脫土，攪拌后高速離心，取上層清液；

(4)將步驟(3)所得層清液降溫至3℃之間，加入聚合硅酸鋁鹽，用hcl溶液調(diào)節(jié)ph值至2.5，高速離心，棄去不溶雜質(zhì)；

(5)步驟(4)所得清液加naoh溶液調(diào)節(jié)ph為6.5，加入0.5倍溶液體積的無水乙醇沉淀，調(diào)整溫度至3℃，放置8h，收集沉淀物，并將沉淀物溶于6倍體積的蒸餾水中，完全溶解后，加入溶液體積0.8％的過氧化氫氧化10h，用濾膜過濾，加入溶液體積2倍量的濃度為95％乙醇沉淀，沉淀放置10h，得到沉淀物；

(6)將步驟(5)所得沉淀物溶于蒸餾水中，攪拌下緩慢加入亞硝酸鈉降解肝素鈉，直至降解反應(yīng)結(jié)束，加入用氫氧化鈉，再加入硼氫化鈉對肝素鈉進行還原；

(7)在步驟(6)還原結(jié)束后使用超濾器進行大分子截留，超濾液中加入乙醇沉淀，用乙醇脫水干燥后即得低分子量肝素鈉。

進一步地，步驟(2)中，所述堿性蛋白酶用量為粗品肝素鈉溶液的0.8％。

進一步地，步驟(3)中，所述蒙脫土的量為步驟(2)所得酶解液質(zhì)量的0.12％，所述蒙脫土的目粒度為400目。

進一步地，步驟(6)中，所述亞硝酸鈉降解肝素鈉的反應(yīng)條件為：hcl溶液調(diào)節(jié)ph值3.2，溫度18℃，添加亞硝酸鈉直至使用淀粉指示劑檢測溶液不變藍(lán)色為止。

進一步地，步驟(7)中，還原結(jié)束后采用1萬分子量的超濾器對大分子進行截留，調(diào)節(jié)超濾液的ph到6.8，再加入超濾液體積1.5倍的乙醇沉淀8小時，最后用濃度為95％的乙醇脫水干燥，即得低分子量肝素鈉。

以上所述實施例僅表達了本申請的具體實施方式，其描述較為具體和詳細(xì)，但并不能因此而理解為對本申請保護范圍的限制。應(yīng)當(dāng)指出的是，對于本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員來說，在不脫離本申請技術(shù)方案構(gòu)思的前提下，還可以做出若干變形和改進，這些都屬于本申請的保護范圍。