本項發(fā)明涉及的是一種生物制劑的制備方法，具體涉及一種利用枯草芽孢桿菌表達天蠶素ad的方法及其制備方法。

背景技術(shù)：

廣譜抗生素的大量使用不僅導(dǎo)致了耐藥菌在世界范圍內(nèi)頻繁出現(xiàn)，而且其在清除病原菌的同時也殺滅了正常細(xì)菌，對機體微生態(tài)平衡造成了嚴(yán)重破壞，在臨床上經(jīng)常出現(xiàn)繼發(fā)感染等負(fù)面后果?？咕囊云渥吭降目咕钚约蔼毺氐淖饔脵C制而倍受青睞。抗菌肽(antimicrobialpeptide，amp)，又稱為宿主防御肽(hostdefensepeptide，hdp)，是機體先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，是保護宿主抵御外源病菌侵入的屏障。抗菌肽來源廣泛，具有調(diào)節(jié)免疫，廣譜殺滅細(xì)菌、真菌、病毒、寄生蟲、癌細(xì)胞等多方面的生物學(xué)功能。此外，抗菌肽特殊的作用機制成為新一代抗菌藥物的潛質(zhì)。天蠶素ad是人工設(shè)計的由天蠶素a的n端1～11片段和天蠶素d的c端12～37片段組成的雜合肽，據(jù)測定，化學(xué)合成的天蠶素ad，其殺菌活性和抗茵譜都明顯高于天然抗茵肽(殺菌活性是抗茵肽d的5～55倍，對枯草桿菌的活性是抗菌肽a的6倍)目前已有多種方法被用于天蠶抗菌肽ad的基因表達，但都存在成本較高、分離純化困難的問題。

獲取抗菌肽主要通過以下途徑，一是從生物體內(nèi)直接提取、二是應(yīng)用化學(xué)合成技術(shù)生產(chǎn)，三是通過基因工程技術(shù)進行制備。但由于天然抗菌肽含量少，直接提取不僅難度大還受到技術(shù)的限制；化學(xué)合成成本高，很難形成規(guī)?；a(chǎn)。隨著基因工程技術(shù)的成熟，通過重組技術(shù)表達外源蛋白成為可能，因此借助基因工程技術(shù)手段，構(gòu)建生物反應(yīng)器實現(xiàn)抗菌肽的規(guī)?；畠r生產(chǎn)，最終實現(xiàn)抗菌肽的廣泛應(yīng)用，對于促進綠色農(nóng)業(yè)與畜牧業(yè)發(fā)展有重要意義。本項發(fā)明選用枯草芽孢桿菌做為表達宿主菌，表達系統(tǒng)中使用高效啟動子pglv，利用廉價無污染且容易獲得的麥芽糖作為誘導(dǎo)劑成功的表達了抗菌肽cad。為今后開發(fā)全新高效抗菌肽類飼料添加劑提供理論基礎(chǔ)與實驗依據(jù)。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

基于以上不足之處，本發(fā)明的目的在于提供一種利用枯草芽孢桿菌表達天蠶素ad的方法及其制備方法，利用基因工程技術(shù)在枯草芽孢桿菌中表達了天蠶素ad。

本發(fā)明所采用的技術(shù)如下：一種利用枯草芽孢桿菌表達天蠶素ad的方法，如下：

(1)、基因合成：人工設(shè)計編碼目的基因片段，在天蠶素ad基因上游融合信號肽spsacb基因、六個組氨酸基因、sumo標(biāo)簽，并在5’端加上ecori酶切位點，在3’端加上終止密碼子和bamhi酶切位點，整條融合基因spsacb-6×his-sumo-cecropinad，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示；

(2)、表達質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化：表達載體以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pgj148作為骨架，啟動子為麥芽糖啟動子pglv，以基因缺陷型菌株枯草芽孢桿菌wb800n作為表達宿主菌，利用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將重組載體直接轉(zhuǎn)化到表達宿主菌枯草芽孢桿菌wb800n中，表達產(chǎn)物經(jīng)過純化蛋白酶切后進行tricine-sds-page定性和質(zhì)譜檢測分析，實現(xiàn)融合蛋白的表達。

本發(fā)明還具有如下技術(shù)特征：一種利用枯草芽孢桿菌制備天蠶素ad的方法，如下：

(1)、人工設(shè)計編碼目的基因片段，在天蠶素ad基因上游融合信號肽spsacb基因、六個組氨酸基因、sumo標(biāo)簽，并在5’端加上ecori酶切位點，在3’端加上終止密碼子和bamhi酶切位點，整條融合基因spsacb-6×his-sumo-cecropinad，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示；

(2)、表達載體以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pgj148作為骨架，啟動子為麥芽糖啟動子pglv，以基因缺陷型菌株枯草芽孢桿菌wb800n作為表達宿主菌，利用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將重組載體直接轉(zhuǎn)化到表達宿主菌枯草芽孢桿菌wb800n中，表達產(chǎn)物經(jīng)過純化蛋白酶切后進行tricine-sds-page定性和質(zhì)譜檢測分析，實現(xiàn)融合蛋白的表達；

(3)、誘導(dǎo)發(fā)酵

分別挑取陽性重組子單菌落分別接種于含氯霉素、新霉素各10μg/ml的10mllb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm條件下過夜振蕩培養(yǎng)，按體積比為1％的接種量轉(zhuǎn)接到50ml新鮮lb培養(yǎng)基中，37℃，220rpm條件下振蕩培養(yǎng)，發(fā)酵4h后加入最終質(zhì)量濃度為6％的麥芽糖后進行誘導(dǎo)表達，48h后收集菌液上清；

(4)、融合蛋白的純化

收集菌液上清后混合5×binddingbuffer，binddingbuffer含有20mmtris、500mmnacl、和20mm咪唑，過ni-nta柱，用含20mm、50mm、100mm、200mm、300mm、500mm咪唑的washingbuffer，進行梯度洗脫；

(5)、純化

將純化后的融合蛋白在sumo酶切buffer中透析后，進行4℃過夜酶切，將酶切體系過ni-nta，重組蛋白在穿流液中獲得，用去離子水透析，凍干后即獲得重組蛋白純品。

本發(fā)明的有益效果及優(yōu)點如下：

1、本發(fā)明將sumo分子伴侶與抗菌肽ad融合，可促進抗菌肽ad正確折疊，融合狀態(tài)下抗菌肽沒有活性，對宿主菌不會產(chǎn)生殺滅作用，單獨表達小分子蛋白時得率低，不易于表達，與sumo融合后可提高目的蛋白的得率，還融合6*his標(biāo)簽，便于后期的分離純化，利用鎳柱與his形成螯合物，使得目的蛋白易于與其他雜蛋白分離。后期純化的融合蛋白在sumo蛋白酶特異性識別后可準(zhǔn)確切割下標(biāo)簽，釋放具有活性的抗菌肽ad。

2、本發(fā)明選擇的強分泌型信號肽scab，有效增強抗菌肽ad的可溶性，并分泌到胞外培養(yǎng)基中，利于分離純化。

3、本發(fā)明選用價格低廉且安全高效的麥芽糖誘導(dǎo)型啟動子pglv，具有巨大的實際應(yīng)用價值。

4、宿主枯草芽孢桿菌為蛋白酶缺陷菌株，敲除npre、nprb、apre、mpr、bpf、vpr、wpra、ner八種蛋白酶基因，酶活力比野生菌株大大降低，分泌的重組蛋白不易被自身蛋白酶降解，同時容易進行感受態(tài)轉(zhuǎn)化，具有新霉素抗性可以作為遺傳標(biāo)記，便于篩選，簡化篩選過程。

附圖說明

圖1為重組表達載體構(gòu)建測序結(jié)果圖；

圖2為重組表達載體酶切鑒定結(jié)果圖；

圖3為融合蛋白梯度洗脫結(jié)果圖。

具體實施方式

下面舉例對本發(fā)明做進一步說明：

實施例1

一種利用枯草芽孢桿菌表達天蠶素ad的方法，如下：

(1)、基因合成：人工設(shè)計編碼目的基因片段，在天蠶素ad基因上游融合信號肽spsacb基因、六個組氨酸基因、sumo標(biāo)簽，并在5’端加上ecori酶切位點，在3’端加上終止密碼子和bamhi酶切位點，整條融合基因spsacb-6×his-sumo-cecropinad，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示；

(2)、表達質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化：表達載體以大腸桿菌-枯草芽孢桿菌穿梭載體pgj148作為骨架，啟動子為麥芽糖啟動子pglv，以基因缺陷型菌株枯草芽孢桿菌wb800n作為表達宿主菌，利用化學(xué)轉(zhuǎn)化方法將重組載體直接轉(zhuǎn)化到表達宿主菌枯草芽孢桿菌wb800n中，表達產(chǎn)物經(jīng)過純化蛋白酶切后進行tricine-sds-page定性和質(zhì)譜檢測分析，實現(xiàn)融合蛋白的表達。

本實施例將帶有信號肽sacb、蛋白標(biāo)簽6×his-sumo的目的基因連接到大腸-枯草穿梭表達載體pgj148上，利用化學(xué)方法將質(zhì)粒轉(zhuǎn)入到枯草芽孢桿菌wb800n感受態(tài)細(xì)胞中，陽性轉(zhuǎn)化子經(jīng)雙酶切及測序驗證，驗證正確后在誘導(dǎo)劑麥芽糖的作用下，實現(xiàn)融合蛋白的表達。

實施例2

一種利用枯草芽孢桿菌制備天蠶素ad的方法，如下：

1、基因合成

天蠶素ad的氨基酸序列為：kwklfkkiekvgqrvrdavisagpavatvaqatalak，人工設(shè)計編碼基因片段，并在5’端加上ecori酶切位點、信號肽spsacb、6×his標(biāo)簽、sumo，在3’端加上終止密碼子和bamhi酶切位點，整條融合基因spsacb-6×his-sumo-cecropinad，其核苷酸序列如seqidno.1所示，其氨基酸序列如seqidno.2所示，基因合成由北京六合華大基因科技有限公司完成。

2、表達質(zhì)粒的構(gòu)建及轉(zhuǎn)化

1)將人工合成的編碼基因克隆到枯草芽孢桿菌表達載體上，構(gòu)建重組表達載體，構(gòu)建的重組表達載體通過單雙酶切和測序進行陽性篩選；

2)將目的基因合表達載體的鏈接體系利用化學(xué)方法轉(zhuǎn)化到表達宿主菌枯草芽孢桿菌wb800n中，篩選陽性克隆并進行表達。產(chǎn)物純化后經(jīng)tricine-sds-page定性、考馬斯亮藍定量分析以及質(zhì)譜定性分析。

3、誘導(dǎo)發(fā)酵

分別挑取陽性重組子單菌落分別接種于含氯霉素、新霉素各10μg/ml的10mllb培養(yǎng)基中，37℃，225rpm條件下過夜振蕩培養(yǎng)。按1％的接種量轉(zhuǎn)接到50ml新鮮lb培養(yǎng)基中，37℃，225rpm條件下振蕩培養(yǎng)。發(fā)酵4h后加入終質(zhì)量濃度為6％的麥芽糖后進行誘導(dǎo)表達，48h后收集菌液上清。

4、融合蛋白的純化

收集菌液上清后混合5×binddingbuffer，含有20mmtris、500mmnacl、20mm咪唑，過ni-nta柱，用含20mm、50mm、100mm、200mm、300mm、500mm咪唑的washingbuffer，進行梯度洗脫。

5、純化

將純化后的融合蛋白在sumo酶切buffer中透析后，進行4℃過夜酶切，將酶切體系過ni-nta，重組蛋白在穿流液中獲得，用去離子水透析，凍干后即獲得重組蛋白純品。

本實施例以枯草芽孢桿菌wb800n為宿主菌株，大腸-枯草穿梭載體為表達載體，設(shè)計合成融合蛋白編碼基因(spsacb)sumo-cad，成功構(gòu)建重組表達載體pgj148-(psacb)sumo-cad。應(yīng)用化學(xué)轉(zhuǎn)化方式轉(zhuǎn)入宿主菌感受態(tài)細(xì)胞中，利用麥芽糖誘導(dǎo)發(fā)酵，實現(xiàn)外源蛋白成功表達，通過ni-nta柱和蛋白質(zhì)純化分析儀純化后獲得了純度較高的融合蛋白，利用sumo酶切后獲得重組抗菌肽，之后對發(fā)酵條件進行優(yōu)化，確定最佳初始發(fā)酵培養(yǎng)基及最佳發(fā)酵條件，為進一步擴大發(fā)酵提供理論依據(jù)。

＜110＞東北農(nóng)業(yè)大學(xué)

＜120＞利用枯草芽孢桿菌表達天蠶素ad的方法及其制備方法

＜160＞2

＜210＞1

＜211＞534

＜212＞dna

＜213＞人工序列

＜400＞1

gaattcatgaacatcaagaaatttgctaaacaggcaacggtcctgacgttcacgaccgca60

ctcttggcaggaggagcaactcaagctttcgctcaccatcatcatcatcacatgagtgat120

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＜210＞2

＜211＞173

＜212＞prt

＜213＞人工序列

＜400＞2

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