【技術領域】

本發(fā)明屬于天然香料研究開發(fā)領域，特別涉及一種印度毛霉菌還原肉桂醛制備天然3-苯丙醇的方法。

背景技術：

肉桂醛是典型的α,β-不飽和醛，其加氫反應主要有兩條路線：路線1是先加氫生成肉桂醇，再進一步加氫生成3-苯丙醇；路線2是先加氫生成3-苯丙醛，再進一步加氫生成3-苯丙醇。在化學催化肉桂醛的加氫反應中，由于c＝o鍵與c＝c鍵氫化的競爭反應，導致兩條路線同時進行，得到的產(chǎn)物往往是肉桂醇、3-苯丙醛和3-苯丙醇的混合物(見“appliedcatalysisa:general”2000,(192):247-251,zhangy,etal.)。而微生物催化肉桂醛加氫反應的還原產(chǎn)物通常是肉桂醇(見“化工進展”2009,28(8):1431-1434,馬麗等)。若要進一步加氫生成3-苯丙醇，則需再次加入微生物發(fā)酵液或濕菌體進行二次反應(見“廣西大學”2013:62,張笮晦)。3-苯丙醇又名氫化肉桂醇、利膽醇，是制備香料、藥物的重要中間體，可用于合成如選擇性5-羥色胺重攝取抑制劑鹽酸達泊西汀(見“中國藥物化學雜志”2011,21(1):37-39,尹玲麗等)。天然3-苯丙醇產(chǎn)量低，僅存在于草莓、安息香膏、茶葉、桂油等中，在國際市場上供不應求。3-苯丙醇在工業(yè)上通常由肉桂酸乙酯催化加氫制得，收率可達85％，其缺點是需用大量乙醚對反應后的濾液進行提取，對環(huán)境不友好。

本發(fā)明人在科學實驗中偶然發(fā)現(xiàn)，以從自然界獲得的一種微生物的濕菌體為還原劑，能將肉桂醛連續(xù)還原生成3-苯丙醇。經(jīng)鑒定：該微生物為印度毛霉菌mucorindicus，并命名為mucorindicusxj33。于是，我們將自己篩選純化的印度毛霉菌mucorindicusxj33用于還原肉桂醛的研究，確定了其還原肉桂醛制備天然3-苯丙醇的生產(chǎn)工藝。為微生物法制備肉桂醛衍生物的“天然品”提供參考。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題是提供一種印度毛霉菌還原肉桂醛制備3-苯丙醇的方法，以解決化學合成的3-苯丙醇用于食品、醫(yī)藥及化妝品時其安全性收到質(zhì)疑等問題。本發(fā)明首次利用自行篩選的印度毛霉菌濕菌體作為生物還原劑連續(xù)還原肉桂醛制備天然3-苯丙醇，菌株培養(yǎng)簡單，反應條件溫和，環(huán)境友好，采用本發(fā)明方法制備得到的3-苯丙醇屬于“天然品”范疇，其安全性優(yōu)于化學合成的3-苯丙醇，具有良好的工業(yè)化應用前景。

為了解決以上技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案：

一種印度毛霉菌還原肉桂醛制備天然3-苯丙醇的方法，其特征在于，包括以下步驟：

s1：將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的微生物菌株xj33接種于已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)液中。所述培養(yǎng)液包括以下成分：葡萄糖、蛋白胨、酵母膏、磷酸氫二鉀、氯化鈉、七水合硫酸鎂、七水合硫酸亞鐵。在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為180r/min下培養(yǎng)72h，制得xj33發(fā)酵液；

s2：將步驟s1制得的xj33發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體；

s3：將步驟s2制得的xj33濕菌體分散于緩沖溶液中，加入輔助底物，再加入肉桂醛，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為180r/min下轉(zhuǎn)化72h，制得轉(zhuǎn)化液；

s4：將步驟s3制得的轉(zhuǎn)化液抽濾，加入等體積萃取劑進行萃取1～2次，經(jīng)減壓蒸餾回收萃取劑后，制得含3-苯丙醇的油狀物。

進一步地，步驟s1中所述微生物菌株為印度毛霉菌。

進一步地，步驟s1中所述培養(yǎng)液包括以下成分：葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l。

進一步地，步驟s3中所述的xj33濕菌體質(zhì)量濃度為20～100g/l。

進一步地，步驟s3中所述緩沖溶液為磷酸鹽緩沖溶液。

進一步地，所述磷酸鹽緩沖溶液的ph值為6～8。

進一步地，步驟s3中所述肉桂醛的質(zhì)量濃度為2.096～4.192g/l。

進一步地，步驟s3中所述輔助底物為葡萄糖、乙醇、蔗糖中的一種。

進一步地，所述輔助底物的質(zhì)量濃度為10～50g/l。

進一步地，步驟s4中所述萃取劑為乙酸乙酯。

本發(fā)明具有以下有益效果：

本發(fā)明首次利用自行篩選的印度毛霉菌xj33濕菌體作為生物還原劑連續(xù)還原肉桂醛制備3-苯丙醇。菌株培養(yǎng)簡單，反應條件溫和，環(huán)境友好，采用本發(fā)明方法制備得到的3-苯丙醇屬于“天然品”范疇，其安全性優(yōu)于化學合成的3-苯丙醇，具有良好的工業(yè)化應用前景。

【具體實施方式】

為便于更好地理解本發(fā)明，通過以下實施例加以說明，這些實施例屬于本發(fā)明的保護范圍，但不限制本發(fā)明的保護范圍。

在實施例中，所述印度毛霉菌還原肉桂醛制備天然3-苯丙醇的方法，包括以下步驟：

s1：將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的印度毛霉菌xj33接種于已滅菌的發(fā)酵培養(yǎng)液中，所述培養(yǎng)液包括以下成分：葡萄糖30g/l、蛋白胨30g/l、酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速180r/min下培養(yǎng)72h，制得印度毛霉菌xj33發(fā)酵液；

s2：將步驟s1制得的發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體；

s3：將步驟s2制得的質(zhì)量濃度為20～100g/l的xj33濕菌體分散于ph值為6.0～8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入質(zhì)量濃度為10～50g/l的輔助底物，所述輔助底物為葡萄糖、乙醇、蔗糖中的一種，再加入質(zhì)量濃度為2.096～4.192g/l的肉桂醛，在溫度為30℃，轉(zhuǎn)速為180r/min下轉(zhuǎn)化72h，制得轉(zhuǎn)化液；

s4：將步驟s3制得的轉(zhuǎn)化液抽濾，加入等體積乙酸乙酯進行萃取1～2次，經(jīng)減壓蒸餾回收乙酸乙酯后，制得含3-苯丙醇的油狀物。

下面通過更具體實施例對本發(fā)明進行說明。

本發(fā)明的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33是一種屬于真菌類印度毛霉菌屬的菌株，該菌株是從土壤中分離，并先后經(jīng)過肉桂醛耐受性篩選和還原肉桂醛能力的篩選的多輪篩選獲得的，根據(jù)16srdna分子生物學鑒定，該菌與印度毛霉菌菌(mucorindicus)的同源性為100％。

實施例1

將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l)，30℃下恒溫培養(yǎng)振蕩器(180r/min)培養(yǎng)72h，得到xj33發(fā)酵液。將發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體。將40g/l濕菌體分散到100mlph6.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min^-1，反應72h，得到轉(zhuǎn)化液。

實施例2

將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l)，30℃下恒溫培養(yǎng)振蕩器(180r/min)培養(yǎng)72h，得到xj33發(fā)酵液。將發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體。將40g/l濕菌體分散到100mlph8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min^-1，反應72h，得到轉(zhuǎn)化液。

實施例3

將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l)，30℃下恒溫培養(yǎng)振蕩器(180r/min)培養(yǎng)72h，得到xj33發(fā)酵液。將發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體。將20g/l濕菌體分散到100mlph8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min^-1，反應72h，得到轉(zhuǎn)化液。

實施例4

將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l)，30℃下恒溫培養(yǎng)振蕩器(180r/min)培養(yǎng)72h，得到xj33發(fā)酵液。將發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體。將80g/l濕菌體分散到100mlph8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min^-1，反應72h，得到轉(zhuǎn)化液。

實施例5

將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l)，30℃下恒溫培養(yǎng)振蕩器(180r/min)培養(yǎng)72h，得到xj33發(fā)酵液。將發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體。將80g/l濕菌體分散到100mlph8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入30g/l蔗糖作為輔助底物，再加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min^-1，反應72h，得到轉(zhuǎn)化液。

實施例6

將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l)，30℃下恒溫培養(yǎng)振蕩器(180r/min)培養(yǎng)72h，得到xj33發(fā)酵液。將發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體。將80g/l濕菌體分散到100mlph8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入30g/l乙醇作為輔助底物，再加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min^-1，反應72h，得到轉(zhuǎn)化液。

實施例7

將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l)，30℃下恒溫培養(yǎng)振蕩器(180r/min)培養(yǎng)72h，得到xj33發(fā)酵液。將發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體。將80g/l濕菌體分散到100mlph8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入30g/l葡萄糖作為輔助底物，再加入2.096g/l肉桂醛，在30℃，180r·min^-1，反應72h，得到轉(zhuǎn)化液。

實施例8

將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l)，30℃下恒溫培養(yǎng)振蕩器(180r/min)培養(yǎng)72h，得到xj33發(fā)酵液。將發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體。將80g/l濕菌體分散到100mlph8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入10g/l葡萄糖作為輔助底物，再加入2.62g/l肉桂醛，在30℃，180r·min^-1，反應72h，得到轉(zhuǎn)化液。

實施例9

將一環(huán)斜面培養(yǎng)基上的印度毛霉菌(mucorindicus)xj33接種到已滅菌的100ml發(fā)酵培養(yǎng)液中(葡萄糖30g/l，蛋白胨20g/l，酵母膏2.5g/l、磷酸氫二鉀1g/l、氯化鈉0.5g/l、七水合硫酸鎂0.5g/l、七水合硫酸亞鐵0.01g/l)，30℃下恒溫培養(yǎng)振蕩器(180r/min)培養(yǎng)72h，得到xj33發(fā)酵液。將發(fā)酵液抽濾，得到xj33濕菌體。將80g/l濕菌體分散到100mlph8.0的磷酸鹽緩沖溶液中，加入10g/l葡萄糖作為輔助底物，再加入4.192g/l肉桂醛，在30℃，180r·min^-1，反應72h，得到轉(zhuǎn)化液。

分別取實施例1-9的轉(zhuǎn)化液抽濾，用等體積乙酸乙酯萃取1次，減壓蒸餾至1～2ml后制得含3-苯丙醇的油狀物，所述油狀物用乙酸乙酯定容于10ml容量瓶。取0.6μl用gc進行定量分析，并用gc-ms進行定性分析，分析條件如下：

色譜條件：色譜柱：rxi-5sil(30m×0.25mm×0.25μm)；進樣口溫度：250℃；程序升溫過程：柱初溫100℃，保留1min，以5℃/min升至200℃，保留1min，再以8℃/min升至250℃；分流比1:30。

質(zhì)譜條件：電子轟擊(ei)離子源，電離能量70ev，電子倍增器電壓1.5kv，全掃描方式。

定性及定性分析：根據(jù)總離子流圖，應用nist08、nist08s質(zhì)譜庫檢索，確認了還原產(chǎn)物為3-苯丙醇。采用外標法，配制一系列不同濃度的3-苯丙醇標準溶液進行gc色譜分析。以各濃度標準溶液的峰面積對其質(zhì)量濃度(μg/ml)進行線性回歸，得到回歸方程，計算3-苯丙醇的得率，結(jié)果見表1。

表1實施例1-9中3-苯丙醇的得率及其性能

由表1可見，采用本發(fā)明的方法制備的3-苯丙醇得率較高，從實施例4與實施例5-8制備的3-苯丙醇得率可知，輔助底物(蔗糖、乙醇、葡萄糖)的加入能顯著提高3-苯丙醇的得率。同時所得3-苯丙醇屬于“天然品”范疇，其安全性優(yōu)于化學合成的3-苯丙醇，具有良好的工業(yè)化應用前景。

以上內(nèi)容不能認定本發(fā)明的具體實施只局限于這些說明，對于本發(fā)明所屬技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明構(gòu)思的前提下，還可以做出若干簡單推演或替換，都應當視為屬于本發(fā)明由所提交的權利要求書確定的專利保護范圍。