本發(fā)明涉及重組蛋白表達(dá)領(lǐng)域，尤其涉及一種在畢赤酵母內(nèi)表達(dá)蛋白的方法。

背景技術(shù)：

目前畢赤酵母表達(dá)系統(tǒng)，通常采用aox1啟動(dòng)子進(jìn)行外源基因的表達(dá)，且目的基因整合到酵母染色體。aox1啟動(dòng)子表達(dá)量相對(duì)原核系統(tǒng)t7啟動(dòng)子普遍低很多，不同菌落之間由于外源基因整合差異，導(dǎo)致表達(dá)量差異大，往往需要耗費(fèi)數(shù)月的時(shí)間來篩選合適的表達(dá)菌株，且在傳代過程中外源基因丟失的情況普遍。相對(duì)來講，提高酵母表達(dá)系統(tǒng)的產(chǎn)量，簡化表達(dá)菌株篩選過程具有重要意義。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決上述缺陷，本發(fā)明的主要目的在于提供一種在畢赤酵母內(nèi)表達(dá)蛋白的方法，本發(fā)明在畢赤酵母內(nèi)使用t7轉(zhuǎn)錄系統(tǒng)來表達(dá)蛋白，轉(zhuǎn)錄效率高，表達(dá)蛋白量大，所述方法無需篩選高表達(dá)的菌株，耗費(fèi)時(shí)間短。

為了達(dá)到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種在畢赤酵母內(nèi)表達(dá)蛋白的方法，包括如下步驟：

(1)根據(jù)酵母細(xì)胞偏愛密碼子優(yōu)化原始t7rna聚合酶基因序列；優(yōu)化后的t7rna聚合酶基因序列如seqidno:1所示；按照優(yōu)化的序列合成上、下游帶酶切位點(diǎn)的t7聚合酶基因片段；

(2)將所述合成的t7rna聚合酶基因片段克隆到組成型畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pgapza中，構(gòu)建得到pgapza-rnap質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母表達(dá)菌株，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)t7rna聚合酶的菌株；

(3)將外源基因克隆至表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化至步驟(2)中所得的穩(wěn)定表達(dá)t7rna聚合酶的菌株，以及表達(dá)蛋白。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(1)中，所述t7rna聚合酶為t7噬菌體rna聚合酶。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(1)中，所述酶切位點(diǎn)包括：上游加入ecori酶切位點(diǎn)以及下游加入xhoi酶切位點(diǎn)。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(1)中，所述合成為全基因合成。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(2)中，所述篩選為zeocin篩選。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(2)中，所述菌株選自畢赤酵母gs115、x33菌株。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(3)中，所述表達(dá)載體按照載體序列表順序進(jìn)行基因合成，并通過酶切連接形成環(huán)狀質(zhì)粒。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(3)中，表達(dá)載體序列如seqidno:2所示。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(3)中，所述表達(dá)載體具有酵母復(fù)制起始序列2μori、t7啟動(dòng)子、ires、多克隆位點(diǎn)、抗性基因、大腸桿菌復(fù)制起始序列pucori的元件。

作為進(jìn)一步的優(yōu)選，所述步驟(3)中，所述抗性基因原核為kana，真核階段為neo。

本發(fā)明的有益效果是：本發(fā)明選用的t7啟動(dòng)子/rna聚合酶的載體系統(tǒng)，可應(yīng)用于外源基因在畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)，基因在畢赤酵母細(xì)胞中受到t7噬菌體rna聚合酶轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄效率高，表達(dá)蛋白量大；本發(fā)明使用非整合型表達(dá)，目的基因插入本發(fā)明所述表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入穩(wěn)定表達(dá)t7rna聚合酶的畢赤酵母宿主，加入適當(dāng)抗性物質(zhì)篩選，即可表達(dá)蛋白，聚合酶不需要高表達(dá)，因此無需對(duì)不同菌落進(jìn)行篩選，只需要篩出一個(gè)能表達(dá)的菌株就可以，簡化了步驟，耗費(fèi)時(shí)間大大縮短。

附圖說明

圖1為使用本發(fā)明實(shí)施例方法表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞圖。

圖2為使用對(duì)比實(shí)施例方法表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞圖。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例表達(dá)載體的元件圖譜。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明實(shí)施例通過提供一種在畢赤酵母內(nèi)表達(dá)蛋白的方法，解決了現(xiàn)有蛋白表達(dá)量低，步驟復(fù)雜，耗費(fèi)時(shí)間長等缺陷。

為了解決上述缺陷，本發(fā)明實(shí)施例的主要思路是：

本發(fā)明實(shí)施例在畢赤酵母內(nèi)表達(dá)蛋白的方法，包括如下步驟：

(1)根據(jù)酵母細(xì)胞偏愛密碼子優(yōu)化原始t7rna聚合酶基因序列；優(yōu)化后的t7rna聚合酶基因序列如seqidno:1所示；按照優(yōu)化的序列合成兩端帶酶切位點(diǎn)的t7聚合酶基因片段；

(2)將所述合成的t7rna聚合酶基因片段克隆到組成型畢赤酵母表達(dá)質(zhì)粒pgapza中，構(gòu)建得到pgapza-rnap質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)化至畢赤酵母表達(dá)菌株，篩選獲得穩(wěn)定表達(dá)t7rna聚合酶的菌株；

(3)將外源基因克隆至表達(dá)載體的多克隆位點(diǎn)上，轉(zhuǎn)化至步驟(2)中所得的穩(wěn)定表達(dá)t7rna聚合酶的菌株，以及表達(dá)蛋白；

表達(dá)載體序列見序列表如seqidno:2所示。其中的元件改造的思路如下：在pyes2載體基礎(chǔ)上，去掉pgal1以及t7啟動(dòng)子，插入t7-ev71ires序列。將pyes2載體上kana基因及啟動(dòng)子終止子，替換成ppic9k的kan以及啟動(dòng)子、終止子，以便于在原核和真核階段分別用卡那霉素和g418抗性篩選，保持質(zhì)粒的穩(wěn)定性。改造后的結(jié)果為序列含有t7啟動(dòng)子，可以用于t7噬菌體聚合酶對(duì)下游片段的的轉(zhuǎn)錄起始，t7啟動(dòng)子下游含有ev71ires序列，為轉(zhuǎn)錄后的mrna提供核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，用于核糖體的翻譯起始。下游為his標(biāo)簽，用于表達(dá)蛋白的標(biāo)簽純化，下游為polya尾序列位點(diǎn)，不用加尾，直接生成含polya尾mrna序列.有利于提高mrna的壽命，延長翻譯時(shí)間，提高表達(dá)量。t7終止子起到終止轉(zhuǎn)錄的作用。

所述步驟(1)中，使用t7rna聚合酶基因序列(geneabank登錄號(hào)am946981.1)在不改變野生型t7rna聚合酶氨基酸序列的前提下，將每個(gè)氨基酸的密碼子替換成畢赤酵母物細(xì)胞中使用頻率最高或次高的，同時(shí)避免局部出現(xiàn)連續(xù)多個(gè)的gc、at，并保證g+c含量在30％-70％之間。通過全基因合成該序列。所述表達(dá)載體能夠在原核細(xì)菌和真核的酵母菌中進(jìn)行復(fù)制，可以使用t7轉(zhuǎn)錄酶轉(zhuǎn)錄t7啟動(dòng)子后的基因。

為了讓本發(fā)明之上述和其它目的、特征、和優(yōu)點(diǎn)能更明顯易懂，下文特舉實(shí)施例，來說明本發(fā)明所述之在畢赤酵母內(nèi)表達(dá)蛋白的方法。

實(shí)施例1

本發(fā)明實(shí)施例1在畢赤酵母內(nèi)表達(dá)蛋白的方法，包括如下步驟：

1.密碼子優(yōu)化

使用t7rna聚合酶基因序列(geneabank登錄號(hào)am946981.1)在不改變野生型t7rna聚合酶氨基酸序列的前提下，將每個(gè)氨基酸的密碼子替換成酵母細(xì)胞中使用頻率最高或次高的，同時(shí)避免局部出現(xiàn)連續(xù)多個(gè)的gc、at，并保證g+c含量在30％-70％之間。最后在這段基因上游加入ecori酶切位點(diǎn)、下游加入xhoi酶切位點(diǎn)。序列見序列表seqidno:1所示。密碼子優(yōu)化及全基因合成均在申請(qǐng)人公司完成。待優(yōu)化序列生成后，通過visualgenedeveloper軟件，進(jìn)一步確認(rèn)優(yōu)化前后mrna二級(jí)結(jié)構(gòu)及自由能。

2.pgapza-rnap質(zhì)粒構(gòu)建

構(gòu)建t7-rnap的真核表達(dá)載體：通過ecori/xhoi酶切位點(diǎn)雙酶切pgapza真核表達(dá)載體上，回收后線形化的pgapza大片段，取5μgecori/xhoi酶切過的上述t7rna聚合酶基因與約100ngpgapza大片段、用t4dna連接酶按常規(guī)方法進(jìn)行連接反應(yīng)，連接后轉(zhuǎn)化大腸桿菌dh5α，利用卡那霉素抗性基因篩選陽性克隆，得到pgapza-rnap，并進(jìn)行dna測(cè)序。

3.rnap/gs115穩(wěn)定表達(dá)菌株構(gòu)建

(1)制備線性化pgapza-rnap:①saci-hf酶切pgapza-rnap，酶切反應(yīng)體系:saci1μl，dna1μg，10×nebuffer5μl，ddh2o補(bǔ)至50μl；反應(yīng)溫度37℃；反應(yīng)時(shí)間10min；②瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證酶切后dna；③乙醇沉淀法回收線性化dna；(2)制備畢赤酵母感受態(tài)，氯化鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化pgapza-rnap至畢赤酵母x33中，參考畢赤酵母表達(dá)載體操作手冊(cè)(invitrogen公司，catalogno.v190-20)。將氯化鋰轉(zhuǎn)化后得到的菌液涂布于zeocin(100μg/ml)抗性的ypd培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑單菌落小量搖菌擴(kuò)增后取少量進(jìn)行菌液pcr、電泳測(cè)序驗(yàn)證。

4.制備穩(wěn)定表達(dá)t7噬菌體rna聚合酶的酵母感受態(tài)細(xì)胞

方法參考畢赤酵母表達(dá)載體操作手冊(cè)(invitrogen公司，catalogno.v190-20)。

5.表達(dá)載體全基因合成

基因合成一個(gè)含有酵母復(fù)制起始序列2μori、t7啟動(dòng)子、ires、多克隆位點(diǎn)、kan和neo的抗性基因、大腸桿菌復(fù)制起始序列pucori等元件的表達(dá)載體；序列如seqidno:2所示。合成的基因通過酶切連接成一個(gè)環(huán)形的質(zhì)粒。

圖3為本發(fā)明實(shí)施例表達(dá)載體的元件圖譜。

6.ppyt7-egfp蛋白克隆構(gòu)建

設(shè)計(jì)引物pegfp-f:aagaaggggtatctctcgagaaaagaatgg

tgagcaagggcgag3’；pegfp-r:5’gccgccgcggctcgactttact

tgtacagctcgtc3’，從pcdna3.1-egfp中擴(kuò)增egfp基因，

反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃2min；擴(kuò)增:變性95℃30s，退火溫度65℃至53℃，步長0.5℃/循環(huán)30s，延伸72℃45s，30個(gè)循環(huán)；冷卻12℃；切膠回收步驟5的ppyt7載體和egfp基因產(chǎn)物；通過雙酶切將標(biāo)志蛋白egfp蛋白基因插入ppyt7質(zhì)粒，通過建立克隆反應(yīng)體系:①按說明加入適量ppyt7線性化載體、目標(biāo)插入片段egfp、10×連接buffer1μl、連接酶1μl、ddh2o補(bǔ)至10μl；②25℃溫育15min；在冰上保存直至轉(zhuǎn)化或－20℃長期保存；轉(zhuǎn)化大腸桿菌，用卡那霉素篩選陽性克隆，鑒定；

7.ppyt7-egfp蛋白表達(dá)

轉(zhuǎn)化:①向50μlrnap/gs115感受態(tài)細(xì)胞懸液中分別加入1μlppyt7-egfp，在冰浴中靜置30min；②將離心管置于電轉(zhuǎn)儀上，插入電極進(jìn)行電轉(zhuǎn)，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴上，使細(xì)胞冷卻2～3min；③加入900μl無菌的soc培養(yǎng)基，混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45min(150rpm/min)；④吸取100μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含低鹽lb+g418(25μg/μl)固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)；⑤培養(yǎng)12～16小時(shí)后，挑選單菌落，用pegfp-f、pegfp-r引物對(duì)菌落行pcr驗(yàn)證，對(duì)pcr驗(yàn)證成功的菌落提質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證。對(duì)于轉(zhuǎn)化ppyt7-egfp蛋白質(zhì)粒成功的菌株，培養(yǎng)酵母，表達(dá)蛋白。將經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證的x33-egfp接種于mmh培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)2天后，取少量菌至pbs中，制成菌懸液，于全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)下觀察。

圖1為使用本發(fā)明實(shí)施例方法表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞圖。

對(duì)比實(shí)施例

1.畢赤酵母表達(dá)載體ppiczb-egfp構(gòu)建步驟如下:

(1)xhoⅰ酶切質(zhì)粒ppicz-b(3597bp)；

(2)用primestar酶、ppic-egfp-f、ppic-egfp-r引物通過touchdownpcr從pcdna3.1-egfp中擴(kuò)增egfp基因，反應(yīng)條件:預(yù)變性95℃2min；擴(kuò)增:變性95℃30s，退火溫度65℃至53℃，步長0.5℃/循環(huán)30s，延伸72℃45s，30個(gè)循環(huán)；冷卻12℃；

(3)切膠回收步驟(1)和(2)產(chǎn)物；

(4)建立in-fusion克隆反應(yīng)體系:①按說明加入適量ppiczb線性化載體、目標(biāo)插入片段egfp、10×clonasebuffer1μl、in-fusion^tmclonase1μl、ddh2o補(bǔ)至10μl；②25℃溫育15min；在冰上保存直至轉(zhuǎn)化或－20℃長期保存；

(5)轉(zhuǎn)化:①向50μl感受態(tài)細(xì)胞懸液中分別加入1μlppiczb-egfp，在冰浴中靜置30min；②將離心管置于42℃水浴中放置60～90s，然后快速將管轉(zhuǎn)移到冰浴上，使細(xì)胞冷卻2～3min；③加入900μl無菌的soc培養(yǎng)基，混勻后置于37℃搖床振蕩培養(yǎng)45min(150rpm/min)；④吸取100μl已轉(zhuǎn)化的感受態(tài)細(xì)胞加到含低鹽lb+zeocin(25μg/μl)固體培養(yǎng)基上，37℃培養(yǎng)；⑤培養(yǎng)12～16小時(shí)后，挑選單菌落，用5-aox、3-aox引物對(duì)菌落行pcr驗(yàn)證，對(duì)pcr驗(yàn)證成功的菌落提質(zhì)粒，并測(cè)序驗(yàn)證。

2.畢赤酵母x33-egfp的構(gòu)建步驟如下:

(1)制備線性化ppicz-egfp:①saci-hf酶切ppicz-egfp，酶切反應(yīng)體系:saci1μl，dna1μg，10×nebuffer5μl，ddh2o補(bǔ)至50μl；反應(yīng)溫度37℃；反應(yīng)時(shí)間10min；②瓊脂糖凝膠電泳驗(yàn)證酶切后dna；③乙醇沉淀法回收線性化dna；

(2)制備畢赤酵母感受態(tài)，氯化鋰轉(zhuǎn)化法轉(zhuǎn)化ppiczb-egfp至畢赤酵母x33中，參考畢赤酵母表達(dá)載體操作手冊(cè)(invitrogen公司，catalogno.v190-20)。將氯化鋰轉(zhuǎn)化后得到的菌液涂布于zeocin(100μg/ml)抗性的ypd培養(yǎng)基篩選培養(yǎng)，挑單菌落小量搖菌擴(kuò)增后取少量進(jìn)行菌液pcr、電泳測(cè)序驗(yàn)證。

3.誘導(dǎo)aox1啟動(dòng)子的啟動(dòng)及觀察egfp蛋白的表達(dá)將經(jīng)過測(cè)序驗(yàn)證的x33-egfp接種于mmh培養(yǎng)基中37℃培養(yǎng)2天后，取少量菌至pbs中，制成菌懸液，于全自動(dòng)倒置熒光顯微鏡藍(lán)光激發(fā)下觀察。

圖2為使用對(duì)比實(shí)施例方法表達(dá)綠色熒光蛋白的細(xì)胞圖。

上述本申請(qǐng)實(shí)施例中的技術(shù)方案，至少具有如下的技術(shù)效果或優(yōu)點(diǎn)：

本發(fā)明選用的t7啟動(dòng)子/rna聚合酶的載體系統(tǒng)，可應(yīng)用于外源基因在畢赤酵母細(xì)胞中的表達(dá)，基因在畢赤酵母細(xì)胞中受到t7噬菌體rna聚合酶轉(zhuǎn)錄，轉(zhuǎn)錄效率高，表達(dá)蛋白量大；本發(fā)明使用非整合型表達(dá)，目的基因插入本發(fā)明所述表達(dá)載體，轉(zhuǎn)入穩(wěn)定表達(dá)t7rna聚合酶的畢赤酵母宿主，加入適當(dāng)抗性物質(zhì)篩選，即可表達(dá)蛋白，聚合酶不需要高表達(dá)，因此無需對(duì)不同菌落進(jìn)行篩選，只需要篩出一個(gè)能表達(dá)的菌株就可以，簡化了步驟，耗費(fèi)時(shí)間大大縮短。

盡管已描述了本發(fā)明的優(yōu)選實(shí)施例，但本領(lǐng)域內(nèi)的技術(shù)人員一旦得知了基本創(chuàng)造性概念，則可對(duì)這些實(shí)施例作出另外的變更和修改。所以，所附權(quán)利要求意欲解釋為包括優(yōu)選實(shí)施例以及落入本發(fā)明范圍的所有變更和修改。顯然，本領(lǐng)域的技術(shù)人員可以對(duì)本發(fā)明進(jìn)行各種改動(dòng)和變型而不脫離本發(fā)明的精神和范圍。這樣，倘若本發(fā)明的這些修改和變型屬于本發(fā)明權(quán)利要求及其等同技術(shù)的范圍之內(nèi)，則本發(fā)明也意圖包含這些改動(dòng)和變型在內(nèi)。

<110>武漢金開瑞生物工程有限公司

<120>一種在畢赤酵母內(nèi)表達(dá)蛋白的方法

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