本發(fā)明涉及多糖食品分離提純技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)β-葡聚糖的純化方法以及β-葡聚糖。

背景技術(shù)：

β-葡聚糖是一種可溶性食物纖維，β-1.3，β-1.4糖昔鍵連接起來的粘性多聚葡聚糖，是一種非淀粉多糖，按其溶解性分可為水溶性和水不溶性兩類。在糧食中，β-葡聚糖是種子構(gòu)成胚乳細(xì)胞壁的主要成分，而且?guī)缀踉谡麄€(gè)種子中分布。

β-葡聚糖具有調(diào)節(jié)血糖、降低膽固醇、提高免疫力、抗腫瘤等作用。不同的生物材料由于其結(jié)構(gòu)成分的差異，導(dǎo)致提取的質(zhì)量和效率不同。

目前，從糧食中提取β-葡聚糖的報(bào)道較少，一般多為從谷物中提取β-葡聚糖，提取方法多為利用水、酸化水或堿溶液作為溶劑將全部碾碎的谷物制成漿液，再通過過濾、離心和乙醇沉淀的技術(shù)來處理這些漿液以分離各種組分。以上方法存在的技術(shù)問題主要有：(1)水不溶性β-葡聚糖的嚴(yán)重流失；(2)提純?chǔ)?葡聚糖的得率較低；(3)提取物中混雜的較多淀粉和蛋白質(zhì)，造成β-葡聚糖的純度大大下降；(4)工藝路線復(fù)雜，難以工業(yè)化應(yīng)用。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

為了解決現(xiàn)有技術(shù)存在的問題，本發(fā)明的一個(gè)目的是提供一種用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)β-葡聚糖的純化方法，以解決現(xiàn)有β-葡聚糖得率低、純度低、提純工藝復(fù)雜的問題。本發(fā)明的另一個(gè)目的是提供一種β-葡聚糖，其純度高，制備工藝簡單。

本發(fā)明解決上述技術(shù)問題的技術(shù)方案如下：提供一種用于產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)β-葡聚糖的純化方法，包括：

(1)將粉碎后的糧食作物用無水乙醇進(jìn)行加熱回流提取處理，將提取液過濾后得到第一濾液和第一濾渣，將第一濾渣進(jìn)行脫溶處理；

(2)將經(jīng)脫溶處理后的第一濾渣加水混合，并進(jìn)行離心分離，得到第二濾液；

(3)將所述第一濾液和所述第二濾液合并后濃縮至原體積的1/5～1/10；然后向濃縮液中加入2u/g～8u/g的淀粉酶，反應(yīng)體系持續(xù)升溫至65～75℃，調(diào)節(jié)溶液ph至3～5，離心分離，收集濾液，重復(fù)此過程1-3次；再次調(diào)節(jié)濾液的ph至8～10，加入2u/g～6u/g的蛋白酶，在36～37.5℃條件下恒溫水浴2～3h；在溫度為90～100℃的條件下進(jìn)行滅酶，冷卻至室溫后離心分離，得到第三濾液；以及

(4)將第三濾液進(jìn)行除雜處理，得到β-葡聚糖。

本發(fā)明用無水乙醇對粉碎后的糧食作物進(jìn)行加熱回流提取的目的在于，提取出水不溶性β-葡聚糖，避免了因直接用水提取而導(dǎo)致水不溶性β-葡聚糖不溶于水而造成水不不溶性β-葡聚糖流失，從而提高β-葡聚糖的得率。

得到的第一濾液即為水不溶性β-葡聚糖，并且將第一濾渣經(jīng)過脫溶處理后進(jìn)一步提純?chǔ)?葡聚糖，后續(xù)提純主要針對水溶性β-葡聚糖進(jìn)行的。在步驟(2)中涉及的脫溶處理工藝，其目的在于除去步驟(1)中使用的無水乙醇，避免雜質(zhì)的引入，從而保證最終產(chǎn)品純度。

本發(fā)明將經(jīng)過兩次提取后的第一濾液和第二濾液合并，并用淀粉酶和蛋白酶進(jìn)行酶解，去除合并濾液中的淀粉和蛋白質(zhì)，此方式與現(xiàn)有提取工藝相比，方法簡單、易于控制，并且提純效果好。

本發(fā)明在步驟(3)中第一次調(diào)節(jié)溶液ph的目的在于，使?jié)饪s后的濾液在酸性環(huán)境下沉淀析出混合有淀粉和蛋白質(zhì)的β-葡聚糖。同時(shí)，在淀粉酶的作用下，混合在濾液中的淀粉被酶解，使得淀粉與β-葡聚糖分離，對β-葡聚糖進(jìn)行分離提純。本發(fā)明的淀粉酶可以是α-淀粉酶、β-淀粉酶、γ-淀粉酶和異淀粉酶中的一種或多種。優(yōu)選地，本發(fā)明的淀粉酶為α-淀粉酶。

本發(fā)明在步驟(3)中第二次調(diào)節(jié)ph的目的在于，為蛋白酶提供堿性的反應(yīng)環(huán)境，從而酶解掉混合在濾液中的蛋白質(zhì)，進(jìn)一步提純分離β-葡聚糖。本發(fā)明的蛋白酶可以是胰蛋白酶、組織蛋白酶、木瓜蛋白酶和枯草桿菌蛋白酶中的一種或多種。優(yōu)選地，本發(fā)明的蛋白酶為胰蛋白酶。

本發(fā)明在酶解反應(yīng)后滅酶，以去除濾液中的淀粉酶和蛋白酶，避免引入新的雜質(zhì)，從而保證最終產(chǎn)品的純度。

與現(xiàn)有提取工藝相比，本發(fā)明首先利用醇溶的方式，回收糧食作物中的水不溶性β-葡聚糖，避免了糧食作物中水不溶性β-葡聚糖的流失，然后通過酶解去除作物中的淀粉和蛋白質(zhì)，能耗低、分離效果好。本發(fā)明工藝簡單、易于操作控制、成本低、有利于工業(yè)化生產(chǎn)。

在上述技術(shù)方案的基礎(chǔ)上，本發(fā)明還可以做如下改進(jìn)：

進(jìn)一步地，在本法明較佳的實(shí)施例中，上述步驟(1)包括以下具體步驟：

(11)將粉碎后的糧食作物過100～500μm篩；

(12)取步驟(11)中的篩下物，在4～10倍體積量的無水乙醇中、在60℃～80℃下回流提取2～4h，冷卻至室溫后過濾，得到第一濾液和第一濾渣；以及

(13)將第一濾渣于30℃～60℃下減壓脫溶15～30h。

進(jìn)一步地，在本法明較佳的實(shí)施例中，上述步驟(2)包括以下具體步驟：

將經(jīng)脫溶處理后的第一濾渣加入至6～10倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，并調(diào)至ph至9～11，然后將溶液在30℃～60℃下攪拌20～40分鐘，冷卻至室溫后離心分離，得到第二濾液。

優(yōu)選地，在步驟(2)用0.5～3mol/l的氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)溶液的ph至9～11。本發(fā)明通過調(diào)節(jié)溶液ph至9～11，使得水溶性β-葡聚糖完全溶解出來。

進(jìn)一步地，在本法明較佳的實(shí)施例中，上述步驟(4)包括以下具體步驟：

(41)將第三濾液中加入活性炭并在溫度為20～60℃的條件下脫色處理20～40min，將收集的洗淋液在3～5℃下靜置，得到粗提液；

(42)將粗提液加入到3～5倍體積的去離子水中，加熱至30℃～50℃，攪拌溶解，然后加入沉淀劑溶液在30℃～50℃攪拌10～30min，離心分離；以及

(43)將步驟(42)中離心分離得到的沉淀在10℃～60℃下減壓脫溶10～35h，得到β-葡聚糖。

在去除淀粉以及蛋白質(zhì)等主要雜質(zhì)后，本發(fā)明通過活性炭、沉淀劑溶液繼續(xù)分離提純，進(jìn)一步提高β-葡聚糖的純度，提高最終產(chǎn)品品質(zhì)。

進(jìn)一步地，在本法明較佳的實(shí)施例中，上述步驟(42)中的沉淀劑溶液為乙醇、異丙醇和硫酸銨中的一種或幾種。

進(jìn)一步地，在本法明較佳的實(shí)施例中，上述步驟(43)中，將沉淀減壓脫溶處理后的物料過500～800μm篩。

進(jìn)一步地，在本法明較佳的實(shí)施例中，上述離心分離的轉(zhuǎn)速為1000～4000轉(zhuǎn)/min。

一種β-葡聚糖，是將糧食作物根據(jù)上述的純化方法提取而成。

本發(fā)明具有以下有益效果：

1、本發(fā)明利用醇溶的方式，回收水不溶性β-葡聚糖，以提高得率；

2、本發(fā)明采用酶法脫淀粉和蛋白的方式，具有能耗低，單級分離效率高，分離過程簡單，不污染環(huán)境等優(yōu)點(diǎn)；

3、選用溶劑沉淀法進(jìn)一步提純?chǔ)?葡聚糖，能夠明顯提高β-葡聚糖的純度；

4、本發(fā)明的工藝簡單，操作易于控制，成本低，易于工業(yè)化。

具體實(shí)施方式

以下對本發(fā)明的原理和特征進(jìn)行描述，所舉實(shí)例只用于解釋本發(fā)明，并非用于限定本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過市售購買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。

需要說明的是，本發(fā)明實(shí)施例所指的“減壓脫溶”是指在低于常壓下進(jìn)行脫溶處理，具體壓力大小不做限制。

實(shí)施例1：

本實(shí)施例的純化方法包括以下步驟：

①將糧食籽粒凈選，淘洗，去除雜質(zhì)，進(jìn)行干燥，并控制水分在<8％；

②將糧食經(jīng)磨粉機(jī)粉碎后，過100μm篩；

③將步驟②中的碎粉用4倍體積的50％(體積百分比，下同)無水乙醇，在60℃下回流提取4個(gè)小時(shí)，使非水溶性β-葡聚糖溶解，同時(shí)在90℃下滅活各種酶；冷卻至室溫后，過濾，收集濾液；過濾后得到的濾渣用2倍體積量的無水乙醇繼續(xù)提取15分鐘，過濾，收集濾液并將兩次提取的濾液合并，得到第一濾液；將兩次提取后得到的第一濾渣于30℃下減壓脫溶30小時(shí)，使糧食碎粉中的乙醇完全揮發(fā)而達(dá)到脫溶目的。

④將步驟③中脫溶的第一濾渣加入到6倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，并用2mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至ph9，于30℃下攪拌40分鐘，使水溶性β-葡聚糖溶解；冷卻至室溫后，離心分離，收集的濾液；將離心分離所得沉淀繼續(xù)加入到2倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，用2mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至ph9，于30℃下攪拌40分鐘，冷卻、離心分離，并將兩次合并，得到第二濾液。

⑤合并第一濾液和第二濾液，將濾液濃縮至原體積的1/5，加入4u/g的α-淀粉酶，反應(yīng)體系持續(xù)升溫至70℃，再用3mol/l鹽酸溶液調(diào)節(jié)濾液ph至4.5，離心分離，收集濾液。

⑥用2mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)步驟⑤中的濾液至ph9，加入2u/g的胰蛋白酶，37℃條件下，恒溫水浴2h，酶解后90°加熱滅酶，冷卻至室溫后離心分離，收集濾液為第三濾液。

⑦將0.5％的活性炭加入至第三濾液中，調(diào)節(jié)溫度在20℃，脫色40min，收集淋洗液，4℃下靜置過夜，得粗提液。

⑧將步驟⑦的粗提液加入到3倍體積的去離子水中，加熱至30℃，攪拌溶解，然后加入同體積的無水乙醇，于45℃攪拌20分鐘，離心分離；沉淀于60℃下減壓脫溶10小時(shí)，過800μm篩，得精制β-葡聚糖。

經(jīng)“β-葡聚糖含量測定方法”分析，測定該精制β-葡聚糖的純度為72％，得率為9.9％。

實(shí)施例2：

本實(shí)施例的純化方法包括以下步驟：

①將糧食籽粒凈選，淘洗，去除雜質(zhì)，進(jìn)行干燥，并控制水分在<8％；

②將糧食經(jīng)磨粉機(jī)粉碎后，過100μm篩；

③將步驟②中的碎粉用4倍體積的65％無水乙醇，在70℃下回流提取3個(gè)小時(shí)，使非水溶性β-葡聚糖溶解，同時(shí)在90℃下滅活各種酶；冷卻至室溫后，過濾，收集濾液；過濾后得到的濾渣用5倍體積量的無水乙醇繼續(xù)提取15分鐘，過濾，收集濾液并將兩次提取的濾液合并，得到第一濾液；將兩次提取后得到的第一濾渣于40℃下減壓脫溶25小時(shí)，使糧食碎粉中的乙醇完全揮發(fā)而達(dá)到脫溶目的。

④將步驟③中脫溶的第一濾渣加入到8倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，并用3mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至ph10，于40℃下攪拌30分鐘，使水溶性β-葡聚糖溶解；冷卻至室溫后，離心分離，收集的濾液；將離心分離所得沉淀繼續(xù)加入到8倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，用3mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至ph10，于40℃下攪拌30分鐘，冷卻、離心分離，并將兩次合并，得到第二濾液。

⑤合并第一濾液和第二濾液，將濾液濃縮至原體積的1/8，加入4u/g的α-淀粉酶，反應(yīng)體系持續(xù)升溫至70℃，再用0.5mol/l鹽酸溶液調(diào)節(jié)濾液ph至4.5，離心分離，收集濾液。

⑥用0.5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)步驟⑤中的濾液至ph10，加入2u/g的胰蛋白酶，37℃條件下，恒溫水浴2.5h，酶解后100°加熱滅酶，冷卻至室溫后離心分離，收集濾液為第三濾液。

⑦將2％的活性炭加入至第三濾液中，調(diào)節(jié)溫度在40℃，脫色20min，收集淋洗液，3℃下靜置過夜，得粗提液。

⑧將步驟⑦的粗提液加入到4倍體積的去離子水中，加熱至40℃，攪拌溶解，然后加入同體積的無水乙醇，于40℃攪拌20分鐘，離心分離；沉淀于10℃下減壓脫溶35小時(shí)，過500μm篩，得精制β-葡聚糖。

經(jīng)“β-葡聚糖含量測定方法”分析，測定該精制β-葡聚糖的純度為81％，得率為10.7％。

實(shí)施例3：

本實(shí)施例的純化方法包括以下步驟：

①將糧食籽粒凈選，淘洗，去除雜質(zhì)，進(jìn)行干燥，并控制水分在<8％；

②將糧食經(jīng)磨粉機(jī)粉碎后，過400μm篩；

③將步驟②中的碎粉用10倍體積的80％無水乙醇，在80℃下回流提取2個(gè)小時(shí)，使非水溶性β-葡聚糖溶解，同時(shí)在90℃下滅活各種酶；冷卻至室溫后，過濾，收集濾液；過濾后得到的濾渣用4倍體積量的無水乙醇繼續(xù)提取20分鐘，過濾，收集濾液并將兩次提取的濾液合并，得到第一濾液；將兩次提取后得到的第一濾渣于50℃下減壓脫溶25小時(shí)，使糧食碎粉中的乙醇完全揮發(fā)而達(dá)到脫溶目的。

④將步驟③中脫溶的第一濾渣加入到8倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，并用0.5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至ph10，于50℃下攪拌25分鐘，使水溶性β-葡聚糖溶解；冷卻至室溫后，離心分離，收集的濾液；將離心分離所得沉淀繼續(xù)加入到2倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，用0.5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至ph10，于50℃下攪拌25分鐘，冷卻、離心分離，并將兩次合并，得到第二濾液。

⑤合并第一濾液和第二濾液，將濾液濃縮至原體積的1/10，加入4u/g的α-淀粉酶，反應(yīng)體系持續(xù)升溫至75℃，再用3mol/l鹽酸溶液調(diào)節(jié)濾液ph至5，離心分離，收集濾液。加入α-淀粉酶進(jìn)行酶解反應(yīng)的過程進(jìn)行兩次。

⑥用2mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)步驟⑤中的濾液至ph8～10，加入2u/g的胰蛋白酶，36℃條件下，恒溫水浴3h，酶解后90°加熱滅酶，冷卻至室溫后離心分離，收集濾液為第三濾液。

⑦將2.5％的活性炭加入至第三濾液中，調(diào)節(jié)溫度在60℃，脫色40min，收集淋洗液，5℃下靜置過夜，得粗提液。

⑧將步驟⑦的粗提液加入到3倍體積的去離子水中，加熱至30℃，攪拌溶解，然后加入同體積的無水乙醇，于45℃攪拌20分鐘，離心分離；沉淀于40℃下減壓脫溶20小時(shí)，過800μm篩，得精制β-葡聚糖。

經(jīng)“β-葡聚糖含量測定方法”分析，測定該精制β-葡聚糖的純度為61％，得率為7.8％。

實(shí)施例4：

本實(shí)施例的純化方法包括以下步驟：

①將糧食籽粒凈選，淘洗，去除雜質(zhì)，進(jìn)行干燥，并控制水分在<8％；

②將糧食經(jīng)磨粉機(jī)粉碎后，過500μm篩；

③將步驟②中的碎粉用9倍體積的50％無水乙醇，在60℃下回流提取4個(gè)小時(shí)，使非水溶性β-葡聚糖溶解，同時(shí)在90℃下滅活各種酶；冷卻至室溫后，過濾，收集濾液；過濾后得到的濾渣用5倍體積量的無水乙醇繼續(xù)提取20分鐘，過濾，收集濾液并將兩次提取的濾液合并，得到第一濾液；將兩次提取后得到的第一濾渣于45℃下減壓脫溶18小時(shí)，使糧食碎粉中的乙醇完全揮發(fā)而達(dá)到脫溶目的。

④將步驟③中脫溶的第一濾渣加入到8倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，并用2.5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至ph11，于30℃下攪拌40分鐘，使水溶性β-葡聚糖溶解；冷卻至室溫后，離心分離，收集的濾液；將離心分離所得沉淀繼續(xù)加入到4倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，用2.5mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至ph11，于50℃下攪拌25分鐘，冷卻、離心分離，并將兩次合并，得到第二濾液。

⑤合并第一濾液和第二濾液，將濾液濃縮至原體積的1/10，加入4u/g的α-淀粉酶，反應(yīng)體系持續(xù)升溫至75℃，再用2.5mol/l鹽酸溶液調(diào)節(jié)濾液ph至5，離心分離，收集濾液。

⑥用2mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)步驟⑤中的濾液至ph9，加入2u/g的胰蛋白酶，37.5℃條件下，恒溫水浴2.5h，酶解后90°加熱滅酶，冷卻至室溫后離心分離，收集濾液為第三濾液。

⑦將2％的活性炭加入至第三濾液中，調(diào)節(jié)溫度在60℃，脫色20min，收集淋洗液，4℃下靜置過夜，得粗提液。

⑧將步驟⑦的粗提液加入到4倍體積的去離子水中，加熱至50℃，攪拌溶解，然后加入同體積的硫酸胺溶液，于45℃攪拌15分鐘，離心分離；沉淀于50℃下減壓脫溶20小時(shí)，過700μm篩，得精制β-葡聚糖。

經(jīng)“β-葡聚糖含量測定方法”分析，測定該精制β-葡聚糖的純度為89％，得率為11.2％。

實(shí)施例5：

本實(shí)施例的純化方法包括以下步驟：

①將糧食籽粒凈選，淘洗，去除雜質(zhì)，進(jìn)行干燥，并控制水分在<8％；

②將糧食經(jīng)磨粉機(jī)粉碎后，過400μm篩；

③將步驟②中的碎粉用5倍體積的80％無水乙醇，在75℃下回流提取3個(gè)小時(shí)，使非水溶性β-葡聚糖溶解，同時(shí)在90℃下滅活各種酶；冷卻至室溫后，過濾，收集濾液；過濾后得到的濾渣用6倍體積量的無水乙醇繼續(xù)提取20分鐘，過濾，收集濾液并將兩次提取的濾液合并，得到第一濾液；將兩次提取后得到的第一濾渣于50℃下減壓脫溶25小時(shí)，使糧食碎粉中的乙醇完全揮發(fā)而達(dá)到脫溶目的。

④將步驟③中脫溶的第一濾渣加入到6倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，并用2mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至ph10，于50℃下攪拌25分鐘，使水溶性β-葡聚糖溶解；冷卻至室溫后，離心分離，收集的濾液；將離心分離所得沉淀繼續(xù)加入到6倍體積量的水中攪拌混勻形成溶液，用2mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)至ph10，于45℃下攪拌35分鐘，冷卻、離心分離，并將兩次合并，得到第二濾液。

⑤合并第一濾液和第二濾液，將濾液濃縮至原體積的1/8，加入4u/g的α-淀粉酶，反應(yīng)體系持續(xù)升溫至70℃，再用4mol/l鹽酸溶液調(diào)節(jié)濾液ph至3，離心分離，收集濾液。此過程進(jìn)行3次。

⑥用2mol/l氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)步驟⑤中的濾液至ph8，加入2u/g的胰蛋白酶，37℃條件下，恒溫水浴2h，酶解后90°加熱滅酶，冷卻至室溫后離心分離，收集濾液為第三濾液。

⑦將0.5％的活性炭加入至第三濾液中，調(diào)節(jié)溫度在40℃，脫色25min，收集淋洗液，4℃下靜置過夜，得粗提液。

⑧將步驟⑦的粗提液加入到4倍體積的去離子水中，加熱至40℃，攪拌溶解，然后加入同體積的無水乙醇和異丙醇的混合溶液，于30℃攪拌30分鐘，離心分離；沉淀于30℃下減壓脫溶25小時(shí)，過600μm篩，得精制β-葡聚糖。

經(jīng)“β-葡聚糖含量測定方法”分析，測定該精制β-葡聚糖的純度為78％，得率為12.7％。

需要說明的是，本發(fā)明實(shí)施例中的糧食可以是稻谷、小麥、玉米、西紅柿或青稞。優(yōu)選地，本發(fā)明實(shí)施例采用的糧食籽粒為使用申請?zhí)枮?01610347813.7的植物增效劑種植出的稻谷，其富含豐富的β-葡聚糖，在提取過程中，能夠獲得相較于普通作物更多的β-葡聚糖。

以上所述僅為本發(fā)明的較佳實(shí)施例，并不用以限制本發(fā)明，凡在本發(fā)明的精神和原則之內(nèi)，所作的任何修改、等同替換、改進(jìn)等，均應(yīng)包含在本發(fā)明的保護(hù)范圍之內(nèi)。