本申請為2008年6月30日提交的、發(fā)明名稱為“促使長dsrna可用于哺乳動物和其他所選動物細(xì)胞中的基因?qū)ぐ小钡膒ct申請pct/us2008/068866的分案申請，所述pct申請進(jìn)入中國國家階段的日期為2010年3月1日，申請?zhí)枮?00880105142.7。

相關(guān)申請的交叉引用

本申請要求2007年6月29日提交的美國臨時專利申請系列號60/947,311的優(yōu)先權(quán)和權(quán)益，所述臨時專利申請的內(nèi)容完整引入作為參考。

背景技術(shù)：

rna干擾(rnai)是真核生物中基因特異性沉默的催化機(jī)制，其對生物學(xué)和醫(yī)學(xué)具有深遠(yuǎn)的意義。然而，此類基因?qū)ぐ械挠行C(jī)制的誘導(dǎo)物在哺乳動物細(xì)胞和非哺乳動物細(xì)胞中截然不同。

長的雙鏈rna(dsrna)引發(fā)線蟲(c.elegans)和黑腹果蠅(drosophilamelanogaster)中有效的序列特異性基因沉默。相反，由于干擾素相關(guān)途徑的激活，長dsrna在哺乳動物細(xì)胞中誘導(dǎo)非序列特異性應(yīng)答。認(rèn)為rnai機(jī)制在哺乳動物細(xì)胞中沒有功能，直至發(fā)現(xiàn)了sirna雙鏈體。

使用短干擾rna(sirna)選擇性靶向用于降解的信使rna(mrna)，導(dǎo)致通過降解目的mrna沉默或敲減待表達(dá)的基因。通常sirna為20-25個核苷酸長的雙鏈rna(dsrna)，在其每條鏈上具有一些未配對的突出端堿基?；谠撃Ｐ?，使用sirna的分子生物學(xué)技術(shù)已經(jīng)成為研究工具和用于治療的候選者(dykxhoorn,novina&sharp.nat.rev.mol.cellbiol.4:457-467(2003)；kim&rossi,naturerev.genet.8:173-184(2007)；defougerolles,等naturerev.drugdiscov.6:443-453(2007))。

在廣泛用于哺乳動物細(xì)胞中基因沉默的同時，sirna已經(jīng)引起了限制rnai在生物醫(yī)學(xué)研究和rna治療開發(fā)中的潛力的許多問題。不像非哺乳動物細(xì)胞中的長dsrna，設(shè)計sirna已經(jīng)證明是困難的。首先，在基因序列內(nèi)，僅某些序列基序可以作為sirna的模板起作用。盡管過去的這些年發(fā)展了許多算法，但鑒定這些基序幾乎是反復(fù)試驗的過程。第二，不像非哺乳動物細(xì)胞中的長dsrna，sirna在哺乳動物細(xì)胞中具有大體上很低的基因沉默效率(reynoldsa等naturebiotech22:326,2004；a.defougerolles等,natrevdrugdiscov6,443(2007).)。找到沿mrna的高效sirna基序是困難的，并且對于一些mrna是不可能的，因為在mrna中含有幾乎無限多的20-25nt的可能基序。第三，設(shè)計完sirna后，負(fù)電荷sirna到哺乳動物細(xì)胞的遞送已經(jīng)證明是一項艱巨的挑戰(zhàn)(licx,等cellcycle5:2103-2109(2006))。

高度期望某技術(shù)是否能夠在哺乳動物細(xì)胞中使用長dsrna。由于強(qiáng)烈的細(xì)胞先天免疫應(yīng)答，如非特異性干擾(ifn)應(yīng)答，迄今為止沒有報道過在直接向靶哺乳動物細(xì)胞中引入外源長dsrna的成功事例。(yang,s.等mol.cell.biol.21:7807-7816(2001))。

發(fā)明概述

在一個實施方案中，本發(fā)明通過使用細(xì)菌介導(dǎo)系統(tǒng)為上述問題提供解決方案。細(xì)菌先天免疫應(yīng)答不應(yīng)答的長dsrna，并可作為“屏蔽”起作用，以便預(yù)防或減輕哺乳動物細(xì)胞對長dsrna的強(qiáng)烈先天免疫應(yīng)答。根據(jù)本發(fā)明，細(xì)菌作為中間媒介，通過進(jìn)行制備、處理并向靶哺乳動物細(xì)胞(例如哺乳動物或其他真核細(xì)胞)呈現(xiàn)加工的長dsrna及其產(chǎn)物的工作來解決長dsrna和哺乳動物細(xì)胞之間的不相容性，由此避免強(qiáng)烈的先天免疫應(yīng)答。為了完成該過程，用分別編碼長dsrna的載體轉(zhuǎn)化具有細(xì)胞侵入性質(zhì)的細(xì)菌，所述長dsrna包括與靶真核或病毒基因的信使rna(mrna)序列基本上互補(bǔ)的序列。在一個實施方案中，所述dsrna是非編碼或不編碼蛋白質(zhì)的。當(dāng)含有長dsrna及其代謝產(chǎn)物的這些細(xì)菌侵入宿主細(xì)胞時，此類rna雙鏈體的混合物與細(xì)胞表面上的免疫感受器的識別隔離。當(dāng)細(xì)菌最終向哺乳動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中釋放表達(dá)的rna時，一些或全部表達(dá)的長dsrna很可能已經(jīng)經(jīng)過細(xì)菌和哺乳動物切酶和/或切酶樣酶加工成了短rna雙鏈體的混合物。因為其具有覆蓋mrna的幾乎所有基序的巨大多樣性，已經(jīng)通過哺乳動物酶和細(xì)胞器進(jìn)一步加工的一些細(xì)菌內(nèi)容物將開始作為產(chǎn)生多種程度基因沉默效應(yīng)的基因沉默rna起作用。因此，靶真核或病毒基因的表達(dá)被有效降低。在一個實施方案中，基因沉默可歸因于由細(xì)菌轉(zhuǎn)染引起的短rna雙鏈體的混合物，但本發(fā)明不應(yīng)該解釋為限制在該解釋上。

因為本發(fā)明的方法不需要針對mrna內(nèi)特定基因篩選有效的sirna基序，并且能夠同時合成和遞送，本發(fā)明在基因功能研究和可應(yīng)用細(xì)菌的基因?qū)ぐ兄委熤型ㄟ^rnai進(jìn)行顯著簡化并升級的基因?qū)ぐ?。例如，使用合成sirna引發(fā)rnai，必須篩選靶基因的各mrna的有效sirna，這是反復(fù)試驗過程。對于一些基因，鑒定有效的sirna基序未成功。相反，本發(fā)明依賴于長dsrna，其在一個實施方案中產(chǎn)生短rna雙鏈體的混合物，以發(fā)揮序列特異性基因沉默的作用，由此避免預(yù)篩選過程。

因為來自細(xì)菌產(chǎn)生的長dsrna的代謝產(chǎn)物覆蓋了mrna的幾乎全部基序，本發(fā)明也保護(hù)免于頻繁突變的疾病基因，如在一些病毒基因像hiv的情況中。在設(shè)計并發(fā)展有效的sirna后，突變可在基因的靶基序中發(fā)生，其可致使sirna完全失效。相反，因為加工的長dsrna靶向疾病或病毒基因的許多基序，使用長dsrna的細(xì)菌介導(dǎo)的基因?qū)ぐ锌杀荛_該問題。

本發(fā)明也為靶標(biāo)鑒定和確認(rèn)提供強(qiáng)有力的工具，并且該工具稱為therapeuticpathwayidentificationandvalidation技術(shù)。例如，本發(fā)明使基因組范圍手段能夠通過提供文庫(否則不可能構(gòu)建)靶向發(fā)現(xiàn)。本發(fā)明也提供使用于體內(nèi)基因?qū)ぐ械募夹g(shù)能夠發(fā)現(xiàn)、確認(rèn)并區(qū)分治療靶標(biāo)。來自本發(fā)明方法的rnai效果證明比目前可獲得的rnai技術(shù)更有效并特異。例如，本發(fā)明的方法能夠在眾所周知難以進(jìn)行遺傳操作的癌干細(xì)胞中引起基因沉默。

因此，一般而言，本發(fā)明提供與以下相關(guān)的系統(tǒng)、材料和方法：遺傳改造細(xì)菌以轉(zhuǎn)錄非小發(fā)夾rna(或非短發(fā)夾rna，兩者均縮寫為“non-shrna”)。該non-shrna可以是長的雙鏈rna(dsrna)、長的發(fā)夾rna(lhrna)或多順反子shrna，或任何上述的混合物。non-shrna可以是非編碼的或不編碼蛋白質(zhì)的。在一個實施方案中，將non-shrna在呈遞到靶真核細(xì)胞之前在細(xì)菌中加工成更短rna雙鏈體的混合物。在一個特征中，選擇具有侵入性質(zhì)的細(xì)菌進(jìn)行本發(fā)明。來自細(xì)菌的代謝產(chǎn)物能夠在靶細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)。

一方面，本發(fā)明提供編碼在一個或多個原核啟動子控制下的長的雙鏈rna(dsrna)或lhrna的原核載體。所述dsrna包括與靶真核基因或病毒基因的信使rna(mrna)序列基本互補(bǔ)(包括完全互補(bǔ))的序列。在一個實施方案中，dsrna的原核代謝產(chǎn)物能夠調(diào)節(jié)真核基因或病毒基因的表達(dá)。在一個實施方案中，所述載體包括可以相同的至少兩個原核啟動子(例如t7)。各啟動子控制所述dsrna的兩條基本互補(bǔ)鏈的一條或另一條的表達(dá)。在一個實施方案中，所述載體是環(huán)形的雙鏈質(zhì)粒，并且所述兩個原核啟動子排列在質(zhì)粒的互補(bǔ)鏈上。在另一實施方案中，所述載體可整合到細(xì)菌染色體中。在另一實施方案中，所述載體作為細(xì)菌中游離基因存在。例如，其表達(dá)被載體靶向的真核基因可以是癌基因或hiv基因。

另一方面，本發(fā)明提供細(xì)菌，其包含(a)具有雙鏈區(qū)的rna分子，例如長的雙鏈rna(dsrna)或lhrna，或(b)編碼所述rna的dna分子。單鏈dna分子可由兩條互補(bǔ)鏈組成，每條編碼一條對應(yīng)rna鏈。所述rna包括與靶真核基因或病毒基因的mrna序列基本互補(bǔ)的序列。在一個特征中，rna的雙鏈區(qū)的長度是至少40bp、70bp、100bp、200bp、400bp或1000bp，在另一特征中，rna的雙鏈區(qū)的長度不超過2000bp。在一個實施方案中，細(xì)菌可是侵入性的、非致病性的，和/或治療性的。在一個實施方案中，所述細(xì)菌能夠?qū)na加工成能夠調(diào)節(jié)靶基因表達(dá)的更短rna雙鏈體的混合物。為此，所述細(xì)菌也含有能夠?qū)na加工成更短rna雙鏈體的混合物的酶或核酶，例如一種或更多種內(nèi)切核酸酶，如細(xì)菌核糖核酸酶iii或切酶或其兩者。在實施方案中，所述細(xì)菌含有在其從細(xì)菌釋放到靶真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中后幫助轉(zhuǎn)運(yùn)遺傳物質(zhì)的酶。該酶可以是hly蛋白質(zhì)(例如hlya基因編碼的利斯特氏菌溶素o)。編碼rna的相同dna分子或不同dna可編碼hly基因。在另一實施方案中，所述細(xì)菌能夠在引入真核細(xì)胞后調(diào)節(jié)真核細(xì)胞中的真核基因或病毒基因的表達(dá)，即不需要通過短rna雙鏈體混合物的途徑。編碼rna的dna分子的一個具體實例是上文剛剛描述的載體。

另一方面，本發(fā)明提供包含能夠調(diào)節(jié)真核基因或病毒基因表達(dá)的短rna雙鏈體的混合物的細(xì)菌。可從非小發(fā)夾rna(non-shrna)產(chǎn)生短rna雙鏈體的混合物。在一個實施方案中，短rna雙鏈體的混合物能夠有效降低真核或病毒基因的表達(dá)。所述non-shrna可以是長的雙鏈rna、長的發(fā)夾rna或多順反子shrna。

另一方面，本發(fā)明提供稱為文庫的文庫，所述文庫包含多個載體，各載體包含來自cdna庫的一個cdna分子或一個cdna片段、第一個啟動子和第二個啟動子。所述第一個啟動子控制cdna分子或cdna片段的一條鏈的表達(dá)，第二個啟動子控制cdna分子或cdna片段的另一條鏈的表達(dá)。并且多個載體可轉(zhuǎn)化細(xì)菌。所述cdna庫可來自哺乳動物細(xì)胞的總mrna。在一個實施方案中，通過用限制性酶消化cdna分子或通過pcr反應(yīng)產(chǎn)生所述cdna片段。本發(fā)明的發(fā)明方面也涉及在此文庫中發(fā)現(xiàn)的一個或多個載體。

本發(fā)明還提供包含細(xì)菌細(xì)胞的文庫的另一實施方案，所述細(xì)菌細(xì)胞含有多個上述載體。在一個實施方案中，cdna分子或cdna片段的轉(zhuǎn)錄物可形成長dsrna。在一個實施方案中，將從cdna分子或cdna片段的兩條鏈轉(zhuǎn)錄的雙鏈rna加工成更短rna雙鏈體的混合物。本發(fā)明的發(fā)明方面也涉及在此類文庫中發(fā)現(xiàn)的一種或更多種細(xì)菌。

在另一方面，本發(fā)明還提供使用載體、細(xì)菌和本發(fā)明文庫用于治療和研究用途的多種方法。例如，一方面，提供方法用于鑒定治療劑，所述方法包括用本發(fā)明文庫感染細(xì)胞群體并選擇具有表型變化的細(xì)胞以鑒定治療靶標(biāo)。

一方面，本發(fā)明提供體外研究途徑組分的方法，所述方法包括：提供能夠進(jìn)行目的生物學(xué)途徑的真核細(xì)胞；用其靶真核基因或病毒基因懷疑是目的途徑組分的本發(fā)明細(xì)菌感染細(xì)胞；并隨后分析所述細(xì)胞對所述目的途徑的任何影響。在一個實施方案中，在細(xì)菌中表達(dá)的長dsrna并且其在細(xì)菌中的產(chǎn)物干擾所懷疑組分的mrna，由此調(diào)節(jié)所述途徑。在一個實施方案中，所述途徑影響細(xì)胞存活、生長、分化、衰老、自噬、分裂或死亡。在另一實施方案中，靶標(biāo)影響傳染性生物，如病毒的存活、增殖和致病性。真核細(xì)胞可以是動物細(xì)胞、干細(xì)胞、癌細(xì)胞等。在一個實施方案中，細(xì)胞是癌干細(xì)胞。

一方面，本發(fā)明提供體內(nèi)研究治療靶標(biāo)的方法，所述方法包括：提供具有顯示疾病的細(xì)胞的活動物；向那些動物細(xì)胞遞送本發(fā)明細(xì)菌用于細(xì)菌感染(bactofection)；并隨后收集感染細(xì)胞，以檢測治療效果。所述動物細(xì)胞可包含異種移植物和/或腫瘤細(xì)胞。

一方面，本發(fā)明提供向動物細(xì)胞中引入短rna雙鏈體的混合物的方法，所述方法包括產(chǎn)生、加工并向動物細(xì)胞呈遞至少一條長雙鏈rna(dsrna)，而不引發(fā)來自動物的顯著免疫應(yīng)答?？蓪⑺鰀srna加工成更短rna雙鏈體的混合物。在一個實施方案中，所述方法包括在細(xì)菌內(nèi)產(chǎn)生并加工所述dsrna，用細(xì)菌感染動物細(xì)胞，并溶解細(xì)菌以釋放其內(nèi)容物。根據(jù)本方法，可在動物細(xì)胞中進(jìn)一步加工細(xì)菌的內(nèi)容物以變成更短rna雙鏈體的混合物。

本發(fā)明還提供在靶真核細(xì)胞中調(diào)節(jié)基因表達(dá)的方法，所述靶真核細(xì)胞可以是哺乳動物、鳥類或其他真核細(xì)胞。所述方法包括用本發(fā)明細(xì)菌感染靶細(xì)胞，其中細(xì)菌靶向的真核基因或病毒基因是待調(diào)節(jié)的基因。

本發(fā)明進(jìn)一步提供在受試者中治療或預(yù)防癌或細(xì)胞增殖疾病的方法，所述方法包括用本發(fā)明細(xì)菌感染受試者的細(xì)胞，其中所述細(xì)菌靶向的真核基因或病毒基因是已知上調(diào)細(xì)胞增殖的基因。在一個實施方案中，所述受試者是哺乳動物、鳥類或其他類型的真核生物。

本發(fā)明進(jìn)一步提供在受試者中治療或預(yù)防病毒感染引起的疾病的方法。所述方法包括步驟：用本發(fā)明細(xì)菌感染受試者細(xì)胞，其中在病毒的致病性中涉及細(xì)菌靶向的真核基因或病毒基因。

本發(fā)明進(jìn)一步提供在受試者中治療或預(yù)防由改變的基因引起的疾病的方法，所述方法包括用本發(fā)明細(xì)菌感染受試者細(xì)胞，其中細(xì)菌靶向的真核基因或病毒基因是改變的基因。在一個實施方案中，所述疾病至少部分由該基因表達(dá)的上調(diào)或下調(diào)引起。在另一實施方案中，所述疾病至少部分由基因中的一個或多個突變引起。

本發(fā)明的其他特征和優(yōu)勢可顯而易見于本文提供的，包括于不同實施例中的額外描述。提供的實施例闡明了用于實踐本發(fā)明的不同成分和方法。所述實施例不限于要求本發(fā)明?；诒竟_內(nèi)容，技術(shù)人員可鑒定并使用用于實踐本發(fā)明的其他成分和方法，而不背離本發(fā)明的原則。所有實施方案可彼此結(jié)合使用。

附圖簡述

圖1是本發(fā)明實施方案的示意圖。

圖2是顯示根據(jù)本發(fā)明實施方案怎樣構(gòu)建并使用文庫的示意圖。

圖3是根據(jù)本發(fā)明實施方案構(gòu)建雙鏈質(zhì)粒的示意圖。

圖4包括左圖中的facs圖表和右圖中的顯微圖像，表明根據(jù)本發(fā)明實施方案對癌干細(xì)胞(csc)的分離。

圖5顯示在用本發(fā)明細(xì)菌靶向cscp1(右圖)和對照(左圖)處理的csc中的cscp1蛋白質(zhì)表達(dá)分析的免疫熒光圖像。

圖6包括用本發(fā)明細(xì)菌靶向cscp3(右圖)和對照(左圖)處理的csc中的cscp3蛋白質(zhì)表達(dá)分析的單通道圖像(上圖)和強(qiáng)度譜(下圖)。

圖7包括用本發(fā)明細(xì)菌靶向cscp3(右圖)和對照(左圖)處理的csc群體中膜聯(lián)蛋白v-fitc染色測定的顯微圖像。

圖8顯示了用本發(fā)明細(xì)菌靶向cscp3(右圖)和對照(左圖)處理的csc群體中膜聯(lián)蛋白v-fitc染色測定的另一組顯微圖像。

圖9包括加入臺盼藍(lán)前(左上圖)和加入臺盼藍(lán)后(左下圖)用本發(fā)明細(xì)菌靶向cscp3處理的csc球(sphere)的顯微圖像。右邊的圖表定量說明了本發(fā)明細(xì)菌對左邊畫出的csc群體的影響。

圖10包括左邊cscp3蛋白質(zhì)表達(dá)western印跡圖像，和右邊顯示來自根據(jù)一個實驗用本發(fā)明細(xì)菌靶向cscp3處理后分化癌細(xì)胞的生存力統(tǒng)計的圖表。

發(fā)明詳述

如本文所用，“調(diào)節(jié)”指升高或降低(例如沉默)，換言之，上調(diào)或下調(diào)。如本文所用，向靶細(xì)胞“引入”或“遞送”微生物指用所述微生物(例如細(xì)菌)感染所述靶細(xì)胞的過程，并且在某些情況下可能通過裂解所述微生物向靶細(xì)胞期望位置(例如細(xì)胞質(zhì))釋放該微生物內(nèi)的遺傳物質(zhì)。

本發(fā)明為靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和基因沉默治療提供平臺技術(shù)。一方面，本發(fā)明系統(tǒng)產(chǎn)生并使用侵入性細(xì)菌向哺乳動物細(xì)胞或其他類型的真核細(xì)胞遞送編碼長dsrna或長dsrna或其兩者的dna，以在真核細(xì)胞中發(fā)揮rna干擾(rnai)作用。本發(fā)明的rna是非小發(fā)夾rna(non-shrna)。在一個實施方案中，所述rna是非編碼的。如本文所用“非編碼的”或“不編碼蛋白質(zhì)的”表示序列不翻譯成蛋白質(zhì)。在一個實施方案中，所述非小發(fā)夾rna是長的雙鏈rna(dsrna)、長的發(fā)夾rna(lhrna)或多順反子shrna(kim&rossi,naturerev.genet.8:173-184(2007))。在優(yōu)選實施方案中，所述non-shrna是非編碼的長dsrna，其在細(xì)菌細(xì)胞中可消化或加工成更短片段。在一種機(jī)制中，所述長dsrna加工成更短rna雙鏈體的混合物。通過細(xì)菌從長dsrna加工的遺傳物質(zhì)可引入動物宿主，而不被宿主細(xì)胞免疫系統(tǒng)檢測到，并繼續(xù)通過有效的轉(zhuǎn)錄后沉默和其他機(jī)制調(diào)節(jié)宿主細(xì)胞中的基因表達(dá)。真核細(xì)胞可以是哺乳動物、鳥類細(xì)胞或其他真核細(xì)胞。目的基因可以是哺乳動物、鳥類、細(xì)菌、真核或病毒基因。

通過采取新的基因沉默技術(shù)，本發(fā)明為在體外和體內(nèi)分析基因功能提供了強(qiáng)有力的工具；該工具稱作therapeuticpathwayidentificationandvalidation技術(shù)。

在一個特征中，本發(fā)明提供用于體外靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)和確認(rèn)的研究工具本發(fā)明的該方面在任何細(xì)胞群體包括癌干細(xì)胞(csc)或具有未知或仍未完全明確的生物途徑的其他細(xì)胞群體(包括非癌干細(xì)胞)中發(fā)現(xiàn)了應(yīng)用。因為本發(fā)明能夠在csc中引起基因沉默，其確認(rèn)的效能對于用于微小細(xì)胞群體、不能培養(yǎng)的細(xì)胞群體或不易于進(jìn)行常規(guī)遺傳操作的那些細(xì)胞群體特別有利。

在另一特征中，本發(fā)明提供有效鑒定、確認(rèn)和/或區(qū)分治療靶標(biāo)的體內(nèi)基因敲減技術(shù)。本發(fā)明可應(yīng)用于其中可施用細(xì)菌的任何體內(nèi)疾病模型，然而目前的敲減技術(shù)不能用于任何已建立的疾病模型。

在另一特征中，本發(fā)明也使基因組范圍手段能夠進(jìn)行靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)。使用技術(shù)構(gòu)建的rnai文庫可以是基因組范圍上的或是基因家族的文庫。與目前的合成sirna文庫和rnai載體文庫相比，文庫具有更低的勞動強(qiáng)度和更低的花費(fèi)。此外，文庫能夠發(fā)現(xiàn)新基因而其他那些文庫則不能。因此，本發(fā)明為在全基因組范圍上為系統(tǒng)探測基因功能提供強(qiáng)有力的工具，并也為篩選與疾病相關(guān)的潛在治療靶標(biāo)提供強(qiáng)有力的方法。

在一個有利的方面，本發(fā)明提供產(chǎn)生并使用細(xì)菌，優(yōu)選細(xì)菌的非致病性或治療性菌株向真核細(xì)胞中呈遞non-shrna的代謝產(chǎn)物，以在真核細(xì)胞中發(fā)揮rna干擾(rnai)作用的方法，所述non-shrna的代謝產(chǎn)物在一些情況下是短rna雙鏈體的混合物。所述non-shrna可以是長的雙鏈rna(dsrna)、長的發(fā)夾rna(lhrna)或多順反子shrna。所述non-shrna具有雙鏈rna區(qū)域。所述雙鏈區(qū)域比sirna雙鏈體長，其通常為20-25bp。在一個實施方案中，所述雙鏈區(qū)域長度至少為40bp、70bp、100bp、200bp、400bp、1000bp，并且在另一特征中，長度不超過2000bp。

如本文所用，“混合物”、“多種”或“混合物”表示至少兩種不同序列。例如，在一個實施方案中，短rna雙鏈體的混合物包含超過2、、4、8、16、50、100、200、500、1000、2000或4000個在序列上彼此不相同的短rna雙鏈體。相反，“多個”表示多于一個，無論它們是否是相同的序列。

在一個實施方案中，通過酶或核酶消化non-shrna前體產(chǎn)生短rna雙鏈體。所述酶可以是內(nèi)切核酸酶。所述內(nèi)切核酸酶可以是核糖核酸酶iii家族的成員，如細(xì)菌核糖核酸酶iii或切酶，或切酶樣酶。

在優(yōu)選的實施方案中，non-shrna是長的雙鏈rna(dsrna)，或長的發(fā)夾rna(lhrna)。在一個實施方案中，所述non-shrna包含與靶真核細(xì)胞中目的基因mrna序列基本互補(bǔ)的序列。因為是基本互補(bǔ)，所以兩條序列不必具有相同或類似的長度，并且100％或完全的互補(bǔ)性是基本互補(bǔ)性的一個實例。在一個實施方案中，所述non-shrna前體包含針對目的基因的有效的rnai序列。在特定實例中，所述有效rnai序列是sirna序列，但也不總是這樣。不是與靶基因互補(bǔ)的每一sirna在引發(fā)rnai降解基因轉(zhuǎn)錄物中都有效。的確，費(fèi)時的篩選對鑒定有效的sirna序列通常是必須的。包含“基因的有效rnai(或在一個實施方案中為sirna)序列”或可以“有效沉默基因”的遺傳物質(zhì)能夠基本降低基因表達(dá)的至少20％、40％、50％、60％、70％、80％、90％或高于90％，例如導(dǎo)致可觀察到的表型改變。

本發(fā)明還提供細(xì)菌，優(yōu)選非致病性或治療性細(xì)菌用于“屏蔽”或產(chǎn)生并將non-shrna加工成有效的基因沉默產(chǎn)物以避開高等生物的免疫系統(tǒng)。本發(fā)明的細(xì)菌包含(a)non-shrna，(b)編碼所述non-shrna的dna，或(c)其兩者。在一個實施方案中，所述前體包含非編碼的長dsrna。所述細(xì)菌還可包含能夠?qū)⑶绑w加工成sirna的酶或核酶。所述酶可以是內(nèi)切核酸酶如細(xì)菌核糖核酸酶iii或切酶。在一個實施方案中，所述酶對細(xì)菌是內(nèi)源的。在另一實施方案中，所述酶對細(xì)菌是外源的并通過表達(dá)該酶，例如切酶樣酶的載體引入。

細(xì)菌遞送比病毒遞送更具吸引力，因為其可以受抗生素和不能繁殖的減毒細(xì)菌菌株的控制。同樣地，細(xì)菌更易于進(jìn)行遺傳操作，其允許產(chǎn)生特異用于某些應(yīng)用的載體菌株。在本發(fā)明的一個實施方案中，本發(fā)明的方法用于產(chǎn)生細(xì)菌，其以組織特異性方式引起基因?qū)ぐ小?/p>

本發(fā)明的無毒菌可通過多種機(jī)制進(jìn)入哺乳動物宿主細(xì)胞。與通過專門吞噬細(xì)胞吸收相反，其通常通過專門化溶酶體導(dǎo)致細(xì)菌的破壞，侵入性細(xì)菌菌株具有侵入非吞噬宿主細(xì)胞的能力。此類細(xì)菌的天然實例是細(xì)胞內(nèi)病原體如利斯特氏菌(listeria)、志賀氏菌(shigella)和沙門氏菌(salmonella)，但該性質(zhì)也可通過轉(zhuǎn)移侵入相關(guān)基因轉(zhuǎn)移到其他細(xì)菌如大腸桿菌(e.coli)和雙歧桿菌(bifidobacteriae)，包括益生菌(p.courvalin,s.goussard,c.grillot-courvalin,c.r.acad.sci.paris318,1207(1995))。在本發(fā)明的其他實施方案中，用于向宿主細(xì)胞遞送干擾rna的細(xì)菌包括弗氏志賀氏菌(shigellaflexneri)(d.r.sizemore,a.a.branstrom,j.c.sadoff,science270,299(1995))、侵入性大腸桿菌(p.courvalin,s.goussard,c.grillot-courvalin,c.r.acad.sci.paris318,1207(1995),c.grillot-courvalin,s.goussard,f.huetz,d.m.ojcius,p.courvalin,natbiotechnol16,862(1998))、小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(yersiniaenterocolitica)(a.al-mariria,a.tibor,p.lestrate,p.mertens,x.debolle,j.j.letessoninfectimmim70,1915(2002))和單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(listeriamonocytogenes)(m.hense,e.domann,s.krusch,p.wachholz,k.e.dittmar,m.rohde,j.wehland,t.chakraborty,s.weiss,cellmicrobiol3,599(2001),s.pilgrim,j.stritzker,c.schoen,a.kolb-maurer,g.geginat,m.j.loessner,i.gentschev,w.goebel,genetherapy10,2036(2003))。任何侵入性細(xì)菌用于dna向真核細(xì)胞中轉(zhuǎn)移(s.weiss,t.chakraborty,curropinionbiotechnol12,467(2001))。

在本發(fā)明實施方案中參考圖1，在侵入性細(xì)菌并優(yōu)選非致病性細(xì)菌中產(chǎn)生多種短rna雙鏈體的混合物，然后通過靶真核細(xì)胞進(jìn)行吸收。首先，構(gòu)建編碼包含與靶基因mrna序列基本互補(bǔ)的序列的non-shrna的原核載體，例如質(zhì)粒，并將其轉(zhuǎn)化到細(xì)菌中。non-shrna的表達(dá)受一個或多個原核啟動子(例如t7)的控制。圖1所示的質(zhì)粒具有兩個原核啟動子。在其中non-shrna是長dsrna的實施方案中，各啟動子控制dsrna一條互補(bǔ)鏈的表達(dá)。將在實施例部分中并參考圖3進(jìn)一步詳細(xì)描述示例性質(zhì)粒。一旦non-shrna前體在細(xì)菌中轉(zhuǎn)錄，其即被內(nèi)源細(xì)菌核糖核酸酶iii或外源切酶樣酶消化成多個片段，例如短rna雙鏈體。當(dāng)然，在任何給定時間，所述細(xì)菌可含有non-shrna、消化片段(例如短rna雙鏈體)和編碼rna的dna的混合物。

仍然參考圖1，在細(xì)菌侵入過程(“細(xì)菌感染”)中，通過靶真核生物的，例如通過內(nèi)體吸收細(xì)菌。包括non-shrna的消化產(chǎn)物(例如短rna片段)的細(xì)菌內(nèi)容物通過細(xì)菌裂解后在細(xì)胞質(zhì)中釋放，導(dǎo)致靶基因敲減或沉默?？赏ㄟ^表達(dá)切酶基因并在細(xì)菌中缺失核糖核酸酶iii基因，用切酶替代細(xì)菌核糖核酸酶iii。已經(jīng)報道切酶使用所謂的“尺寸機(jī)理”將長dsrna切割成12-30個核苷酸的更短片段。

或者，將non-shrna前體及其細(xì)菌消化產(chǎn)物引入真核細(xì)胞后，可將它們進(jìn)一步加工并通過真核生物酶(包括真核細(xì)胞中的切酶)進(jìn)行消化。這可通過來自non-shrna的代謝產(chǎn)物促進(jìn)有效rnai。

細(xì)菌dna和rna從細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌中的釋放可根據(jù)細(xì)菌菌株通過多種機(jī)制發(fā)生。在一個實施方案中，所述細(xì)菌dna和rna可包含長dsrna、短rna雙鏈體和/或dsrna編碼質(zhì)粒的混合物。一種機(jī)制涉及鼠傷寒沙門氏菌(s.typhimurium)中的iii類輸出系統(tǒng)，其為橫跨細(xì)菌細(xì)胞膜的專門化多蛋白復(fù)合體，其功能包括向細(xì)胞外分泌毒力因子，以允許向靶細(xì)胞發(fā)放信號，但其也可用于向靶細(xì)胞中遞送抗原(rüssmannh.intjmedmicrobiol,293:107-12(2003))或通過細(xì)菌裂解并向細(xì)胞質(zhì)中釋放細(xì)菌內(nèi)容物。通過加入細(xì)胞內(nèi)活性抗生素(四環(huán)素)引發(fā)細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的裂解，或通過細(xì)菌代謝衰減(營養(yǎng)缺陷型)或通過細(xì)胞內(nèi)體或溶酶體自然發(fā)生。釋放真核轉(zhuǎn)錄物質(zhì)粒后，在靶細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生dsrna或sirna，依次引發(fā)mrna降解的高度特異過程，其導(dǎo)致靶基因的沉默。

可使用天然侵入性病原體鼠傷寒沙門氏菌(salmonellatyphimurium)進(jìn)行本發(fā)明。在該實施方案的一方面，鼠傷寒沙門氏菌的菌株包括sl7207和vnp20009(s.k.hoiseth,b.a.d.stacker,nature291,238(1981)；pawelekjm,lowkb,bermudesd.cancerres.57(20):4537-44(1997年10月15日))。

在本發(fā)明的另一實施方案中，使用減毒大腸桿菌進(jìn)行本發(fā)明。在該實施方案的一個實例中，大腸桿菌的菌株是bm2710(c.grillot-courvalin,s.goussard,f.huetz,d.m.ojcius,p.courvalin,natbiotechnol16,862(1998))。在該實施方案的一個特征中，通過侵入性質(zhì)粒例如編碼inv基因的一個質(zhì)粒來改造所述bm2710菌株，以具有細(xì)胞侵入性質(zhì)。根據(jù)本發(fā)明的另一特征，本發(fā)明的細(xì)菌含有具有hly(利斯特氏菌溶素(listerialysine)o)基因的載體，因為認(rèn)為hly蛋白質(zhì)對遺傳物質(zhì)從輸入小泡中逃逸是重要的。顯然，所述載體可以是相同的侵入質(zhì)粒。因此，在一個實施方案中，所述細(xì)菌具有編碼inv和hly基因的質(zhì)粒。在本發(fā)明的一方面，該質(zhì)粒是pgb2inv-hly。在一個實例中，用于本發(fā)明的大腸桿菌菌株是bl21(de3)plyse。

本發(fā)明還包括編碼non-shrna前體的原核載體或質(zhì)粒與侵入性細(xì)菌一起使用，以在真核細(xì)胞中引起rna干擾(rnai)。在一個特征中，所述質(zhì)粒還包括至少一個原核啟動子，其控制non-shrna(例如非編碼長dsrna)的表達(dá)。

本發(fā)明還提供使用細(xì)菌，優(yōu)選細(xì)菌的非致病性或治療性菌株向真核細(xì)胞中引入短rna雙鏈體的混合物以在真核細(xì)胞中發(fā)揮rna干擾(rnai)作用的方法。該方法可通過有效的轉(zhuǎn)錄后沉默調(diào)整或調(diào)節(jié)靶細(xì)胞內(nèi)的基因表達(dá)。所述真核細(xì)胞可以是哺乳動物細(xì)胞或鳥類細(xì)胞。目的基因可以是哺乳動物、鳥類、細(xì)菌、真核或病毒基因。

本發(fā)明作為在體外和體內(nèi)鑒定并確認(rèn)途徑組分和治療靶標(biāo)的研究工具，具有廣泛的應(yīng)用。本發(fā)明可用于所有類型的細(xì)胞，包括難以研究的細(xì)胞，如癌干細(xì)胞(csc)。本發(fā)明系統(tǒng)也可用于產(chǎn)生rnai文庫，作為基因組范圍或基因家族特異性靶標(biāo)發(fā)現(xiàn)的工具。

本發(fā)明還可用于開發(fā)治療劑和藥物?？赏ㄟ^本發(fā)明方法治療的疾病和病征包括癌、細(xì)胞增殖疾病、病毒干擾、基因突變引起的疾病等。

1.rna干擾

rna干擾(縮寫為rnai)是雙鏈rna(dsrna)誘導(dǎo)的用于靶向降解單鏈rna(ssrna)的細(xì)胞過程。所述ssrna是基因轉(zhuǎn)錄物，如信使rna(mrna)。rnai是(大多數(shù))轉(zhuǎn)錄后基因沉默的形式，其中dsrna可特異性干擾具有與dsrna互補(bǔ)的序列的基因的表達(dá)。dsrna的反義rna鏈靶向互補(bǔ)基因轉(zhuǎn)錄物，如信使rna(mrna)，用于通過rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(risc)(其為含有多個蛋白質(zhì)復(fù)合體的核糖核酸酶)中的核糖核酸酶進(jìn)行切割。

rnai已經(jīng)顯示為許多真核生物中的常見細(xì)胞過程。risc以及切酶在真核結(jié)構(gòu)域上保守。相信rnai在對病毒和其他外源遺傳物質(zhì)的免疫應(yīng)答中起作用。

雙鏈rna(或dsrna)是具有兩條互補(bǔ)鏈的rna。dsrna形成一些病毒的遺傳物質(zhì)。在非哺乳動物細(xì)胞中，長dsrna作為起始rna干擾過程的引發(fā)劑起作用，在哺乳動物細(xì)胞中，更短rna雙鏈體必須用于避免非特異性先天免疫應(yīng)答。在本發(fā)明的一個實施方案中，non-shrna具有至少40bp的雙鏈區(qū)域。在另一實施方案中，本發(fā)明的長dsrna等于或長于30bp、40bp、45bp、50bp、70bp、100bp、200bp、300bp、400bp、500bp、600bp、700bp、1000bp或2000bp。在一個實施方案中，所述長dsrna不超過600bp、800bp、1500bp或2000bp。在一個實施方案中，本發(fā)明的dsrna不含有任何錯配或凸出。在另一實施方案中，本發(fā)明的dsrna含有錯配和/或凸出(bulge)。

小的干擾rna(sirna)是一類短雙鏈rna(dsrna)分子，其在生物學(xué)中起多種作用。更值得注意的是，其參與rna干擾(rnai)途徑，其中所述sirna干擾特定基因的表達(dá)。此外，sirna還在諸如抗病毒機(jī)制或形成基因組染色質(zhì)結(jié)構(gòu)的過程中起作用。sirna具有相對短的具有2-3個核苷酸突出端(其具有5'-磷酸和3'-羥基末端)的雙鏈rna(dsrna)區(qū)域。如本文所用，sirna長約20-25個核苷酸。從non-shrna(例如長dsrna)產(chǎn)生的一些短rna雙鏈體可以是sirna。

發(fā)夾rna(hrna)是單鏈rna分子，其含有兩條互補(bǔ)序列形式的莖，和互補(bǔ)片段之間的環(huán)序列。由于正義和反義片段的互補(bǔ)性，此類rna分子趨向處于具有單鏈rna(環(huán))區(qū)和雙鏈rna(dsrna)區(qū)的發(fā)夾形狀形式。(參閱例如svoboda&dicara,cell.mol.lifesci.63:901-918(2006))。

如本文所用，短的發(fā)夾rna(shrna)是長度為50nt或更短的發(fā)夾rna?？赏ㄟ^切酶將所述shrna加工成sirna，其然后整合到sirna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(risc)中。

如本文所用，長發(fā)夾rna(lhrna)是長度超過60nt的發(fā)夾rna?？赏ㄟ^切酶將所述lhrna加工成多種更短rna雙鏈體，其可包含sirna。在一個實施方案中，所述lhrna的長度等于或長于70nt、80nt、100nt、150nt、200nt、400nt、700nt、1000nt、1500nt、2000、4000或8000nt。在可選實施方案中，所述lhrna的dsrna區(qū)域的長度等于或長于25bp、30bp、40bp、50bp、70bp、100bp、200bp、300bp、500bp、600bp、700bp、1000bp、2000bp或4000bp。在一個實施方案中，本發(fā)明所述lhrna的dsrna區(qū)域不含有任何錯配或凸出。在另一實施方案中，本發(fā)明所述lhrna的dsrna區(qū)域含有錯配和/或凸出。(如上)

切酶是核糖核酸酶iii核糖核酸酶家族的成員。切酶將長的雙鏈rna(dsrna)、前microrna(mirna)和其他短發(fā)夾rna(shrna)切割成包括sirna的短雙鏈rna片段。切酶催化rna干擾途徑中的第一步并起始rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(risc)的形成，所述rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體的催化組分argonaute是能夠降解信使rna(mrna)的內(nèi)切核酸酶，所述信使rna(mrna)的序列與sirna引導(dǎo)鏈的序列互補(bǔ)。

也在細(xì)菌中發(fā)現(xiàn)了核糖核酸酶iii。細(xì)菌核糖核酸酶iii將長的雙鏈rna(dsrna)切割成約12-30個核苷酸長的sirna，其具有與切酶產(chǎn)生的那些末端相同的末端。用細(xì)菌核糖核酸酶iii產(chǎn)生的sirna當(dāng)遞送到動物細(xì)胞中時也可起始rna誘導(dǎo)沉默復(fù)合體(risc)的形成，并引發(fā)rnai。(wang&bechhofer,jbacteriol.179:7379–7385(1997)；http://www.uni-giessen.de/～gf1265/groups/klug/klug1_2.html)

本發(fā)明提供消化產(chǎn)物，例如來自切酶/長dsrna的核糖核酸酶iii消化物的短rna雙鏈體的混合物(或“多樣性”、“混合物”)，所述長dsrna包含與靶信使rna(mrna)序列基本互補(bǔ)的序列。短rna雙鏈體的混合物在引發(fā)rnai中與使用具有有效sirna序列的單一類型sirna分子至少一樣有效。本發(fā)明由此一方面有利地排除了費(fèi)時篩選的需要，所述篩選通常對鑒定有效的sirna序列是必須的，并去除了對sirna的遞送挑戰(zhàn)。

2.產(chǎn)生、加工并向真核細(xì)胞遞送rna或編碼rna的dna的細(xì)菌

在本發(fā)明中，細(xì)菌不是簡單的遞送工具。更確切的，細(xì)菌可以進(jìn)行合成、加工并遞送基因?qū)ぐ衦na。能夠合成并將諸如rna分子的分子通過穿過細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，而遞送到靶細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的任何微生物可以用于向此類細(xì)胞中遞送rna。在優(yōu)選的實施方案中，所述微生物是原核生物。在甚至更優(yōu)選的實施方案中，所述原核生物是細(xì)菌。也處于本發(fā)明范圍內(nèi)的是除可用于向細(xì)胞遞送rna的細(xì)菌以外的微生物。例如，所訴微生物可以是真菌，例如cryptococciisneoformans，原生動物，例如克魯茲錐蟲(trypanosomacruzi)、鼠弓漿蟲(toxoplasmagondii)、多氏利什曼蟲(leishmaniadonovani)和瘧蟲(plasmodia)。

如本文所用，當(dāng)指微生物，例如細(xì)菌時，術(shù)語“侵入性的”指能夠向靶細(xì)胞遞送至少一種分子，例如rna或編碼rna的dna分子的微生物。侵入性微生物可以是能夠穿過細(xì)胞膜，由此進(jìn)入所述細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)，并向靶細(xì)胞遞送至少一些其內(nèi)容物，例如rna或編碼rna的dna的微生物。向靶細(xì)胞遞送至少一種分子的過程優(yōu)選不顯著修飾侵入裝置。在優(yōu)選的實施方案中，所述微生物是細(xì)菌。優(yōu)選的侵入性細(xì)菌是能夠如通過進(jìn)入真核細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)向靶細(xì)胞遞送至少一種分子，例如rna或編碼rna的dna分子的細(xì)菌。優(yōu)選的侵入性細(xì)菌是或的細(xì)菌，例如活的侵入性細(xì)菌。侵入性微生物包括天然能夠如通過穿過細(xì)胞膜，例如真核細(xì)胞膜并進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，而向靶細(xì)胞遞送至少一種分子的微生物，以及非天然侵入性的但已經(jīng)被修飾，例如遺傳修飾而變得具侵入性的微生物。在另一優(yōu)選實施方案中，可通過將細(xì)菌連接到“侵入因子”，也稱為“進(jìn)入因子”或“細(xì)胞質(zhì)靶向因子”上來修飾非天然侵入性的微生物，使其變得有侵入性。如本文所用，“侵入因子”是當(dāng)非侵入性細(xì)胞表達(dá)時致使細(xì)菌具有侵入性的因子，例如蛋白質(zhì)或一組蛋白質(zhì)。如本文所用，“侵入因子”由“細(xì)胞質(zhì)靶向基因”編碼。天然侵入性微生物，例如細(xì)菌可具有某些向性，即趨向優(yōu)選的靶細(xì)胞?；蛘?，可修飾，例如遺傳修飾微生物，例如細(xì)菌，以模擬第二種微生物的向性。

可根據(jù)本領(lǐng)域已知的方法測定至少一種分子向靶細(xì)胞的遞送。例如，可通過雜交或pcr方法，或通過包括使用抗體的免疫方法檢測分子的存在，由此沉默的rna或蛋白質(zhì)的表達(dá)降低。測定微生物是否具有用于本發(fā)明的足夠的侵入性可包括測定相對于與宿主細(xì)胞接觸的微生物數(shù)量，是否有足夠的rna向宿主細(xì)胞遞送。如果rna的量相對于所用微生物的數(shù)量較低，可期望進(jìn)一步修飾微生物以提高其侵入性潛力。

可通過多種方法測定細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞。細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌在氨基糖苷類抗生素處理下存活，而細(xì)胞外細(xì)菌被快速殺死?？赏ㄟ^用抗生素慶大霉素處理單層細(xì)胞來滅活細(xì)胞外細(xì)菌，然后在用溫和去污劑釋放存活的細(xì)胞內(nèi)生物并在標(biāo)準(zhǔn)細(xì)菌學(xué)培養(yǎng)基上測定有活力的數(shù)量前除去該抗生素，來完成對細(xì)菌吸收的定量評估。此外，例如通過細(xì)胞層的thin-section-transmission電子顯微鏡或通過免疫熒光技術(shù)直接觀察細(xì)菌進(jìn)入細(xì)胞(falkow等(1992)annualrev.cellbiol.8:333)。因此，多種技術(shù)可用于測定特定細(xì)菌是夠能夠侵入特定類型的細(xì)胞，或用于如修飾細(xì)菌的向性以模擬第二種細(xì)菌的向性的細(xì)菌修飾后，驗證細(xì)菌的侵入。根據(jù)本發(fā)明方法遞送rna的細(xì)菌優(yōu)選為非致病性的。然而，只要它們的致病性已經(jīng)減毒，由此致使所述細(xì)菌對向其施用的受試者無害，也可使用病原菌。如本文所用，術(shù)語“減毒的細(xì)菌”指已經(jīng)被修飾來顯著減少或消除其對受試者的損害的細(xì)菌?？赏ㄟ^下文所述的多種方法減毒病原菌。

不想受限于作用的特定機(jī)理，根據(jù)細(xì)菌類型，向真核細(xì)胞中遞送rna的細(xì)菌可進(jìn)入細(xì)胞的多個區(qū)室。例如，所述細(xì)菌可以在小泡中，例如吞噬小泡中。一旦進(jìn)入細(xì)胞，細(xì)菌可被破壞或裂解，并且其內(nèi)容物可遞送到真核細(xì)胞中。也可改造細(xì)菌表達(dá)吞噬體降解酶，以允許rna從所述吞噬體中泄漏。在一些實施方案中，所述細(xì)菌在真核細(xì)胞中可保持活力不同時間，并可繼續(xù)產(chǎn)生rna。rna或編碼rna的dna然后可從細(xì)菌中例如通過泄漏釋放到細(xì)胞中。在本發(fā)明的某些實施方案中，所述細(xì)菌也可以在真核細(xì)胞中復(fù)制。在優(yōu)選的實施方案中，細(xì)菌復(fù)制對宿主細(xì)胞沒有明顯的毒性。本發(fā)明不限于通過特定機(jī)制遞送rna或編碼rna的dna并且旨在包括允許通過不依賴的細(xì)菌遞送機(jī)制合成和/或遞送rna或編碼rna的dna的方法和組合物。

下文所述的是在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述為天然侵入性的細(xì)菌(部分2.1)，以及在文獻(xiàn)中已經(jīng)描述為天然非侵入性的細(xì)菌(部分2.2)，以及天然非致病性的或減毒的細(xì)菌的實例。盡管已經(jīng)將一些細(xì)菌描述為非侵入性的(部分2.2)，這些根據(jù)本發(fā)明仍然是侵入性足夠使用的。無論是否常規(guī)描述為天然侵入性的或非侵入性的，可修飾任何的細(xì)菌菌株以進(jìn)行調(diào)節(jié)，尤其是增加其侵入性特征(例如在部分2.3中所述)。

2.1天然侵入性細(xì)菌

本發(fā)明使用的特定天然侵入性細(xì)菌并不是至關(guān)重要的。此類天然發(fā)生的侵入性細(xì)菌的實例包括，但不限于志賀氏菌屬物種,沙門氏菌屬物種,利斯特氏菌屬物種,立克次氏體屬物種(rickettsiaspp.)，和腸侵染性大腸桿菌。所用的特定志賀氏菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。

可用于本發(fā)明的志賀氏菌株的實例包括弗氏志賀氏菌2a(atccno.29903)、shigellasonnet(atccno.29930)，和shigelladisenteriae(atccno.13313)。減毒志賀氏菌株，如弗氏志賀氏菌2a2457taroavirg突變體cvd1203(noriega等，上文)、弗氏志賀氏菌m90ticsa突變體(goldberg等infectimmun.,62:5664-5668(1994))、弗氏志賀氏菌ysfll14arod突變體(karnell等vacc,10:167-174(1992))和弗氏志賀氏菌aroaarod突變體(verma等vacc,9:6-9(1991))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘撸赏ㄟ^單獨(dú)引入減毒突變或與其他一種或更多種額外減毒突變結(jié)合構(gòu)建新的減毒志賀氏菌屬物種菌株。

志賀氏菌rna疫苗載體的至少一個優(yōu)勢是其對結(jié)腸黏膜表面中淋巴組織的向性。此外，認(rèn)為志賀氏菌復(fù)制的初始位點(diǎn)位于樹狀突細(xì)胞和巨噬細(xì)胞內(nèi)，其通常見于黏膜淋巴組織中m細(xì)胞的基底側(cè)面(mcghee,j.r.等reproduction,fertility,&development6:369(1994)；pascual,d.w.等immunomethods5:56(1994)綜述)。像這樣，志賀氏菌載體可提供手段以在這些專門抗原呈遞細(xì)胞中表達(dá)抗原的工具。志賀氏菌載體的另一優(yōu)勢是減毒的志賀氏菌菌株在體外和體內(nèi)遞送核酸報告基因(sizemore,d.r.等science270:299(1995)；courvalin,p.等comptesrendusde1academiedessciencesserieill-sciencesdeiavie-lifesciences318:1207(1995)；powell,r.j.等在:molecularapproachestothecontrolofinfectiousdiseases(1996)中.，f.brown,e.norrby,d.burton和j.mekalanos,編著coldspringharborlaboratorypress,newyork.183；anderson,r.j.等abstractsforthe97thgeneralmeetingoftheamericansocietyformicrobiology:e.(1997))。在實踐方面，志賀氏菌的嚴(yán)格限制的宿主特異性支持通過中間宿主防止志賀氏菌載體擴(kuò)散到食物鏈中。此外，已經(jīng)在嚙齒類、靈長類和自生自長型(植物)中開發(fā)了高度減毒的減毒菌株(anderson等(1997)上文；li,a.等vaccine10:395(1992)；li,a.等vaccine11:180(1993)；karnell,a.等vaccine13:88(1995)；sansonetti,p.j.和j.arondelvaccine7:443(1989)；fontaine,a.等researchinmicrobiology141:907(1990)；sansonetti,p.j.等(1991)vaccine9:416；noriega,f.r.等infection&immunity62:5168(1994)；noriega,f.r.等infection&immunity64:3055(1996)；noriega,f.r.等infection&immunity64:23(1996)；noriega,f.r.等infection&immunity64:3055(1996)；kotloff,k.l.等infection&immunity64:4542(1996))。該近來的認(rèn)識將允許開發(fā)用于人的良好耐受的志賀氏菌載體。

可使用化學(xué)性非特異性誘變，如使用試劑如n-甲基-n'-硝基-n-亞硝基胍；或使用重組dna技術(shù)、經(jīng)典的遺傳技術(shù)(如tn10誘變、p22-介導(dǎo)的轉(zhuǎn)導(dǎo)、λ噬菌體介導(dǎo)的交換和接合轉(zhuǎn)移)的非特異性誘變；或使用定點(diǎn)誘變的重組dna技術(shù)，將減毒突變引入細(xì)菌性病原菌中。因為對重組dna技術(shù)構(gòu)建的菌株進(jìn)行了更明確的定義，所以優(yōu)選重組dna技術(shù)。此類減毒突變的實例包括，但不限于：(i)營養(yǎng)缺陷性突變，如aro(hoiseth等nature,291:238-239(1981))、gua(mcfarland等microbiol.path.,3:129-141(1987))、nad(park等j.bact,170:3725-3730(1988)、thy(nnalue等infect.immun.,55:955-962(1987))和asd(curtiss,上文)突變；

(ii)滅活球形調(diào)節(jié)功能的突變，如cya(curtiss等infect.immun.,55:3035-3043(1987))、crp(curtiss等(1987),上文)、phop/phoq(groisman等proc.natl.acad.sci.,usa,86:7077-7081(1989)；和miller等proc.natl.acad.sci.,usa,86:5054-5058(1989))、phop(miller等j.bact,172:2485-2490(1990))或ompr(dorman等infect.immun.,57:2136-2140(1989))突變；

(iii)修飾應(yīng)激應(yīng)答的突變，如reca(buchmeier等moi.micro.,7:933-936(1993))、htra(johnson等mol.micro.,5:401-407(1991))、htpr(neidhardt等biochem.biophys.res.com.,100:894-900(1981))、hsp(neidhardt等ann.rev.genet,18:295-329(1984))和groel(buchmeier等sci.,248:730-732(1990))突變；

(iv)特定毒力因子中的突變，如isya(libby等proc.natl.acad.sci.,usa,91:489-493(1994))、pag或prg(miller等(1990),上文；和miller等(1989),上文)、isca或virg(d'hauteville等mol.micro.,6:833-841(1992))、plca(mengaud等molmicrobiol.,5:367-72(1991)；camilli等j.exp.med,173:751-754(1991))，和act(brundage等proc.natl.acad.sci.,usa,90:11890-11894(1993))突變；(v)影響dna拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)的突變，如topa(galan等infect.immun.,58:1879-1885(1990))；

(vi)阻斷或修飾細(xì)胞周期的突變，如min(deboer等cell,56:641-649(1989))。

(vii)引入編碼自殺系統(tǒng)的基因，如sacb(recorbet等app.environ.micro.,59:1361-1366(1993)；quandt等gene,127:15-21(1993))、nuc(ahrenholtz等app.environ.micro.,60:3746-3751(1994))、hok、gef、kil或phla(molin等ann.rev.microbiol.,47:139-166(1993))；

(viii)改變脂多糖和/或脂類a的生物起源的突變，如rfb(raetzinesherishiacoliandsalmonellatyphimurium,neidhardt等編著,asmpress,washingtond.c.第1035-1063頁(1996))、gale(hone等j.infect.dis.,156:164-167(1987))和htrb(raetz,上文)、msbb(reatz,上文)

(ix)引入噬菌體溶解系統(tǒng)，如p22編碼的溶源體(rennell等virol,143:280-289(1985))、λ胞壁質(zhì)轉(zhuǎn)糖基酶(bienkowska-szewczyk等mol.gen.genet.,184:111-114(1981))或s基因(reader等virol,43:623-628(1971))；

和

減毒突變可組成型表達(dá)或處于誘導(dǎo)性啟動子控制下，如啟動子的溫度敏感型熱激家族(neidhardt等上文)，或厭氧誘導(dǎo)的nirb啟動子(harbome等molmicro.,6:2805-2813(1992))或抑制型啟動子，如uapa(gorfinkiel等j.biol.chem.,268:23376-23381(1993))或gcv(stauffer等j.bact,176:6159-6164(1994))。

所用的特定利斯特氏菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的利斯特氏菌菌株的實例包括單核細(xì)胞增生利斯特氏菌(atccno.15313)。減毒的利斯特氏菌株，如單核細(xì)胞增生利斯特氏菌acta突變體(brundage等上文)或單核細(xì)胞增生利斯特氏菌plca(camilli等j.exp.med.,173:751-754(1991))優(yōu)選用于本發(fā)明。或者，可通過引入上文描述志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒利斯特氏菌株。所用的特定沙門氏菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。

可用于本發(fā)明的沙門氏菌菌株的實例包括傷寒沙門氏菌(salmonellatyphi)(atccno.7251)和鼠傷寒沙門氏菌(atccno.13311)。減毒的沙門氏菌株優(yōu)選用于本發(fā)明并包括傷寒沙門氏菌(s.typhi)-aroc-arod(hone等vacc.9:810(1991)和鼠傷寒沙門氏菌-axoa突變體(mastroeni等micro.pathol.13:477(1992))?；蛘撸赏ㄟ^引入上文描述志賀氏菌屬物種的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒沙門氏菌菌株。

所用的特定立克次氏體菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的立克次氏體菌株的實例包括立氏立克次氏體(rickettsiarickettsiae)(atccno.vr149和vr891)、普氏立克次氏體(ricketsiaprowaseckii)(atccno.vr233)、恙蟲熱立克次氏體(rickettsiatsutsugamuchi)(atccno.vr312,vrl50和vr609)、摩氏立克次氏體(rickettsiamooseri)(atccno.vr144)、西伯利亞立克次氏體(rickettsia)(atccno.vr151)和五日熱立克次氏體(rochalimaeaquitana)(atccno.vr358)。減毒的立克次體菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文描述志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定腸侵染性大腸桿菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的腸侵染性大腸桿菌的實例包括大腸桿菌菌株4608-58、1184-68、53638-c-17、13-80和6-81(sansonetti等ann.microbiol.(inst.pasteur),132a:351-355(1982))。

減毒的腸侵染性大腸桿菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明并可通過引入上文描述志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

此外，因為除細(xì)菌之外的某些微生物也可與整聯(lián)蛋白分子(其為某些侵入因子的受體)相互作用用于細(xì)胞吸收，此類微生物也可用于向靶細(xì)胞中引入rna。例如，病毒，例如口蹄病病毒、艾柯病毒和腺病毒，和真菌病原體，例如莢膜組織孢漿菌(histoplasmacapsulatum)和碩大利什曼原蟲(leishmaniamajor)與整聯(lián)蛋白分子相互作用。

2.2較低侵入性的細(xì)菌

可用于本發(fā)明并已經(jīng)在文獻(xiàn)中描述為非侵入性的或至少比前文部分(2.1)中列出的細(xì)菌侵入性弱的細(xì)菌的實例包括，但不限于耶爾森菌屬物種(yersiniaspp.)、大腸桿菌屬物種(escherichiaspp.)、克雷伯氏菌屬物種(klebsiellaspp.)、博德特氏菌屬物種(bordetellaspp.)、奈瑟氏球菌屬物種(neisseriaspp.)、氣單胞菌屬物種(aeromonasspp.)、弗朗西絲氏菌屬物種(franciesellaspp.)、棒桿菌屬物種(corynebacteriumspp.)、檸檬酸細(xì)菌屬物種(citrobacterspp.)、衣原體屬物種(chlamydiaspp.)、嗜血菌屬物種(hemophilusspp.)、布魯氏菌屬物種(brucellaspp.)、分枝桿菌屬物種(mycobacteriumspp.)、軍團(tuán)桿菌屬物種(legionellaspp.)、紅球菌屬物種(rhodococcusspp.)、假單胞菌屬物種(pseudomonasspp.)、纏繞桿菌屬物種(helicobacterspp.)、弧菌屬物種(vibriospp.)、芽孢桿菌屬物種(bacillusspp.)和丹毒絲菌屬物種(erysipelothrixspp.)。修飾這些細(xì)菌以增加它們的侵入潛力是必需的。細(xì)菌也可處于半活狀態(tài)用于提高穩(wěn)定性和/或效率。所用的特定耶爾森菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。

可用于本發(fā)明的耶爾森菌菌株的實例包括小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌(y.enterocolitica)(atccno.9610)或鼠疫耶爾森氏菌(y.pestis)(atccno.19428)。減毒的耶爾森菌菌株如小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌yeo3-r2(al-hendy等infect.immun.,60:870-875(1992))或小腸結(jié)腸炎耶爾森氏菌aroa(o'gaora等micro.path.,9:105-116(1990))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘?，可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒耶爾森菌菌株。

所用的特定大腸桿菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的大腸桿菌菌株的實例包括大腸桿菌h10407(elinghorst等infect.immun.,60:2409-2417(1992))和大腸桿菌efc4、cft325和cpz005(donnenberg等j.infect.dis.,169:831-838(1994))。減毒的大腸桿菌菌株，如減毒的火雞病原體大腸桿菌02carab突變體(kwaga等infect.immun.,62:3766-3772(1994))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘?，可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒大腸桿菌菌株。

所用的特定克雷伯氏菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。

可用于本發(fā)明的克雷伯氏菌菌株的實例包括肺炎雷伯氏菌(k.pneumoniae)(atccno.13884)。減毒的克雷伯氏菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定博德特氏菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。

可用于本發(fā)明的博德特氏菌菌株的實例包括氣管炎博德特氏菌(b.bronchiseptica)(atccno.19395)。減毒的博德特氏菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定奈瑟氏球菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的奈瑟氏球菌菌菌株的實例包括腦膜炎奈瑟氏球菌(n.meningitidis)(atccno.13077)和淋病奈瑟氏球菌(n.gonorrhoeae)(atccno.19424)。減毒的奈瑟氏球菌菌株，如淋病奈瑟氏球菌ms11aro突變體(chamberlain等micro.path.,15:51-63(1993))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘撸赏ㄟ^引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒奈瑟氏球菌菌株。所用的特定氣單胞菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的氣單胞菌菌株的實例包括a.eucrenophila(atccno.23309)?；蛘呖赏ㄟ^引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒氣單胞菌菌株。

所用的特定弗朗西絲氏菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的弗朗西絲氏菌菌株的實例包括土拉熱弗朗西絲氏菌(f.tularensis)(atccno.15482)。減毒的弗朗西絲氏菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定棒桿菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的棒桿菌菌株的實例包括假結(jié)核病棒桿菌(c.pseudotuberculosis)(atccno.19410)。減毒的棒桿菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定檸檬酸細(xì)菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的檸檬酸細(xì)菌菌株的實例包括弗氏檸檬酸細(xì)菌(c.freundii)(atccno.8090)。減毒的檸檬酸細(xì)菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定衣原體菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的衣原體菌株的實例包括c.pneumoniae(atccno.vrl310)。減毒的衣原體菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定嗜血桿菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的嗜血桿菌菌株的實例包括h.sornmis(atccno.43625)。減毒的嗜血桿菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定布魯氏菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的布魯氏菌菌株的實例包括流產(chǎn)布魯氏菌(b.abortus)(atccno.23448)。減毒的布魯氏菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定分枝桿菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的分枝桿菌菌株的實例包括胞內(nèi)分枝桿菌(m.intracelhilare)(atccno.13950)和結(jié)核分枝桿菌(m.tuberculosis)(atccno.27294)。減毒的分枝桿菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定軍團(tuán)桿菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的軍團(tuán)桿菌菌株的實例包括l.pneumophila(atccno.33156)。減毒的軍團(tuán)桿菌菌株，如l.pneumophilamip突變體(ott,femsmicro.rev.,14:161-176(1994))優(yōu)選用于本發(fā)明?；蛘?，可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒軍團(tuán)桿菌菌株。

所用的特定紅球菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的紅球菌菌株的實例包括r.equi(atccno.6939)。減毒的紅球菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定假單胞菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的假單胞菌菌株的實例包括銅綠假單胞菌(p.aeruginosa)(atccno.23267)。減毒的假單胞菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定纏繞桿菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的纏繞桿菌菌株的實例包括h.mustelae(atccno.43772)。減毒的纏繞桿菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明，并可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建。

所用的特定沙門氏菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的沙門氏菌菌株的實例包括傷寒沙門氏菌(atccno.7251)和鼠傷寒沙門氏菌(atccno.13311)。減毒的沙門氏菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明并包括傷寒沙門氏菌arocarod(hone等vacc,9:810-816(1991))和鼠傷寒沙門氏菌aroa突變體(mastroeni等micro.pathol,13:477-491(1992)))?；蛘撸赏ㄟ^引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒沙門氏菌菌株。所用的特定弧菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。

可用于本發(fā)明的弧菌菌株的實例包括霍亂弧菌(vibriocholerae)(atccno.14035)和辛辛那提弧菌(vibriocincinnatiensis)(atccno.35912)。減毒的弧菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明并包括霍亂弧菌rsi毒力突變體(taylor等j.infect.dis.,170:1518-1523(1994))和霍亂弧菌ctxa、ace、zot、cep突變體(waldor等j.infect.dis.,170:278-283(1994))?；蛘撸赏ㄟ^引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒弧菌菌株。

所用的特定桿菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的。可用于本發(fā)明的桿菌菌株的實例包括枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)(atccno.6051)。減毒的桿菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明并包括b.anthracis突變體px01(welkos等micro.pathol,14:381-388(1993))和減毒的bcg菌株(stover等nat,351:456-460(1991))?；蛘?，可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒桿菌菌株。

所用的特定丹毒絲菌菌株對本發(fā)明并非是至關(guān)重要的?？捎糜诒景l(fā)明的丹毒絲菌菌株的實例包括豬丹毒丹毒絲菌(erysipelothrixrhusiopathiae)(atccno.19414)和扁桃體丹毒絲菌(erysipelothrixtonsillarum)(atccno.43339)。減毒的沙門氏菌菌株優(yōu)選用于本發(fā)明并包括豬丹毒丹毒絲菌kg-ia和kg-2(watarai等j.vet.med.sci.,55:595-600(1993))和豬丹毒丹毒絲菌orvac突變體(markowska-daniel等int.j.med.microb.virol.parisit.infect.dis.,277:547-553(1992))?；蛘?，可通過引入上文所述用于志賀氏菌屬物種的(i)到(vii)組中的一個或多個減毒突變構(gòu)建新的減毒丹毒絲菌菌株。

2.3用于增加菌株侵入性性質(zhì)的方法

無論已經(jīng)將生物常規(guī)描述為侵入性的還是非侵入性的，可改造這些生物以增加它們的侵入性性質(zhì)，例如通過模擬志賀氏菌屬物種、利斯特氏菌屬物種、立克次體屬物種或腸侵染性大腸桿菌屬物種的侵入性質(zhì)。例如，可向微生物中引入使微生物能夠進(jìn)入細(xì)胞(例如所述非侵入性細(xì)菌的天然宿主中的細(xì)胞)的細(xì)胞質(zhì)中的一個或多個基因。

本文稱為“細(xì)胞質(zhì)靶向基因”的此類基因的實例包括編碼能夠通過志賀氏菌，或腸侵染性大腸桿菌的類似侵入基因，或利斯特氏菌的利斯特氏菌溶素o侵入的蛋白質(zhì)的基因，像已知此類技術(shù)產(chǎn)生廣泛的能夠侵襲并進(jìn)入動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中的侵入細(xì)菌一樣(foπnal等infect.immun.,46:465(1984)；bielecke等nature,345:175-176(1990)；small等:microbiology-1986,第121-124頁,levine等編著,americansocietyformicrobiology,washington,d.c.(1986)；zychlinsky等molec.micro.,11:619-627(1994)；gentschev等(1995)infection&immunity63:4202；isberg,r.r.和s.falkow(1985)nature317:262；和isberg,r.r.等(1987)cell50:769)。用于向細(xì)菌菌株中轉(zhuǎn)移上述細(xì)胞質(zhì)靶向基因的方法為本領(lǐng)域所熟知?？上蚣?xì)菌引入另一優(yōu)選基因以增加其侵入特征，該基因編碼來自假結(jié)核耶爾森氏菌(yersiniapseudotuberculosis)的侵染素蛋白質(zhì)，(leong等emboj.,9:1979(1990))。侵染素也可與listeriolysin組合引入，由此，相對于引入任一這些基因，進(jìn)一步增加細(xì)菌的侵入特征。為說明性目的，已經(jīng)對上述基因做了描述；然而，對于本領(lǐng)域技術(shù)人員顯而易見的是來自一種或更多種來源的任何基因或基因組合將足夠，所述基因或基因組合參與將分子，尤其是rna或編碼rna的dna分子從微生物遞送到細(xì)胞，例如動物細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)中。因此，此類基因不限于細(xì)菌基因，并包括病毒基因，如流感病毒血凝素ha-2，其促進(jìn)胞內(nèi)體裂解作用(endosmolysis)(plank等j.biol.chem.,269:12918-12924(1994))。也可通過例如pcr擴(kuò)增從dna獲得上述靶向細(xì)胞質(zhì)的基因，從攜帶期望的靶向細(xì)胞質(zhì)的基因的侵入性細(xì)菌中分離所述dna?？蓮谋绢I(lǐng)域，例如上文列出的參考文獻(xiàn)和/或在因特網(wǎng)(www.ncbi.nlm.nih.gov/)上可公開獲得的genbank中獲得的核苷酸序列設(shè)計pcr的引物?？稍O(shè)計pcr引物以擴(kuò)增細(xì)胞質(zhì)靶向基因、細(xì)胞質(zhì)靶向操縱子、細(xì)胞質(zhì)靶向基因簇或細(xì)胞質(zhì)靶向基因調(diào)節(jié)子。所用的pcr策略將依賴于細(xì)胞質(zhì)靶向基因或靶侵入性細(xì)菌中基因的遺傳結(jié)構(gòu)。設(shè)計pcr引物，使其含有與靶dna序列開始和末端的dna序列同源的序列。然后可以例如通過使用hfr轉(zhuǎn)移或質(zhì)粒活動(miller,ashortcourseinbacterialgenetics,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.(1992)；bothwell等上文；和ausubel等上文)、噬菌體介導(dǎo)轉(zhuǎn)導(dǎo)(deboer,上文；miller,上文；和ausubel等上文)、化學(xué)轉(zhuǎn)化(bothwell等上文；ausubel等上文)、電穿孔(bothwel等上文；ausubel等上文；和sambrook,molecularcloning:alaboratorymanual,coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.)和物理轉(zhuǎn)化技術(shù)(johnston等上文；和bothwell,上文)將細(xì)胞質(zhì)靶向基因引入靶細(xì)菌菌株中。細(xì)胞質(zhì)靶向基因可整合到可溶性噬菌體中(deboer等cell,56:641-649(1989)),質(zhì)粒載體s(curtiss等上文)或剪接到靶菌株的染色體中(hone等上文)。

如上所述，除了遺傳改造細(xì)菌提高其侵入性性質(zhì)外，也可通過將侵入因子與細(xì)胞連接，以修飾細(xì)菌。因此，在一個實施方案中，通過用侵入因子，例如具有足夠侵入力的蛋白質(zhì)侵染素、侵染素衍生物或其片段共價或非共價包被細(xì)菌致使細(xì)菌更具侵入性。事實上，已經(jīng)顯示用來自假結(jié)核耶爾森氏菌的純化侵染素包被非侵入性細(xì)菌細(xì)胞或侵染素的羧基末端192個氨基酸能夠進(jìn)入哺乳動物細(xì)胞(leong等emboj.9:1979(1990))。此外，侵染素的羧基末端區(qū)包被的乳膠球被哺乳動物細(xì)胞有效內(nèi)化，如用抗體固定的侵染素包被的金黃色葡萄球菌(staphylococcusaureus)菌株(綜述見于isberg和trailvannhieuann.rev.genet.27:395(1994))?；蛘?，也可用特異性結(jié)合細(xì)菌進(jìn)入因子識別的表面分子的抗體、其變體或其片段包被細(xì)菌。例如，已經(jīng)顯示如果用針對整聯(lián)蛋白分子，例如α5β1(稱作與細(xì)菌侵染素蛋白質(zhì)相互作用的表面分子)的單克隆抗體包被細(xì)菌，那么它們則被內(nèi)化(isberg和tranvannhieu,上文)?？筛鶕?jù)本領(lǐng)域已知的方法制備此類抗體。通過例如用抗體包被細(xì)菌，使細(xì)菌與具有抗體識別的表面受體的真核細(xì)胞接觸，并根據(jù)上述方法監(jiān)測細(xì)胞內(nèi)細(xì)菌的存在來檢測抗體在調(diào)節(jié)細(xì)菌侵入力中的功效。用于連接侵入因子與細(xì)菌表面的方法為本領(lǐng)域所知，包括交聯(lián)。

3.靶細(xì)胞

本發(fā)明提供用于合成、加工并向任何類型的靶細(xì)胞遞送rna的方法。如本文所用，術(shù)語“靶細(xì)胞”指細(xì)菌侵入的細(xì)胞，即具有用于細(xì)菌識別必需的表面受體的細(xì)胞。

優(yōu)選地，靶細(xì)胞是真核細(xì)胞。甚至更優(yōu)選地，靶細(xì)胞是動物細(xì)胞。將“動物細(xì)胞”定義為來自或存在于多細(xì)胞生物中的有核的，不含葉綠體細(xì)胞，所述多細(xì)胞生物的分類(taxanomic)位置位于動物國界。該細(xì)胞可以存在于完整動物、原代細(xì)胞培養(yǎng)物、外植體培養(yǎng)物或轉(zhuǎn)化的細(xì)胞系中。該細(xì)胞的特定組織來源并非對本發(fā)明至關(guān)重要。用于本發(fā)明的受體動物細(xì)胞對其并非至關(guān)重要，并包括出現(xiàn)在動物國界內(nèi)的所有生物中的或來自動物國界內(nèi)的所有生物，如哺乳類、魚類、鳥類、爬行類的那些生物。

優(yōu)選的動物細(xì)胞是哺乳動物細(xì)胞，如人、牛、綿羊、豬、貓、犬、山羊、馬和靈長類細(xì)胞。最優(yōu)選的動物細(xì)胞是人細(xì)胞。

在優(yōu)選的實施方案中，靶細(xì)胞是黏膜表面。某些腸病原體，例如大腸桿菌、志賀氏菌、利斯特氏菌和沙門氏菌自然適合用于該應(yīng)用，因為這些生物具有粘著并侵入宿主黏膜表面的能力(kreig等上文)。因此，在本發(fā)明中，此類細(xì)菌可向宿主黏膜區(qū)室中的細(xì)胞遞送rna分子或編碼rna的dna。

盡管某些類型的細(xì)菌具有某一向性，即趨向優(yōu)選的靶細(xì)胞，可通過選擇對期望的細(xì)胞類型具有向性的細(xì)菌或被修飾以能夠侵入期望細(xì)胞類型的細(xì)菌完成rna或編碼rna的dna向某一類型細(xì)胞的遞送。因此，如上討論，例如可遺傳改造細(xì)菌以模擬黏膜組織向性和侵入性性質(zhì)，由此允許所述細(xì)胞侵入黏膜組織，并向這些位點(diǎn)中的細(xì)胞遞送rna或編碼rna的dna。

細(xì)菌也可靶向其他類型的細(xì)胞。例如，可通過修飾細(xì)菌以在其表面上表達(dá)間日瘧蟲(plasmodiumvivax)網(wǎng)織紅細(xì)胞結(jié)合蛋白質(zhì)-1或-2，或-1和-2(其特異性結(jié)合人和靈長類中的紅細(xì)胞)，而使細(xì)菌靶向人和靈長類的紅細(xì)胞(galinski等cell,69:1213-1226(1992))。在另一實施方案中，修飾細(xì)菌以在其表面上具有脫唾液酸血清類黏蛋白，其為肝細(xì)胞上脫唾液酸糖蛋白受體的配體(wu等j.biol.chem.,263:14621-14624(1988))。在另一實施方案中，用已經(jīng)顯示靶向質(zhì)粒吸收到具有胰島素受體的細(xì)胞的胰島素多聚l賴氨酸包被細(xì)菌(rosenkranz等expt.cellres.,199:323-329(1992))。還在本發(fā)明范圍內(nèi)的是被修飾以在其表面上具有允許肝細(xì)胞具有向性的單核細(xì)胞增生利斯特氏菌的p60(hess等infect.immun.,63:2047-2053(1995))或來自通過結(jié)合肝素、硫酸肝素和膠原引起特異性結(jié)合哺乳動物細(xì)胞外基質(zhì)的克魯茲錐蟲(trypanosomacruzi)的60kd表面蛋白(ortega-barria等cell,67:411-421(1991))的細(xì)菌。

在另一實施方案中，細(xì)胞可被修飾以變成遞送rna的細(xì)菌的靶細(xì)胞。因此，可修飾細(xì)胞以表達(dá)細(xì)菌識別的表面抗原(即侵入因子的受體)，用于其進(jìn)入細(xì)胞。可通過向細(xì)胞中引入編碼侵入因子的受體的核酸修飾細(xì)胞，使得表面抗原在期望條件下表達(dá)?；蛘撸捎们秩胍蜃拥氖荏w包被細(xì)胞。侵入因子的受體包括屬于整聯(lián)蛋白受體超家族的蛋白質(zhì)。多種細(xì)菌和其他微生物識別的整聯(lián)蛋白受體類型的列表可見于例如isberg和tranvannhieuann.rev.genet.27:395(1994)。用于整聯(lián)蛋白亞基的核苷酸序列可見于例如在因特網(wǎng)上可公共獲得的genbank。

如上所述，其他靶細(xì)胞包括魚類、鳥類和爬行類動物細(xì)胞。下文中描述了對魚類、鳥類和爬行類動物細(xì)胞具有天然侵入性的細(xì)菌的實例。

可天然進(jìn)入魚類細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的細(xì)菌的實例包括，但不限于氣單胞菌(aeromonassalminocida)(atccno.33658)和殺鮭氣單胞菌(aeromonasschuberii)(atccno.43700)。減毒的細(xì)菌優(yōu)選用于本發(fā)明，并包括a.salmonicidiavapa(gustafson等j.moi.biol.,237:452-463(1994))或a.salmonicidia芳香族依賴性突變體(vaughan等infect.immun.,61:2172-2181(1993))。

可天然進(jìn)入鳥類細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的細(xì)菌的實例包括，但不限于雞沙門氏菌(salmonellagalinarum)(atccno.9184)、腸炎沙門氏菌(salmonellaenteriditis)(atccno.4931)和鼠傷寒沙門氏菌(atccno.6994)。減毒的細(xì)菌優(yōu)選于本發(fā)明并包括減毒的沙門氏菌菌株如雞沙門氏菌(s.galinarum)cyacrp突變體(curtiss等(1987)上文)或腸炎沙門氏菌(s.enteritidis)aroa芳香族依賴性突變體cvl30(cooper等infect.immun.,62:4739-4746(1994))。

可天然進(jìn)入爬行類動物細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)的細(xì)菌的實例包括，但不限于鼠傷寒沙門氏菌(atccno.6994)。減毒的細(xì)菌優(yōu)選用于本發(fā)明并包括減毒的菌株如鼠傷寒沙門氏菌芳香族依賴性突變體(hormaeche等上文)。

本發(fā)明還提供向其他真核細(xì)胞例如植物細(xì)胞遞送rna，只要具有天然或已被修飾變得具有侵入性后能夠侵入此類細(xì)胞的微生物?？汕秩胫参锛?xì)胞的微生物的實例包括根瘤農(nóng)桿菌(agrobacteriumtumerfacium)，其使用通過特異受體結(jié)合植物細(xì)胞的菌毛樣結(jié)構(gòu)，然后通過與細(xì)菌結(jié)合類似的過程向植物細(xì)胞中遞送至少一些其內(nèi)容物。

下文說明的是根據(jù)本發(fā)明方法可向其中遞送rna的細(xì)胞系。

人類細(xì)胞系的實例包括但不限于atccno.ccl62、ccl159、htb151、htb22、ccl2、crl1634、crl8155、htb61和htb104。

牛細(xì)胞系的實例包括atccno.crl6021、crl1733、crl6033、crl6023、ccl44和crl1390。綿羊細(xì)胞系的實例包括atccno.crl6540、crl6538、crl6548和crl6546。

豬細(xì)胞系的實例包括atccno.cl184、crl6492和crl1746。

貓細(xì)胞系的實例包括crl6077、crl6113、crl6140、crl6164、ccl94、ccl150、crl6075和crl6123。

水牛細(xì)胞系的實例包括ccl40和crl6072。

犬細(xì)胞系的實例包括atccno.crl6213、ccl34、crl6202、crl6225、crl6215、crl6203和crl6575。

山羊來源細(xì)胞系的實例包括atccno.ccl73和atccno.crl6270。

馬來源細(xì)胞系的實例包括atccno.ccl57和crl6583。

鹿細(xì)胞系的實例包括atccno.crl6193-6196。

靈長類來源細(xì)胞系的實例包括來自黑猩猩的那些細(xì)胞系，如atccno.crl6312、crl6304和crl1868；猴細(xì)胞系如atccno.crl1576、ccl26和ccl161；猩猩(orangautan)細(xì)胞系atccno.crl1850；和大猩猩細(xì)胞系atccno.crl1854。

3.1癌干細(xì)胞和非癌干細(xì)胞

癌干細(xì)胞(csc)是癌細(xì)胞的亞群，所述癌細(xì)胞具有通常與干細(xì)胞相關(guān)的特征，如自我更新以及分化成多種細(xì)胞類型的能力。近期研究揭示csc是高度致瘤的，而大量癌細(xì)胞是非致瘤的。根據(jù)這些研究，csc盡管僅占腫瘤細(xì)胞的一小部分(通常低于1％)，但卻是持續(xù)惡性瘤生長的根本原因并經(jīng)常成為轉(zhuǎn)移的引發(fā)劑。csc易于對抗醫(yī)院中目前常用的化學(xué)治療及其他腫瘤靶向治療。

csc也難以分離，而且還難以培養(yǎng)用于實驗室目的。需要特殊的分離方法，并且該細(xì)胞易于在培養(yǎng)中極其快地失去干細(xì)胞特性。因此，通常僅有窄的面用于體外csc實驗。然而，如下文實施例部分中所述的實例中所示，本發(fā)明的方法甚至在分離的干細(xì)胞中引起基因沉默中顯示令人驚訝的潛能和特異性。

具體地，攜帶根據(jù)本發(fā)明構(gòu)建的載體的細(xì)菌顯著降低了靶基因(分別為cscp1和cscp3)的表達(dá)。靶細(xì)胞的表型變化，例如凋亡(實施例3和4)和球形成(spherogenesis)抑制(實施例5)也起因于本發(fā)明細(xì)菌對細(xì)胞的處理，提供所述靶基因在細(xì)胞存活、分裂和死亡程序中起重要作用的確證。

因為在微小細(xì)胞群和不可培養(yǎng)細(xì)胞群中具有引起基因沉默的確證能力，技術(shù)為體外靶向/途徑發(fā)現(xiàn)并為在包括癌干細(xì)胞和共有一些csc特性的非癌干細(xì)胞的任何細(xì)胞群中設(shè)計治療方案提供平臺。

本發(fā)明還提供這樣的實例，其中非csc癌細(xì)胞，即“正常”或分化癌細(xì)胞中的實質(zhì)細(xì)胞死亡起因于本發(fā)明(實施例6)的細(xì)菌的處理，進(jìn)一步證實了本發(fā)明的治療潛力。

4.體內(nèi)和體外研究和藥物開發(fā)

本發(fā)明的rnai方法也可用于產(chǎn)生暫時的“敲減”遺傳動物模型，例如小鼠模型，這與遺傳改造以在體內(nèi)發(fā)現(xiàn)和/或確認(rèn)基因功能的敲除模型相反。

目前，沒有用于體內(nèi)靶標(biāo)確認(rèn)的好系統(tǒng)。目前的敲除動物模型費(fèi)時，勞動強(qiáng)度大，并需要在胚胎期進(jìn)行基因?qū)ぐ?。此外，目前的敲除動物模型不能用于檢測體內(nèi)確定的腫瘤。目前的rnai遞送方法也不適合于體內(nèi)靶標(biāo)確認(rèn)。相反，本發(fā)明的細(xì)菌介導(dǎo)的rnai方法利用適合于例如在確定腫瘤中快速并有效的體內(nèi)靶標(biāo)確認(rèn)的系統(tǒng)。具體地，細(xì)菌比病毒載體容易控制并靶向。此外，本發(fā)明方法模仿治療干涉。

例如，具有異種移植的人腫瘤的轉(zhuǎn)基因小鼠可用作敲減動物模型以通過使用本發(fā)明載體和細(xì)菌確認(rèn)候選治療的效率。此類非致病性菌一旦引入動物模型，將產(chǎn)生non-shrna的加工產(chǎn)物，例如腫瘤細(xì)胞中針對靶基因的mrna的短rna雙鏈體的混合物。這提供進(jìn)行基因敲減分析和檢測候選治療的抗腫瘤活性的工具。

可使用本發(fā)明容易地完成體外靶標(biāo)確認(rèn)。在一個實施方案中，測定在已經(jīng)鑒定表型(例如癌生長)的靶標(biāo)后包括以下步驟：構(gòu)建編碼non-shrna(例如長dsrna)的載體，所述non-shrna包含與該靶基因的mrna基本互補(bǔ)的序列；用所述載體轉(zhuǎn)化活的侵入性細(xì)菌；用所述活的侵入性細(xì)菌體外轉(zhuǎn)染癌細(xì)胞；并觀察細(xì)胞增殖是否受到影響。

本發(fā)明的方法也可用作研究和藥物開發(fā)的體外轉(zhuǎn)染工具。

這些體內(nèi)和體外方法使用具有期望性質(zhì)(侵入力、減毒、可控性)的細(xì)菌。例如雙歧桿菌(bifidobacteria)和利斯特氏菌用于進(jìn)行本發(fā)明的細(xì)菌介導(dǎo)的rnai方法。使用質(zhì)粒將侵入力以及一個或幾個dsrna的真核或原核轉(zhuǎn)錄物賦予細(xì)菌。

5.藥物組合物

在本發(fā)明優(yōu)選的實施方案中，含有rna分子和/或編碼此類分子的dna的侵入性細(xì)菌通過靜脈、肌內(nèi)、皮內(nèi)、腹膜內(nèi)、經(jīng)口、鼻內(nèi)、眼內(nèi)、直腸內(nèi)、陰道內(nèi)、骨內(nèi)、口腔、浸入和尿道內(nèi)灌輸(inoculation)途徑引入動物內(nèi)。

待向受試者施用的本發(fā)明的活的侵入性細(xì)菌的量根據(jù)受試者的類別，以及待治療的疾病或病征不同而不同。通常，所用的劑量將是每個受試者約103到1015活菌，優(yōu)選約104到1012活菌?？梢詢龈苫蜴咦有问街苽浼?xì)菌，用于儲存或藥學(xué)用途。

本發(fā)明的侵入性細(xì)菌通常與可藥用載體和/或稀釋劑一起施用。所用的特定可藥用載體和/或稀釋劑對本發(fā)明并非至關(guān)重要。稀釋劑的實例包括磷酸緩沖鹽水、緩沖胃中胃酸的緩沖液，如含有蔗糖的檸檬酸鹽緩沖液(ph7.0)、單獨(dú)的碳酸氫鹽緩沖液(ph7.0)(levine等j.clin.invest,79:888-902(1987)；和black等j.infect.dis.,155:1260-1265(1987))，或含抗壞血酸、乳糖和任選地天冬苯丙二肽酯的碳酸氫鹽緩沖液(ph7.0)(levine等lancet,11:467-470(1988))。載體的實例包括例如在脫脂牛奶中發(fā)現(xiàn)的蛋白質(zhì)、糖(例如蔗糖)或聚乙烯吡咯烷酮。通常將以約0.1-30％(w/v)，但優(yōu)選1-10％(w/v)范圍內(nèi)的濃度內(nèi)使用這些載體。

下文所示是可用于遞送特異途徑的其他可藥用載體或稀釋劑。任何此類載體或稀釋劑可用于施用本發(fā)明的細(xì)菌，只要所述細(xì)菌仍然能夠侵入靶細(xì)胞。可進(jìn)行體外或體內(nèi)測試侵入力來確定適當(dāng)?shù)南♂寗┖洼d體。可配制本發(fā)明的組合物用于多種類型的施用，包括全身和局部施用或定域施用。也可包括凍干形式，只要細(xì)菌在接觸靶細(xì)胞或向受試者施用后具有侵入性。技術(shù)和配制通?？梢娪趓emmington'spharmaceuticalsciences,meadepublishingco.,easton,pa。對于全身施用，優(yōu)選注射，包括肌內(nèi)、靜脈、腹膜內(nèi)和皮下施用。對于注射，可在液體溶液中，優(yōu)選在生理學(xué)相容的緩沖液如hank's溶液或ringer's溶液中配制本發(fā)明的組合物，例如細(xì)菌。

對于口服給藥，藥物組合物可以采取例如通過利用可藥用賦形劑，如結(jié)合劑(例如預(yù)膠化玉米淀粉、聚乙烯吡咯酮或羥丙基甲基纖維素)；填充劑(例如，乳糖、微晶纖維素或磷酸氫鈣)；潤滑劑(例如硬脂酸鎂、滑石或二氧化硅)；崩解劑(例如馬鈴薯淀粉或淀粉羥乙酸鈉)；或濕潤劑(例如十二烷基硫酸鈉)的常規(guī)手段制備的片劑或膠囊劑形式?？赏ㄟ^本領(lǐng)域所熟知的方法包被所述片劑。用于口服給藥的液體制劑可采取例如溶液、糖漿劑或懸浮液的形式，或者它們可呈現(xiàn)為干產(chǎn)品，在使用前用水或其他合適的載體構(gòu)建?？赏ㄟ^利用可藥用添加劑如懸浮劑(例如山梨醇糖漿、纖維素衍生物或氫化食用脂)；乳化劑(例如卵磷脂或阿拉伯膠)；非水性載體(例如杏仁油、油酯類(oilyesters)、乙醇或分餾的植物油)；和防腐劑(例如對羥基苯甲酸甲酯或?qū)αu基苯甲酸丙酯或山梨酸)，用常規(guī)方法制備此類液體制劑。所述制劑也含有緩沖鹽、增味劑、著色劑，適當(dāng)時還含有甜味劑。

可適當(dāng)?shù)嘏渲朴糜诳诜┯玫闹苿?，以給出活性化合物的可控釋放。對于口腔施用，所述組合物可采取常規(guī)方式配制的片劑或錠劑形式。

對于吸入施用，使用合適的推進(jìn)劑，例如二氯二氟甲烷、三氯氟甲烷、二氯四氟乙烷、二氧化碳或其他合適氣體，以呈現(xiàn)自加壓包裝或噴霧器的噴霧劑形式常規(guī)遞送根據(jù)本發(fā)明使用的藥物組合物。在加壓氣霧劑的情況下，可通過提供閥門遞送測定量來確定劑量單元?？膳渲朴糜谖肫骰虼党銎髦欣缑髂z的膠囊和藥筒，所述吸入器或吹出器含有組合物的粉劑混合物，例如細(xì)菌和合適的粉劑基質(zhì)，如乳糖或淀粉。

可配制藥物組合物用于通過注射，例如通過快速濃注或連續(xù)輸注來進(jìn)行腸胃外施用?？梢詥挝粍┝啃问剑缭诎碴郴蚝刑砑臃栏瘎┑亩鄤┝咳萜髦刑峁┯糜谧⑸涞闹苿?。所述組合物可采取這樣的形式，如油載體或水載體中的懸浮液、溶液或乳劑，并可含有配制劑(fomiulatoryagent)，如懸浮劑、穩(wěn)定劑和/或分散劑?；蛘?，活性成分可以是在使用前用合適載體，例如滅菌注射用水構(gòu)建的粉劑形式。

也可在直腸、陰道內(nèi)或尿道內(nèi)組合物中配制藥物組合物，例如含有常規(guī)栓劑基質(zhì)如可可脂或其他甘油酯類的栓劑或保留灌腸劑。全身施用也可通過經(jīng)黏膜或經(jīng)皮途徑。對于經(jīng)黏膜或經(jīng)皮施用，在制劑中使用適合于待滲透屏障的滲透劑。此類滲透劑通常為本領(lǐng)域所知，并包括例如用于經(jīng)黏膜施用膽汁鹽和夫西地酸衍生物。此外，去污劑也用于促進(jìn)滲透。經(jīng)黏膜施用可通過鼻腔噴霧或使用栓劑。對于局部施用，本發(fā)明細(xì)菌可配制成本領(lǐng)域通常已知的軟膏劑、藥膏、凝膠或膏狀物，只要所述細(xì)菌在接觸靶細(xì)胞后仍然具有侵入性。

如果需要，可在含有一個或多個單位劑量形式的包裝或分配裝置和/或藥盒中提供組合物，所述單位劑量形式含有活性成分。所述包裝例如包含金屬或塑料薄片，如泡罩包裝。所述包裝或分配裝置可具有用于施用的說明書。

含有待引入的rna或編碼rna的dna的侵入性細(xì)菌可用于感染在體外培養(yǎng)的動物細(xì)胞，如從受試者獲得的細(xì)胞。然后可將這些體外感染的細(xì)胞經(jīng)過靜脈內(nèi)、肌內(nèi)、皮內(nèi)或腹膜內(nèi)，或通過允許細(xì)胞進(jìn)入宿主組織的任何灌輸途徑引入動物，例如所述細(xì)胞最初來源的受試者。當(dāng)向個體細(xì)胞中遞送rna時，所施用的活生物的劑量是每個細(xì)胞約0.1到106，優(yōu)選約102到104細(xì)菌的多重性感染。

在本發(fā)明的另一實施方案中，細(xì)菌也可向細(xì)胞，例如然后可從中收集或純化蛋白質(zhì)的動物細(xì)胞中遞送編碼蛋白質(zhì)的rna分子。例如，可在組織培養(yǎng)細(xì)胞中產(chǎn)生蛋白質(zhì)。

6.治療和預(yù)防用途

本發(fā)明的rnai方法可用于治療和/或預(yù)防多種疾病，包括總結(jié)于dykxhoorn,novina&sharp.nat.rev.mol.cellbiol.4:457-467(2003)；kim&rossi,naturerev.genet.8:173-184(2007)；defougerolles,等naturerev.drugdiscov.6:443-453(2007)中的疾病。

在一個實施方案中，本發(fā)明可用作癌治療或預(yù)防癌。該方法受沉默或敲減基因的影響，所述基因參與細(xì)胞增殖或其他癌表型。用于癌治療的本發(fā)明的細(xì)菌優(yōu)選為改造以安全搜出并殺死腫瘤的細(xì)菌(forbes,naturebiotechnology24:1484-1485(2006)。所述細(xì)菌可以是專性厭氧菌，如梭菌(clostridium)novyi-nt，或兼性厭氧菌，如鼠傷寒沙門氏菌和大腸桿菌(如上)。

這些基因的實例是k-ras和β-聯(lián)蛋白。具體地，k-ras和β-聯(lián)蛋白是基于rnai的結(jié)腸癌的治療的靶標(biāo)。這些致癌基因是有活力的并在大多數(shù)臨床情況中是相關(guān)的。本發(fā)明的細(xì)菌介導(dǎo)的rnai方法應(yīng)用于到達(dá)腸道的結(jié)腸癌的治療和預(yù)防。這些方法也用于治療攜帶異種移植腫瘤的動物，以在腸腫瘤發(fā)生的k-rasv12模型中治療和預(yù)防癌，并在腺瘤性結(jié)腸息肉病min小鼠模型(apc-min模型)中預(yù)防和治療腫瘤。在該模型中，所述小鼠具有有缺陷的apc基因，導(dǎo)致許多腸息肉和結(jié)腸息肉的形成，其用作人熟悉的腸腫瘤發(fā)生的腺瘤性結(jié)腸息肉病(fap)的動物模型。

本發(fā)明的rnai方法也可用于治療或預(yù)防病毒性疾病(例如肝炎)和遺傳病征。

本發(fā)明的rnai方法也可用于產(chǎn)生用于待使用的癌預(yù)防性“益生菌”，其尤其具有g(shù)i道或肝的靶標(biāo)。本發(fā)明的rnai方法用作針對炎癥疾病，例如肝炎、炎性腸病(ibd)或結(jié)腸炎的治療。這些方法用于沉默或敲減非癌基因靶標(biāo)(病毒基因，用于治療和預(yù)防乙肝、丙肝；炎性基因，用于治療和預(yù)防炎性腸病)和其他基因靶標(biāo)。

本發(fā)明的rnai方法可用于向消化道和結(jié)腸中遞送基因沉默(稱為結(jié)腸癌治療和預(yù)防)，并在多種疾病的治療中用于經(jīng)口應(yīng)用。在該實施方案的另一方面，基因沉默的遞送是經(jīng)腸外的。

細(xì)菌產(chǎn)生和/或遞送的dsrna可用于治療病毒感染，如hiv、hbv、hcv或其他疾病，其中可鑒定引起特定疾病的基因。因為本發(fā)明不需要鑒定對引起特定疾病的基因有效的精確sirna序列，無論該基因是內(nèi)源的還是病毒的，本發(fā)明的方法針對治療經(jīng)常突變或具有許多亞基因型的疾病基因或菌株尤其有利。典型的實例是攜帶經(jīng)常突變的基因的hiv。

7.文庫

本發(fā)明還提供稱為“文庫”的rnai文庫，其可以是基因組范圍的或是基因家族特異性的。文庫是隨機(jī)構(gòu)建、雙鏈、自混合、大小可控的rnai文庫。體外細(xì)胞系統(tǒng)rnai文庫篩選基于本發(fā)明的細(xì)菌rnai系統(tǒng)及顯微鏡成像分析。與目前的sirna/shrna文庫(需要關(guān)于“好的”sirna序列的先驗知識并且對某些細(xì)胞類型(例如分裂細(xì)胞和具有病毒受體的細(xì)胞)的應(yīng)用有限)相比，本發(fā)明的文庫可以靶向已知或未知的基因，并可應(yīng)用于寬范圍的細(xì)胞類型。此外，本發(fā)明的文庫適合于體內(nèi)確認(rèn)。

在實施方案中，參考圖2，本發(fā)明的文庫包含多個載體，各載體包含來自cdna文庫的一個cdna分子或cdna片段、第一個啟動子和第二個啟動子；其中所述第一個啟動子控制所述cdna分子或cdna片段的一條鏈的表達(dá)，第二個啟動子控制所述cdna分子或cdna片段的另一條鏈的表達(dá)。cdna片段可獲自cdna分子的酶消化。在一個實施方案中，通過酶消化產(chǎn)生約500bp的cdna片段。所構(gòu)建的載體可用于轉(zhuǎn)化細(xì)菌細(xì)胞。一旦載體轉(zhuǎn)錄來自cdna序列或cdna片段的dsrna，所述細(xì)菌細(xì)胞將dsrna加工成如前所述的更短的rna雙鏈體的混合物。在細(xì)菌感染靶細(xì)胞后，可選擇顯示期望的表型變化的細(xì)胞用于進(jìn)一步鑒定遺傳靶標(biāo)。cdna庫或文庫可來自哺乳動物細(xì)胞的總mrna，或基因家族或基因的mrna。

本發(fā)明進(jìn)一步提供篩選rnai文庫的方法。本發(fā)明包含用文庫感染哺乳動物細(xì)胞，并鑒定具用至少一種表型變化的哺乳動物細(xì)胞。所述至少一種表型變化選自細(xì)胞核數(shù)目、細(xì)胞核形態(tài)、細(xì)胞死亡、細(xì)胞增殖、dna片段化、細(xì)胞表面標(biāo)記和有絲分裂指數(shù)。本發(fā)明還包括在鑒定的哺乳動物細(xì)胞內(nèi)對載體的cdna分子進(jìn)行測序。

rnai文庫可用于大范圍上篩選疾病相關(guān)的藥物靶標(biāo)并確認(rèn)潛在的治療性分子藥物靶標(biāo)。它能夠用于評估所有人基因的功能并在對靶向基因未知的前體下進(jìn)行功能性基因組學(xué)實驗。它也可用于在橫跨不同疾病的相關(guān)細(xì)胞測定中進(jìn)行無偏差分析，并推論疾病中基因功能多維關(guān)系。

目前該領(lǐng)域中使用的rnai文庫包括混合的化學(xué)合成sirna文庫、基于病毒載體的shrna文庫；和雙鏈rna(dsrna)體外消化混合物。這些文庫需要針對已知基因逐一構(gòu)建或合成。它們通常大小受限，并且其中大部分甚至不可更新。在篩選時，需將這些文庫轉(zhuǎn)染至細(xì)胞體系中。

本發(fā)明提供產(chǎn)生并篩選rnai文庫的簡易方法。它將文庫構(gòu)建過程簡單化。為了構(gòu)建rnai文庫，不需要逐一構(gòu)建質(zhì)粒。本發(fā)明還去除了費(fèi)時且令人厭煩的產(chǎn)物純化步驟。此外，本發(fā)明可直接通過細(xì)胞感染遞送rnai，由此大大降低了文庫篩選的成本。

文庫可以是在整個基因組或基因家族上可操作的。對于各靶標(biāo)，它具有短rna雙鏈體的自混合混合物，而不是單一sirna。因此，不需要逐一合成sirna，并不需驗證sirna的有效序列。(zhaohf,等,naturemethods2:967–973(2005))。本發(fā)明可避免n末端功能，并由此導(dǎo)致徹底的功能敲減。文庫的篩選是基于選擇的雙盲篩選，且無偏差，即充分平衡遺傳信息。此外，使用文庫易于回蹤以找到候選基因。在一個在實施方案中，可使用文庫在轉(zhuǎn)基因及野生型動物中篩選用于治療性實驗的不同的癌癥相關(guān)靶標(biāo)。

通過以下不應(yīng)以任何形式解釋為限制的實施例來進(jìn)一步說明本發(fā)明。包括該申請全文中引用的文獻(xiàn)、授權(quán)的專利、公開的專利申請的所有引用參考文獻(xiàn)的內(nèi)容因此明確地引入作為參考，但不認(rèn)為它們是本發(fā)明之前的現(xiàn)有技術(shù)。除非另行說明，本發(fā)明的實踐將使用本領(lǐng)域技術(shù)中的細(xì)胞生物學(xué)、細(xì)胞培養(yǎng)、分子生物學(xué)、轉(zhuǎn)基因生物學(xué)、微生物學(xué)、重組dna和免疫學(xué)的常規(guī)技術(shù)。在參考文獻(xiàn)中詳細(xì)解釋了此類技術(shù)。參閱，例如由sambrook,fritsch和maniatis編著的molecularcloningalaboratorymanual,第2版(coldspringharborlaboratorypress:1989)；dnacloning,第i卷和第ii卷(d.n.glover編著,1985)；oligonucleotidesynthesis(m.j.gait編著,1984)；mullis等美國專利號:4,683,195；nucleicacidhybridization(b.d.hames&s.j.higgins編著1984)；transcriptionandtranslation(b.d.hames&s.j.higgins編著1984)；cultureofanimalcells(r.i.freshney,alanr.liss,inc.,1987)；immobilizedcellsandenzymes(irlpress,1986)；b.perbal,apracticalguidetomolecularcloning(1984)；thetreatise,methodsinenzymology(academicpress,inc.,n.y.)；genetransfervectorsformammaliancells(j.h.millerandm.p.calos編著,1987,coldspringharborlaboratory)；methodsinenzymology,第154卷和第155卷(wu等編著),immunochemicalmethodsincellandmolecularbiology(mayer和walker,編著,academicpress,london,1987)；handbookofexperimentalimmunology,第i-iv卷(d.m.weir和c.c.blackwell,編著,1986)；manipulatingthemouseembryo,(coldspringharborlaboratorypress,coldspringharbor,n.y.,1986)。

實施例

下文提供實施例，以進(jìn)一步說明本發(fā)明的不同特征。所述實施例也闡明用于實踐本發(fā)明的有用方法。這些實施例不限制本發(fā)明。

材料和方法

質(zhì)粒

參考圖3，構(gòu)建質(zhì)粒以包括具有兩個t7啟動子的rnai表達(dá)盒。通過兩個xbai位點(diǎn)將期望的dna分子克隆至質(zhì)粒中。

例如，從origenetechnologies購買cscp3/stat3和cscp1/β聯(lián)蛋白質(zhì)粒。將人stat3基因(genbank登錄號nm_139276)的782bp片段(從1至782位核苷酸)或cscp3/stat3的約300bp片段(從11至311位核苷酸)插入到rnai盒中。在以下實施例中使用的特定質(zhì)粒構(gòu)建體包含cscp3/stat3基因的300bp片段，使用如下引物將其克隆至基礎(chǔ)質(zhì)粒中：

cscp3/stat3-tpiv正向5’-ggatctagaatcagctacagcagc-3’(seqidno:1)

cscp3/stat3-tpiv反向5’-tcctctagagggcaatctccattg-3’(seqidno:2)

對于cscp1/β質(zhì)粒，使用標(biāo)準(zhǔn)分子克隆技術(shù)將全長人β聯(lián)蛋白基因(genbank登錄號nm_001904)的567bp片段(215至783位核苷酸)插入到質(zhì)粒的rnai表達(dá)盒中。

對于載體構(gòu)建，按照標(biāo)準(zhǔn)分子生物學(xué)技術(shù)將t7終止子復(fù)性，并用bamhi/xbai或xbai/sali消化。隨后使用以下引物將終止子克隆至載體的bamhi/xbai或xbai/sali位點(diǎn)：

bamhi正向：

5′acggatcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggtctagaggatccac3’(seqidno：3)

bamhi反向：

5’gtggatcctctagaccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggatccgt3’(seqidno：4)

sali正向：

5’gcgtcgactctagaccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacgggtcttgaggggttttttgctgaaaggagtcgaccg3’(seqidno：5)

sali反向：

5’cggtcgactcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttatgctagttattgctcagcggtggtctagagtcgacgc3’(seqidno：6)

csc分離

通過選擇如cd44的某些表面標(biāo)記的存在及如cd24的其他特定表面標(biāo)記的缺失來分離癌干細(xì)胞(cscs)。參考圖4，通過熒光激活細(xì)胞分選(facs)從fadu人頭與頸癌細(xì)胞中分離cd44-細(xì)胞和cd24-/cd44高細(xì)胞(左圖)。隨后將細(xì)胞在缺乏吸附和血清的情況下培養(yǎng)指定的時間周期以檢測其形成球的能力(右圖)。

右圖中的顯微照相圖像說明cd44-細(xì)胞不具有形成球的能力，而cd24-/cd44高細(xì)胞具有該能力，證實了cd24-/cd44高細(xì)胞確實是癌干細(xì)胞。

實施例1：癌干細(xì)胞(csc)中針對cscp1的rnai

用攜帶有如上描述的質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞bl21(de3)plyse處理選自副群體(sidepopulation)的sw480人結(jié)腸癌hoechst副群體(sp)癌干細(xì)胞。用攜帶對照質(zhì)粒的細(xì)菌處理對照癌干細(xì)胞。細(xì)菌進(jìn)入48小時后，將細(xì)胞固定并通過標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光技術(shù)對cscp1/β聯(lián)蛋白蛋白質(zhì)染色。對照細(xì)胞(圖5，左圖)包含正常水平的cscp1/β聯(lián)蛋白，而cscp1靶向細(xì)菌通過rnai引發(fā)了cscp1/β聯(lián)蛋白的特異性丟失(右圖)。

實施例2：通過副群體選擇的癌干細(xì)胞(csc)中針對cscp3的rnai

用攜帶質(zhì)粒的大腸桿菌細(xì)胞bl21(de3)plyse處理如實施例1中制備的sw480人結(jié)腸癌hoechst副群體(sp)癌干細(xì)胞。細(xì)菌進(jìn)入24小時后，將細(xì)胞固定并通過標(biāo)準(zhǔn)免疫熒光技術(shù)對cscp3/stat3蛋白質(zhì)染色。在圖6中，上兩圖顯示單通道免疫熒光圖像。下兩圖顯示遠(yuǎn)右圖中提供的具有像素強(qiáng)度量表的cscp3的強(qiáng)度譜。用靶向細(xì)菌cscp3/stat3處理的細(xì)胞(右圖)顯示降低的cscp3/stat3水平，證明通過該細(xì)菌介導(dǎo)系統(tǒng)有效地進(jìn)行了rnai。

實施例3：癌干細(xì)胞(csc)中針對cscp3引起的凋亡的rnai

將與實施例2中相同細(xì)胞及類似處理的細(xì)胞固定并在細(xì)菌進(jìn)入24小時后用膜聯(lián)蛋白v-fitc24染色，以鑒定凋亡(膜聯(lián)蛋白v陽性)細(xì)胞。如圖7中所示，顯著數(shù)目的處理細(xì)胞進(jìn)入凋亡(右圖)，而對照細(xì)胞保持健康(左圖)。這說明了使用本發(fā)明處理癌干細(xì)胞和癌的一般治療潛能。

實施例4：在通過表面標(biāo)記選擇的癌干細(xì)胞(csc)中針對cscp3的rnai

使用facs通過表面標(biāo)記cd133選擇癌干細(xì)胞。隨后用或?qū)φ?imgfile="bda0001310140050000243.gif"wi="154"he="55"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>處理所獲得的sw480人結(jié)腸癌cd133+癌干細(xì)胞。24小時后，將細(xì)胞固定并用膜聯(lián)蛋白v-fitc染色以鑒定凋亡細(xì)胞。觀察到與實施例3相似的結(jié)果，相對于對照(左圖)多得多的處理細(xì)胞(圖8，右圖)出現(xiàn)了凋亡。

實施例5：在癌干細(xì)胞(csc)中針對cscp3抑制的球形成的rnai

使用本發(fā)明方法的cscp3/stat3rna沉默還抑制了csc球形成的多達(dá)60％(圖9，右圖)。用或?qū)φ誸piv處理通過facs分離的cd44高fadu細(xì)胞。然后，在缺乏附著和血清的情況下培養(yǎng)細(xì)胞5天以形成球。在加入臺盼藍(lán)之前(左上圖)或之后(左下圖)捕捉代表性球體圖像以鑒定死亡細(xì)胞。通過對具有超過50個細(xì)胞的球進(jìn)行計數(shù)來對球體生長進(jìn)行記分。

實施例6：非csc細(xì)胞中針對cscp3的rnai

用或?qū)φ?imgfile="bda0001310140050000247.gif"wi="146"he="60"img-content="drawing"img-format="gif"orientation="portrait"inline="no"/>質(zhì)粒處理u2os人骨肉瘤細(xì)胞。收集細(xì)胞并在細(xì)胞感染24小時后通過蛋白質(zhì)印跡分析測定cscp3/stat3蛋白質(zhì)的水平(圖10，左圖)。在處理72小時后，通過常規(guī)mtt檢測測定細(xì)胞生存力(右圖)，其在moi為300的癌細(xì)胞中顯示70％的死亡率并在moi為600的癌細(xì)胞中顯示高于80％的細(xì)胞死亡率。這為本發(fā)明細(xì)菌介導(dǎo)的rnai方法針對分化的非癌干細(xì)胞的高效率提供了證據(jù)。

其他實施方案在以下的權(quán)利要求中。盡管已顯示并描述了若干實施方案，在不背離本發(fā)明精神和范圍的情況下可進(jìn)行不同的修飾。

序列表

<110>北京強(qiáng)新生物科技有限公司

<120>促使長dsrna可用于哺乳動物和其他所選動物細(xì)胞中的基因?qū)ぐ?/p>

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tcctctagagggcaatctccattg24

<210>3

<211>96

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>dna寡核苷酸

<400>3

acggatcctcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttat60

gctagttattgctcagcggtggtctagaggatccac96

<210>4

<211>96

<212>dna

<213>人工序列

<220>

<223>dna寡核苷酸

<400>4

gtggatcctctagaccaccgctgagcaataactagcataaccccttggggcctctaaacg60

ggtcttgaggggttttttgctgaaaggaggatccgt96

<210>5

<211>96

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<213>人工序列

<220>

<223>dna寡核苷酸

<400>5

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<210>6

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<213>人工序列

<220>

<223>dna寡核苷酸

<400>6

cggtcgactcctttcagcaaaaaacccctcaagacccgtttagaggccccaaggggttat60

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