本發(fā)明屬于疫苗病毒株構(gòu)建技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種構(gòu)建的基因vii型新城疫病毒弱毒株。

技術(shù)背景

新城疫是由新城疫病毒引起的一種急性烈性傳染病，對(duì)養(yǎng)禽業(yè)的危害極大，曾經(jīng)被國(guó)際獸疫局(oie)列為a類(lèi)病。nd于1926年首先被發(fā)現(xiàn)于印度尼西亞爪哇，同年發(fā)現(xiàn)于英國(guó)的紐卡斯?fàn)柍?，此后迅速向世界各地傳播。目前nd已在世界范圍內(nèi)發(fā)生了四次大流行，并且宿主范圍不斷擴(kuò)大。

劉秀梵等對(duì)1985‐2003年分離自江蘇浙江地區(qū)的29株新城疫病毒進(jìn)行序列分析，結(jié)果顯示有17株屬于基因vii型，其中10株分離自發(fā)病鵝群。劉華雷等對(duì)2005年分離自中國(guó)大陸地區(qū)的83株新城疫病毒進(jìn)行分析顯示，其中64株屬于基因vii型。lien等對(duì)2003‐2006年間分離自臺(tái)灣地區(qū)的20株新城疫病毒均為基因vii型。此外同階段中國(guó)周邊的韓國(guó)和日本流行的ndv也大都為基因vii型。我們對(duì)本實(shí)驗(yàn)室近年分離的部分ndv毒株也進(jìn)行了測(cè)序分析，結(jié)果顯示，70％以上的毒株為基因vii型。由此看出，基因vii型新城疫病毒在中國(guó)禽群中廣泛流行，是目前的絕對(duì)優(yōu)勢(shì)基因型。

當(dāng)前市場(chǎng)上對(duì)新城疫病毒的防控主要使用iv系疫苗株lasota、clone30和ii系疫苗株b1等基因ii型的毒株，它們雖然可以提供一定的免疫保護(hù)，但是不能完全阻止新城疫病毒的傳播、擴(kuò)散，特別是基因vii型新城疫病毒的流行給養(yǎng)殖業(yè)造成了巨大的經(jīng)濟(jì)損失。由于流行的基因vii型新城疫病毒都是強(qiáng)毒，因此大多數(shù)毒株不適合作為疫苗株使用，除非是自然弱毒株或是基因工程手段人工致弱的毒株。獲得弱毒株是生產(chǎn)疫苗的關(guān)鍵。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明的目的是提供一種構(gòu)建的基因vii型新城疫病毒弱毒株，從而能夠構(gòu)建獲得低毒力的基因vii型新城疫病毒弱毒株，并用于制備疫苗。

本發(fā)明提供的vii型新城疫病毒弱毒株，是將vii型新城疫病毒的p蛋白的237位和240位的氨基酸分別突變?yōu)樘K氨酸t(yī)和異亮氨酸i；同時(shí)將f蛋白也進(jìn)行弱毒性突變構(gòu)建的。

上述的vii型新城疫病毒弱毒株，其一種具體操作方法是通過(guò)反向遺傳操作方法來(lái)構(gòu)建vii型新城疫病毒弱毒株，其包括如下的步驟：

構(gòu)建表達(dá)t7rna聚合酶的細(xì)胞系、

所述的細(xì)胞系，是將表達(dá)t7rna聚合酶的基因與載體pci‐neo連接后轉(zhuǎn)染df1細(xì)胞獲得的；

提供基因vii型新城疫病毒ndv拯救過(guò)程中需要的輔助重組質(zhì)粒和一個(gè)全基因組重組載體，輔助重組質(zhì)粒分別包含ndv的np蛋白、p蛋白、f蛋白和l蛋白基因；其中p蛋白的237位和240位的氨基酸分別為t和i；

將輔助重組質(zhì)粒和一個(gè)全基因組重組載體轉(zhuǎn)入到表達(dá)t7rna聚合酶的細(xì)胞系中，培養(yǎng)獲得基因vii型新城疫病毒弱毒株。

本發(fā)明篩選的構(gòu)建的弱毒株，為基因vii型新城疫病毒rsl株，其于2017年3月20日保藏于中國(guó)武漢、武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:v201709；

本發(fā)明所構(gòu)建的弱毒株可用于制備滅活疫苗。

本發(fā)明構(gòu)建的基因vii型新城疫病毒弱毒株制備的疫苗均能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的中和抗體，能抵抗強(qiáng)毒力基因vii型新城疫病毒的侵害，有廣闊的應(yīng)用前景。

附圖說(shuō)明

圖1：新城疫f基因片段pcr鑒定圖；

圖2：ndv毒株(wf株、sl株)基于f基因片段的系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)；

圖3：新城疫9個(gè)基因片段pcr鑒定結(jié)果圖；

圖4：全基因組分段構(gòu)建pcr鑒定結(jié)果圖；

圖5：np、p、l輔助質(zhì)粒酶切鑒定圖。

具體實(shí)施方式

本發(fā)明通過(guò)對(duì)臨床分離的兩株基因vii型ndv進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)一株為中等偏弱毒力毒株(wf株)，一株為強(qiáng)毒株(sl株)；通過(guò)對(duì)它們的基因組測(cè)序，并與ncbi公布的基因vii型ndv的p基因進(jìn)行大量比對(duì)，發(fā)現(xiàn)wf株在p蛋白的第237位和第240位氨基酸與其它毒株不同，推測(cè)其可能與新城疫的毒力有關(guān)。按照wf株的p蛋白的序列對(duì)sl株的p基因進(jìn)行改造，結(jié)果獲得了一株高度致弱的基因vii型新城疫疫苗侯選株。分別研究wf株和改造后的sl株的生物學(xué)特性，并分別做成滅活苗免疫動(dòng)物后，能提供很好的免疫保護(hù)效果；從而促成了本發(fā)明。

下面結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行詳細(xì)的描述。

實(shí)施例1基因vii型ndv野毒株的篩選及序列分析

從臨床發(fā)病雞中分離到兩株疑似ndv毒株，接種雞胚收取尿囊液，測(cè)定ha效價(jià)。根據(jù)ncbi公布的ndv的f基因序列設(shè)計(jì)引物，鑒定新城疫毒株。上游引物：ndvf‐f：atgggctccaaaccttctaccag；下游引物：ndvf‐r：aaactgctgcatcttcccaaccg。

取收取的尿囊液250ul按常規(guī)方法提取rna，反轉(zhuǎn)錄。以ndvf‐f/ndvf‐r為引物擴(kuò)增f基因的部分片段，片段大小約500bp。核酸電泳后，切取陽(yáng)性條帶，回收，連接t載體測(cè)序。取f基因47nt‐420nt之間的序列繪制基因進(jìn)化樹(shù)，分析分離毒株的基因型。用于試驗(yàn)分析的毒株genbank登錄號(hào)為：1‐2(ay935499)、1‐2(ay935500)、18719‐03(gq288385)、b1(nc_002617)、hb92(ay225110)、herts(ay741404)、italien(eu293914)、js‐07(fj766527)、lasota(af077761)、na‐1(dq659677)、paramyxovirus‐1(aj880277)、zj1(af431744)、mukteswar(ef201805)。

結(jié)果顯示，兩株分離毒株為新城疫病毒，f基因裂解位點(diǎn)的氨基酸序列均為¹¹²r-r-q-k-r-f¹¹⁷，符合強(qiáng)毒株的特征，進(jìn)一步的基因進(jìn)化分析顯示它們?yōu)榛騰ii型毒株。ha效價(jià)測(cè)定顯示，兩株病毒雞胚尿囊液的效價(jià)分別穩(wěn)定在2⁹和2⁷‐2⁸。分離的ndv毒株分別命名為wf株和sl株。其中基因vii型新城疫病毒wf株，其于2017年3月7日保藏于中國(guó)武漢、武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:v201708。

實(shí)施例2新城疫sl株和wf株mdt、icpi的測(cè)定

mdt是指最小致死量所能使雞胚死亡的平均時(shí)間，mdt低于60h為強(qiáng)毒力ndv毒株；mdt值在60h‐90h之間為中等毒力毒株；mdt大于90h的為弱毒株。用無(wú)菌生理鹽水將新鮮收獲的含毒尿囊液作10倍系列稀釋?zhuān)?0^‐6、10^‐7、10^‐8和10^‐94個(gè)稀釋度，分別接種10日齡雞胚，每個(gè)稀釋度接種5枚，每胚尿囊腔內(nèi)注射0.1ml。每天上午和下午各照胚一次，記錄每一雞胚的死亡時(shí)間，連續(xù)觀察7日。(結(jié)果見(jiàn)表1)mdt計(jì)算公式為：

icpi是指1日齡雛雞腦內(nèi)致病指數(shù)。取1日齡spf雛雞15只，各腦內(nèi)注射10^‐1稀釋的新鮮含毒尿囊液0.05ml。另取5只以同樣方法注射相同劑量的無(wú)菌生理鹽水各0.05ml作為對(duì)照。接種后，每日在相應(yīng)接種的時(shí)間觀察，記錄雛雞的情況，分正常(活動(dòng)靈活，行動(dòng)無(wú)共濟(jì)失調(diào)現(xiàn)象)、發(fā)病(包括麻痹、臥地不起，但不包括只表現(xiàn)遲鈍的雞)和死亡。

觀察8日，計(jì)算正常、發(fā)病、死亡雞的總數(shù)，根據(jù)不同的權(quán)值(正常為0，發(fā)病為1，死亡為2)累計(jì)總分?jǐn)?shù)。

icpi為累計(jì)總分除以正常、發(fā)病和死亡動(dòng)物的累計(jì)總數(shù)的平均值(結(jié)果見(jiàn)表1)。

表1：wf株和sl株mdt、icpi的測(cè)定

上述結(jié)果顯示，sl株符合強(qiáng)毒株的特征，與f基因裂解位點(diǎn)的強(qiáng)毒株特性一致；而wf株的f基因裂解位點(diǎn)雖然也符合強(qiáng)毒株的特征，但表1結(jié)果表明wf株屬于中等偏弱毒株，證明新城疫的毒力不僅僅與f蛋白有關(guān)，推測(cè)可能還與其它蛋白如p蛋白等有關(guān)。

實(shí)施例3：新城疫wf株、sl株全基因組序列的測(cè)定

為了確定是否p蛋白也產(chǎn)生了變異，根據(jù)ncbi公布的ndv基因序列，設(shè)計(jì)9對(duì)引物，相鄰擴(kuò)增片段之間有部分核酸序列相互重疊。引物由上海生工生物工程有限公司合成，序列見(jiàn)表2。

表2擴(kuò)增ndvsl株全基因組的引物序列

常規(guī)方法提取病毒rna，反轉(zhuǎn)錄，上述引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，連接pmd19‐t載體測(cè)序，測(cè)的的序列在ncbi網(wǎng)站比對(duì)，用lasergene軟件拼接，獲得wf株和sl株全基因序列。

結(jié)果顯示，wf株和sl株基因組全長(zhǎng)15192bp，與lasota等毒株相比，在第1646‐1647位堿基之間都有多余的6個(gè)堿基，符合基因vii型新城疫毒株的特性。

進(jìn)一步將wf株和sl株的p基因與ncbi公布的其它基因vii型新城疫病毒的p基因進(jìn)行比對(duì)發(fā)現(xiàn)，wf株p蛋白(其氨基酸序列為seqidno:1)的第237位和第240位氨基酸與其它毒株有差異，其它毒株包括sl株p蛋白第237位和240位的氨基酸均為k/r和k，而wf株分別為t和i。

實(shí)施例4：基因vii型新城疫病毒致弱株的構(gòu)建

通過(guò)反向遺傳操作技術(shù)驗(yàn)證wf株p蛋白的變異是否就是導(dǎo)致wf株成為弱毒株的原因所在。反向遺傳操作技術(shù)一般是指通過(guò)構(gòu)建病毒的基因組cdna克隆，在培養(yǎng)細(xì)胞或/和易感宿主中重新“復(fù)活”病毒，通過(guò)基因插入或缺失等方法修飾病毒的基因組序列，以此來(lái)進(jìn)行病毒的功能基因組研究和新型疫苗的研制。本實(shí)施例的ndv的拯救過(guò)程是將構(gòu)建的全基因組cdna克隆(轉(zhuǎn)錄載體)和分別含np、p和l基因的輔助質(zhì)粒(表達(dá)載體)共轉(zhuǎn)染細(xì)胞，在輔助質(zhì)粒提供有關(guān)酶的作用下，cdna克隆進(jìn)行轉(zhuǎn)錄和各基因的表達(dá)，最終組裝成有感染性的病毒粒子，然后通過(guò)接種雞胚來(lái)大量擴(kuò)增病毒而獲得拯救的ndv。拯救出的ndv基因組最終來(lái)源于cdna克隆。

下面對(duì)具體的步驟進(jìn)行描述。

1)表達(dá)t7rna聚合酶的細(xì)胞系的構(gòu)建

挑取大腸桿菌bl21單個(gè)克隆，試管搖菌，取400ul菌液，13000rpm/min離心10分鐘，去上清；用超純水重懸后離心，去上清；用100ul的超純水重懸，煮沸10min，冰浴10min；離心，取上清作為dna模板。根據(jù)ncbi公布的bl21菌株t7rna聚合酶基因序列，設(shè)計(jì)引物：t7‐f：5'ctgctcgagccaccatgaacacgattaacatcgctaagaacgac3'，t7‐r：5'ctgtctagattacgcgaacgcgaagtccgactctaagatgt，上游引物含xhoi酶切位點(diǎn)，下游引物含xbai酶切位點(diǎn)。以制備的dna作為模板進(jìn)行pcr擴(kuò)增，擴(kuò)增片段大小約2.6kb。

取5ulpcr產(chǎn)物進(jìn)行核酸電泳鑒定，若條帶正確，將剩余的pcr產(chǎn)物用核酸純化試劑盒進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物與真核表達(dá)載體pci‐neo一起進(jìn)行xbai/xhoi雙酶切反應(yīng)。回收陽(yáng)性條帶，用t4dnaligase進(jìn)行連接。轉(zhuǎn)化，質(zhì)粒的小量提取，酶切鑒定等按常規(guī)方法進(jìn)行。陽(yáng)性質(zhì)粒送上海生工生物工程有限公司測(cè)序，獲得重組質(zhì)粒pci‐t7。

用含10％胎牛血清的dmem培養(yǎng)基培養(yǎng)df1細(xì)胞，均勻接種于60mm的dish培養(yǎng)皿，待細(xì)胞長(zhǎng)至70％‐90％時(shí)轉(zhuǎn)染。取2ug的pci‐t7重組質(zhì)粒，按磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒說(shuō)明書(shū)的要求轉(zhuǎn)染df1細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后4h換成新鮮的不含g418的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，24h后換成含400ng/mlg418的生長(zhǎng)培養(yǎng)基。初次傳代換成含600ng/mlg418的生長(zhǎng)培養(yǎng)基，以后傳代逐漸提高g418的濃度，直至g418的濃度達(dá)到1mg/ml。細(xì)胞連續(xù)傳代20代，提取rna，用dna酶處理后反轉(zhuǎn)錄，用引物t7‐f/t7‐r擴(kuò)增，鑒定t7rna聚合酶的表達(dá)情況。

經(jīng)鑒定，構(gòu)建的細(xì)胞系可穩(wěn)定傳代，并且轉(zhuǎn)染獲得的t7rna聚合酶基因可持續(xù)表達(dá)。將構(gòu)建的穩(wěn)定表達(dá)t7rna聚合酶的細(xì)胞系命名為df1‐t7。

2)sl株全長(zhǎng)cdna克隆載體的構(gòu)建

根據(jù)測(cè)得的sl株全基因組序列，用oligo7軟件分析其酶切位點(diǎn)。，將全基因組分成7段，分段連接到經(jīng)過(guò)改造的載體pbrt上。其中，將p基因中第710位和719位堿基突變改造后再進(jìn)行連接，構(gòu)建的全長(zhǎng)cdna克隆載體命名為pbrt-ndv-p，測(cè)序正確后，保存?zhèn)溆?。在?gòu)建的pbrt-ndv-p載體基礎(chǔ)上，將第3段中f基因代表強(qiáng)毒株特性的堿性氨基酸裂解位點(diǎn)突變?yōu)榈椭虏⌒蕴卣鞯男蛄校瑯?gòu)建的全長(zhǎng)cdna克隆載體命名為pbrt-ndv，測(cè)序正確后，保存?zhèn)溆?。引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列?jiàn)表3。其中cl2‐t1/cl2‐t2/cl2‐t3/cl2‐t4為f基因突變引物，cl2‐2f/cl2‐t5/cl2‐t6/cl2‐2r為p基因突變引物。

表3：ndv全基因組載體構(gòu)建用引物序列

3)輔助質(zhì)粒的構(gòu)建

分別在sl株np、p和l基因的上下游引入酶切位點(diǎn)，pcr擴(kuò)增后酶切，連接經(jīng)相同內(nèi)切酶處理過(guò)的pci‐neo載體，測(cè)序后保存，分別命名為pci‐np、pci‐p和pci‐l。所用引物由上海生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表4。

表4：ndv輔助質(zhì)粒構(gòu)建用引物序列

4)病毒拯救

df1‐t7細(xì)胞接種于35mm六孔板內(nèi)生長(zhǎng)至70％‐80％單層時(shí)，將轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pbrt‐ndv‐p及輔助質(zhì)粒pci‐np、pci‐p和pci‐l分別以5ug、2.5ug、1.25ug、1.25ug的比例，共轉(zhuǎn)染df1‐t7細(xì)胞系，采用磷酸鈣轉(zhuǎn)染試劑盒，操作按試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。同時(shí)，將轉(zhuǎn)錄質(zhì)粒pbrt‐ndv與上述輔助質(zhì)粒按相同的量和方法共轉(zhuǎn)染df1‐t7細(xì)胞系。轉(zhuǎn)染3‐5天后，收獲培養(yǎng)物上清接種9‐11日齡的spf雞胚尿囊腔，培養(yǎng)3‐5天，取雞胚尿囊液測(cè)ha效價(jià)。收獲ha試驗(yàn)結(jié)果陽(yáng)性尿囊液，分裝后‐70℃凍存。

將拯救的僅p基因改造的毒株命名為rsl‐p株，基因vii型新城疫病毒rsl‐p株，其于2017年3月20日保藏于中國(guó)武漢、武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:v201710；

將拯救的p和f基因共同改造的毒株命名為rsl株；基因vii型新城疫病毒rsl株，其于2017年3月20日保藏于中國(guó)武漢、武漢大學(xué)的中國(guó)典型培養(yǎng)物保藏中心，保藏編號(hào)為cctccno:v201709；

轉(zhuǎn)染液接胚4天后收獲尿囊液，血凝(ha)試驗(yàn)陽(yáng)性，雞胚效價(jià)在2⁶‐2⁸之間。收獲的尿囊液1:1000‐1:10000稀釋?zhuān)^續(xù)接胚，0.1ml/枚，4‐5天后收胚；繼續(xù)傳代至第15代。分別取rsl‐p株和rsl株原代、第5代、第10代和第15代病毒尿囊液提取rna，pcr擴(kuò)增突變的序列位點(diǎn)(p基因和p/f基因)并測(cè)序，鑒定結(jié)果與預(yù)期的結(jié)果一致。表明病毒拯救成功，且傳代穩(wěn)定，改造的位點(diǎn)沒(méi)有再次發(fā)生回復(fù)突變。

實(shí)施例5、新拯救病毒(rsl‐p株和rsl株)的雞胚平均致死時(shí)間(mdt)

用無(wú)菌生理鹽水將新收獲的含毒尿囊液作10倍系列稀釋?zhuān)?0^‐7、10^‐8、10^‐93個(gè)稀釋度，分別接種10日齡雞胚，每個(gè)稀釋度接種5個(gè)雞胚，每胚尿囊腔內(nèi)注射0.1ml，每天在接種的相同時(shí)間照蛋1次，記錄每一雞胚的死亡時(shí)間，并測(cè)定ha活性。連續(xù)觀察7日，接種雞胚全部死亡的最高稀釋度即為最小致死量。

結(jié)果顯示，rsl‐p株的mdt值為108h，rsl株的mdt值為128h，具體結(jié)果見(jiàn)表5。

表5：rsl‐p株、rsl株雞胚平均致死時(shí)間(mdt)的測(cè)定

實(shí)施例6、rsl‐p株、rsl株腦內(nèi)致病指數(shù)的測(cè)定(icpi)

取1日齡spf雛雞10只，各腦內(nèi)注射10^‐1稀釋的新鮮含毒尿囊液0.05ml。另取5只以同樣方法注射稀釋病毒用的生理鹽水各0.05ml。

接種后，每日在相應(yīng)接種時(shí)間觀察，記錄雛雞的情況，分正常、發(fā)病和死亡。觀察8日，計(jì)算正常、發(fā)病、死亡雞的總數(shù)，根據(jù)不同的權(quán)值(正常為0，發(fā)病為1，死亡為2)累計(jì)總分?jǐn)?shù)。icpi為累計(jì)總分除以正常、發(fā)病和死亡雞的累計(jì)總數(shù)的平均值。

結(jié)果顯示，rsl‐p株的icpi值為0.9，rsl株的icpi為0.35，具體結(jié)果見(jiàn)表6。

表6：rsl‐p株、rsl株icpi的測(cè)定

實(shí)施例7、rsl‐p株、rsl株靜脈致病指數(shù)的測(cè)定(ivpi)

取6周齡spf雞10只，各靜脈接種10^‐1稀釋的含毒尿囊液0.1ml，另取5只接種生理鹽水作對(duì)照。每日在接種的相應(yīng)時(shí)間觀察，記錄接種雞情況，分正常、發(fā)病、麻痹和死亡。

觀察10日后，累計(jì)正常、發(fā)病、麻痹和死亡動(dòng)物數(shù)，根據(jù)不同權(quán)值(正常為0，發(fā)病為1，麻痹為2，死亡為3)累計(jì)總分?jǐn)?shù)。ivpi為累計(jì)總分除以正常、發(fā)病和死亡動(dòng)物的累計(jì)總數(shù)。

結(jié)果顯示，rsl‐p株、rsl株的ivpi值均為0，具體結(jié)果見(jiàn)表7。

結(jié)合兩株拯救毒株mdt、icpi和ivpi值的測(cè)定結(jié)果分析，rsl‐p株的毒力較野生株sl株的毒力已經(jīng)大幅下降，說(shuō)明p基因的兩個(gè)位點(diǎn)確實(shí)影響著sl株的毒力，而通過(guò)p基因和f基因聯(lián)合改造獲得的rsl株毒力完全下降，完全符合低毒力毒株的特性，作為疫苗候選株能更加保證疫苗使用的安全性。

表7：rsl‐p株、rsl株ivpi的測(cè)定

實(shí)施例8、wf株、rsl‐p株和rsl株病毒的滅活及滅活后的穩(wěn)定性試驗(yàn)

通過(guò)上述一系列驗(yàn)證發(fā)現(xiàn)，wf株和rsl‐p株、rsl株在生物安全性上均有保證，均有作為疫苗侯選株的潛力。

將收獲的wf株、rsl‐p株、rsl株新鮮病毒尿囊液(eid50為10^9.5/0.1ml)中，加入終濃度為0.1％的甲醛溶液，37℃滅活24h，置于4℃保存。分別于滅活后0h、24h、48h、7天、15天、1個(gè)月測(cè)定ha效價(jià)，測(cè)定滅活病毒的穩(wěn)定性，結(jié)果見(jiàn)表8。另取滅活后的原液，接種10日齡spf雞胚10枚，0.1ml/枚，37℃培養(yǎng)120h，收胚測(cè)效價(jià)，檢驗(yàn)滅活徹底性。

結(jié)果顯示，滅活后的病毒較為穩(wěn)定，放置一段時(shí)間后，ha效價(jià)沒(méi)有顯著下降。并且滅活較為徹底，滅活后的抗原原液接種雞胚沒(méi)有死亡，ha效價(jià)全部陰性。

表8：滅活后抗原h(huán)a效價(jià)

實(shí)施例9、wf株、rsl-p株、rsl株油佐劑滅活疫苗的制備及安全性試驗(yàn)、無(wú)菌檢驗(yàn)

滅活后的病毒原液，按常規(guī)方法制備油佐劑滅活疫苗。每組滅活苗分別用7日齡spf雞10只，每只頸部皮下注射疫苗1.0ml，同時(shí)各設(shè)對(duì)照5只，在相同的條件下飼養(yǎng)，連續(xù)觀察14日，記錄試驗(yàn)雞采食、飲水及臨床情況。結(jié)果顯示，免疫后疫苗吸收效果良好，免疫雞沒(méi)有出現(xiàn)任何局部和全身的不良反應(yīng)，雞的狀態(tài)完全正常。

取制備的wf株、rsl-p株、rsl株油佐劑疫苗，按2010年版《中國(guó)獸藥典》附錄進(jìn)行無(wú)菌檢驗(yàn)，結(jié)果符合標(biāo)準(zhǔn)，沒(méi)有細(xì)菌污染。

實(shí)施例10、wf株、rsl-p株、rsl株油佐劑滅活疫苗的免疫效果評(píng)價(jià)

21日齡spf雞50只，隨機(jī)分為五組，一組為陰性對(duì)照組，一組為wf株疫苗免疫組，一組為rsl-p株疫苗免疫組，一組為rsl株疫苗免疫組，另一組為lasota株免疫組。免疫組每只頸部皮下注射疫苗0.2ml，對(duì)照組免疫相同劑量的pbs，免疫組與對(duì)照組隔離飼養(yǎng)。分別于免后21天、28天采血，分離血清，測(cè)定抗體。28天采血后，用臨床分離的基因vii型野毒株強(qiáng)毒wh株攻毒，每只雞肌肉注射10⁶eid50，隔離器飼養(yǎng)，觀察14天，每天記錄雞的發(fā)病和死亡情況；攻毒后第3天，采集四組免疫組雞的喉拭子和泄殖腔拭子接胚，檢測(cè)排毒情況。

結(jié)果顯示，免疫組免疫21天后均可產(chǎn)生較高水平抗體，28天抗體水平更高，結(jié)果見(jiàn)表9所示。攻毒后，免疫組沒(méi)有出現(xiàn)任何死亡，而5天后陰性對(duì)照組雞全部死亡。排毒情況顯示，免疫wf株、rsl-p株、rsl株疫苗的動(dòng)物沒(méi)有出現(xiàn)排毒，而lasota株仍有排毒現(xiàn)象，見(jiàn)表10和表11所示。

表9：免疫后抗體效價(jià)測(cè)定

表10：免疫效力實(shí)驗(yàn)結(jié)果

表11:攻毒后第3天病毒分離結(jié)果

綜上所述，本發(fā)明所構(gòu)建的弱毒株，通過(guò)將它們做成疫苗免疫動(dòng)物后發(fā)現(xiàn)，均能誘導(dǎo)產(chǎn)生較高的中和抗體，能抵抗強(qiáng)毒力基因vii型新城疫病毒的侵害，有廣闊的應(yīng)用前景。

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<120>一種構(gòu)建的基因vii型新城疫病毒弱毒株

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