本發(fā)明屬于生物工程技術領域，具體地說，涉及一種用于試劑盒防腐劑的泥蚶抗菌肽及其制備方法。

背景技術：

目前我國體外診斷試劑市場規(guī)模為400億左右，年增長速度為15%~20%，體外診斷試劑在臨床檢驗應用中已相當普遍，發(fā)展?jié)摿薮?。隨著科學技術的發(fā)展，體外診斷試劑的種類越來越多，用途也越來越廣泛。體外診斷試劑除了需要達到良好的準確性和重復性，產品的保質期也尤為重要，因此防腐劑的選擇至關重要。

在體外診斷行業(yè)中常用的防腐劑主要有兩類，一類是化學類的防腐劑，如：疊氮鈉，硫柳汞，異噻唑啉酮，雖然這類防腐劑的價格低廉，防腐效果也不錯，但同時這類防腐劑具有很大的毒性，如過不慎與人體接觸，很容易對人體造成傷害，且如果隨意排入到下水溝，容易造成環(huán)境污染。同時，由于不同診斷試劑原理、工藝、原料等要求不一樣，導致這些化學類的防腐劑并不能適合所有的診斷試劑盒，尤其是部分診斷試劑盒添加了化學類防腐劑后，其靈敏度、空白、穩(wěn)定性等指標容易受到影響，其可能原因是該防腐劑抑制了試劑盒中的關鍵原料參與的反應。另外一類防腐劑為抗生素類防腐劑，如慶大霉素、g418、紅霉素等?？股仉m然具有良好的抗菌防腐效果，但同時也存在著嚴重的缺陷，即容易引起細菌的耐藥性，若直接排到環(huán)境中，會導致超級細菌的產生，對于人類的健康具有極大的風險。

抗菌肽是一類由基因編碼或蛋白酶解而成的兩親性多肽，具有廣譜抗菌活性和免疫調節(jié)活性，是機體免疫防御的重要組成部分，普遍存在于生物體中。抗菌肽具有廣譜抗菌活性，可以快速查殺靶標，并且其中很多是純天然的肽，抗菌肽的廣譜查殺范圍為：革蘭氏陰性細菌、革蘭氏陽性細菌、真菌、寄生蟲、腫瘤細胞等?？咕木哂锌咕Ч茫瑢Νh(huán)境友好，綠色無污染等特點，將抗菌肽應用于診斷試劑盒中，是一種綠色、環(huán)保的項目。由于利用了具有廣譜抗菌生物活性的抗菌肽，可以大大提高診斷試劑的抗菌防腐性能，有效延長診斷試劑盒的有效期。特別是對于某些容易受到傳統防腐劑干擾試劑盒，抗菌肽的應用可以有效提高試劑盒的靈敏度、降低試劑空白、提高試劑的穩(wěn)定性。但目前對于將抗菌肽應用于診斷試劑中，使之替代傳統的防腐劑，提高診斷試劑的抗菌防腐性能，卻未見報道。

技術實現要素：

本發(fā)明提供了一種用于試劑盒防腐劑的泥蚶抗菌肽及其制備方法，可以解決現有診斷試劑盒存在的準確性差，重復性低，防腐劑抗菌能力不足，抗菌譜窄，不環(huán)保，安全性低等問題。

本發(fā)明根據泥蚶抗菌肽的殺菌特點，設計了一種新型抗菌肽氨基酸序列。在此基礎上，選用畢赤酵母偏愛密碼子，人工合成新型抗菌肽基因，克隆于畢赤酵母中表達，獲得新型抗菌肽重組酵母菌株，并將發(fā)酵規(guī)模放大到發(fā)酵罐水平，實現抗菌肽產品的高密度發(fā)酵和高效表達。發(fā)酵液進一步純化后制成粉劑、液體等抗菌肽制劑。抗菌肽制劑可作為診斷試劑盒的防腐劑。

為解決上述技術問題，本發(fā)明采用以下技術方案予以實現：泥蚶抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列為：gkingpmkkvlaslnfgdryanawaklvavvqaal。

進一步地，上述泥蚶抗菌肽的制備方法，包括如下步驟：

（1）抗菌肽基因的合成

根據泥蚶抗菌肽氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，合成抗菌肽基因序列，并在其n端引入kex2酶切位點，兩端引入xhoi和xbai酶切位點，以便于克隆入畢赤酵母表達載體中，另設計合成一對引物p1和p2，用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，上游引物位于抗菌肽基因區(qū)，下游引物位于畢赤酵母3’aox基因區(qū)；引物序列為：p1：5'—aagtgggctttgttcaagaa—3'，p2：5’—gcatctggcat'tctgacatcc—3'；

（2）抗菌肽表達載體的構建與鑒定

將含抗菌肽基因的載體和表達載體均用xhoi和xbai雙酶切，酶切產物回收并連接，進行pcr測序鑒定；

（3）重組陽性質粒轉化酵母菌株與篩選

陽性質粒經saci單酶切線性化后加入畢赤酵母感受態(tài)細胞懸液中，電轉化后均勻涂布于含100μg/mlzeocin的ypds選擇平板上，30℃培養(yǎng)3~5天，待ypds平板上的陽性轉化子生長較大，將各轉化子依次點種至含zeocin200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml的ypds選擇平板，以在高濃度zeocin平板上正常生長的菌落為可能高拷貝重組菌株；

提取可能的高拷貝重組酵母基因組dna，以p1、p2為引物進行pcr反應，pcr產物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，擴增的條帶重組子進行陽性轉化子鑒定；

（4）陽性克隆的誘導表達

將篩選到的陽性重組菌單菌落接種于含100μg/mlzeocin的ypd培養(yǎng)液中，28℃振搖培養(yǎng)15~20個小時，取此菌液按2~5%體積比轉接于10mlbmgy培養(yǎng)基中，28℃搖振培養(yǎng)18~24h左右，od600值為5~6，培養(yǎng)物直接轉接于25~50mlbmmy培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)搖振培養(yǎng)，為了維持誘導表達，每隔12~18h補加100%甲醇使終濃度達1%，48h后，在4℃條件下，5000~8000r/min離心10~20min，收集上清，進行抑菌活性測定。

進一步地，經上述制備方法得到的高產抗菌肽的陽性重組子（重組畢赤酵母菌株），其高密度、高效表達的發(fā)酵罐生產工藝。

所述的泥蚶抗菌肽制劑具體制備工藝如下：將篩選得到的陽性重組子活化后按5~10%接種量接種于三角瓶，28~30℃，150~200r/min搖床培養(yǎng)16~24h后以5~20%接種量接入發(fā)酵罐，在28~30℃，150~180r/min，ph值5.0~6.0，通氣量0.5~1.0vvm（1l發(fā)酵液1min通入的氧氣量），溶氧>20%情況下進行發(fā)酵，在培養(yǎng)18~24h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%時流加甲醇至發(fā)酵結束，整個發(fā)酵持續(xù)48~72h；

發(fā)酵結束后原罐蒸汽100℃滅菌10~20min，放料，5000~8000r/min離心10~15min，收集發(fā)酵上清即為抗菌肽半成品；

上述抗菌肽半成品經微濾、超濾、噴霧干燥或凍干生產的粉劑和以生化方法精制、純化后得到液體制劑，即為抗菌肽產品。

更進一步地，上述抗菌肽產品作為診斷試劑盒防腐劑的添加劑。

本發(fā)明設計的新型抗菌肽與國內外同類產品相比，生產工藝簡單，生產成本低，抑菌能力強，且抗菌譜廣，極具市場前景。

具體實施方式

下面通過具體實施方式對本發(fā)明做進一步的描述。在本發(fā)明中，若非特指，所有百分比均為重量單位，所有設備和原料均可從市場購得或是本行業(yè)常用的，下述實施例中的方法，如無特別說明，均為本領域常規(guī)方法。

實施例1

一種用于試劑盒防腐劑的泥蚶抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：gkingpmkkvlaslnfgdryanawaklvavvqaal。

泥蚶抗菌肽的制備方法，包括如下步驟：

（1）抗菌肽基因的合成

根據泥蚶抗菌肽氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，合成抗菌肽基因序列，并在其n端引入kex2酶切位點，兩端引入xhoi和xbai酶切位點，以便于克隆入畢赤酵母表達載體中，另設計合成一對引物p1和p2，用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，上游引物位于抗菌肽基因區(qū)，下游引物位于畢赤酵母3’aox基因區(qū)；引物序列為：p1：5'—aagtgggctttgttcaagaa—3'，p2：5’—gcatctggcat'tctgacatcc—3'；

（2）抗菌肽表達載體的構建與鑒定

將含抗菌肽基因的載體和表達載體均用xhoi和xbai雙酶切，酶切產物回收并連接，進行pcr測序鑒定；

（3）重組陽性質粒轉化酵母菌株與篩選

陽性質粒經saci單酶切線性化后加入畢赤酵母感受態(tài)細胞懸液中，電轉化后均勻涂布于含100μg/mlzeocin的ypds選擇平板上，30℃培養(yǎng)4天，待ypds平板上的陽性轉化子生長較大，將各轉化子依次點種至含zeocin200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml的ypds選擇平板，以在高濃度zeocin平板上正常生長的菌落為可能高拷貝重組菌株；

提取可能的高拷貝重組酵母基因組dna，以p1、p2為引物進行pcr反應，pcr產物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，擴增的條帶重組子進行陽性轉化子鑒定；

（4）陽性克隆的誘導表達

將篩選到的陽性重組菌單菌落接種于含100μg/mlzeocin的ypd培養(yǎng)液中，28℃振搖培養(yǎng)18個小時，取此菌液按3%體積比轉接于10mlbmgy培養(yǎng)基中，28℃搖振培養(yǎng)20h左右，od600值為6，培養(yǎng)物直接轉接于30mlbmmy培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)搖振培養(yǎng)，為了維持誘導表達，每隔12h補加100%甲醇使終濃度達1%，48h后，在4℃條件下，6000r/min離心15min，收集上清，進行抑菌活性測定。

泥蚶抗菌肽具體制備工藝如下：將篩選得到的陽性重組子活化后按6%接種量接種于三角瓶，28℃，200r/min搖床培養(yǎng)24h后以10%接種量接入發(fā)酵罐，在30℃，150r/min，ph值6.0，通氣量0.8vvm（1l發(fā)酵液1min通入的氧氣量），溶氧>20%情況下進行發(fā)酵，在培養(yǎng)20h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%時流加甲醇至發(fā)酵結束，整個發(fā)酵持續(xù)72h。

發(fā)酵結束后原罐蒸汽100℃滅菌20min，放料，6000r/min離心12min，收集發(fā)酵上清經微濾、超濾、噴霧干燥或凍干生產的粉劑和以生化方法精制、純化后得到液體制劑，即為抗菌肽產品，可用于診斷試劑盒防腐劑的添加劑。

實施例2

一種用于試劑盒防腐劑的泥蚶抗菌肽，所述抗菌肽具有如下氨基酸序列：gkingpmkkvlaslnfgdryanawaklvavvqaal。

泥蚶抗菌肽的制備方法，包括如下步驟：

（1）抗菌肽基因的合成

根據泥蚶抗菌肽氨基酸序列，選用畢赤酵母偏好密碼子，合成抗菌肽基因序列，并在其n端引入kex2酶切位點，兩端引入xhoi和xbai酶切位點，以便于克隆入畢赤酵母表達載體中，另設計合成一對引物p1和p2，用于重組載體及重組酵母菌的鑒定，上游引物位于抗菌肽基因區(qū)，下游引物位于畢赤酵母3’aox基因區(qū)；引物序列為：p1：5'—aagtgggctttgttcaagaa—3'，p2：5’—gcatctggcat'tctgacatcc—3'；

（2）抗菌肽表達載體的構建與鑒定

將含抗菌肽基因的載體和表達載體均用xhoi和xbai雙酶切，酶切產物回收并連接，進行pcr鑒定、測序；

（3）重組陽性質粒轉化酵母菌株與篩選

陽性質粒經saci單酶切線性化后加入畢赤酵母感受態(tài)細胞懸液中，電轉化后均勻涂布于含100μg/mlzeocin的ypds選擇平板上，30℃培養(yǎng)5天，待ypds平板上的陽性轉化子生長較大，將各轉化子依次點種至含zeocin200μg/ml，500μg/ml，1000μg/ml的ypds選擇平板，以在高濃度zeocin平板上正常生長的菌落為可能高拷貝重組菌株；

提取可能的高拷貝重組酵母基因組dna，以p1、p2為引物進行pcr反應，pcr產物用1%瓊脂糖凝膠電泳觀察，擴增的條帶重組子進行陽性轉化子鑒定；

（4）陽性克隆的誘導表達

將篩選到的陽性重組菌單菌落接種于含100μg/mlzeocin的ypd培養(yǎng)液中，28℃振搖培養(yǎng)20個小時，取此菌液按4%體積比轉接于10mlbmgy培養(yǎng)基中，28℃搖振培養(yǎng)224h左右，od600值為5.5，培養(yǎng)物直接轉接于45mlbmmy培養(yǎng)基中，28℃繼續(xù)搖振培養(yǎng)，為了維持誘導表達，每隔12h補加100%甲醇使終濃度達1%，48h后，在4℃條件下，7000r/min離心12min，收集上清，進行抑菌活性測定。

泥蚶抗菌肽具體制備工藝如下：將篩選得到的陽性重組子活化后按5~10%接種量接種于三角瓶，30℃，180r/min搖床培養(yǎng)24h后以12%接種量接入發(fā)酵罐，在28℃，160r/min，ph值6.0，通氣量1.0vvm（1l發(fā)酵液1min通入的氧氣量），溶氧>20%情況下進行發(fā)酵，在培養(yǎng)20h后，流加50%甘油，待溶氧突然升至100%時流加甲醇至發(fā)酵結束，整個發(fā)酵持續(xù)60h；

發(fā)酵結束后，原罐蒸汽100℃滅菌15min，放料，8000r/min離心10min，收集發(fā)酵上清經微濾、超濾、噴霧干燥或凍干生產的粉劑和以生化方法精制、純化后得到液體制劑，即為抗菌肽產品，可用于診斷試劑盒防腐劑的添加劑。

抗菌肽在試劑盒中的防腐性能試驗

實驗方案：分離鑒定試劑盒中常見菌，并分別進行復壯；在試劑盒中加入一定的菌量，添加實施例的抗菌肽制品，測定試劑盒的性能。同時添加化學防腐劑和不添加防腐劑作對比，測定本發(fā)明抗菌肽抗菌防腐性能。本發(fā)明抗菌肽作為防腐劑在試劑盒中的添加量為千分之一，化學防腐劑的在試劑盒中添加量為千分之五。

表1各實施例與對比例的試驗統計結果

從表1可以明顯看出，各實施例中抗污染天數明顯多于化學防腐劑組和無防腐劑組，說明本發(fā)明的泥蚶抗菌肽具有顯著抗菌防腐性能，能顯著延長試劑盒保質期限。

以上所述的實施例只是本發(fā)明的一種較佳的方案，并非對本發(fā)明作任何形式上的限制，在不超出權利要求所記載的技術方案的前提下還有其它的變體及改型。