本發(fā)明屬于醫(yī)藥技術領域，具體涉及一種黃烷醇類化合物及其制備方法和應用。

背景技術：

黑面神為大戟科（euphorbiaceae）黑面神屬植物黑面神（breyniafruticosa(linn.)hook.f.），主產于我國南方沿海省份，其葉具清熱祛濕，活血解毒的功效，主要用于治療皮炎，濕疹，漆瘡，陰癢等皮膚病及腹痛吐瀉，風濕痹痛，纏腰火丹、產后乳汁不通；其根具有散瘀，消腫，祛風，解毒的功效，主要用于治療咽喉腫痛，熱瀉，乳蛾，楊梅瘡，崩漏，鶴膝風，產后腹痛^[3]。此外，民間亦用黑面神治療慢性支氣管炎，為中國南部傣族習用藥。現(xiàn)代藥理實驗已證實黑面神具有抗炎止癢、抑菌、免疫抑制、抗ⅰ型超敏反應及抗病毒作用。

經(jīng)統(tǒng)計，國內外文獻報道的黑面神中的化學成分共115個，包括三萜類、甾體類、倍半萜類、含硫螺縮酮苷類、黃酮類、木脂素類、有機酸酯、酚及小分子羧酸類化合物、腦苷及其他類別化合物。而近年國內外研究比較多的植物來源的酪氨酸酶抑制劑主要為黃酮類化合物、木脂素類等酚性成分，此外還有甾體、萜類成分的研究。

目前，黑面神多外用，用于治療各種皮膚病。此外，有文獻報道黑面神提取物正丁醇部分在濃度為0.8mg/ml時，對酪氨酸酶有50%的抑制率，且亦有報道黑面神制劑具有美白作用。酪氨酸酶（tyrosinase,tyr）是體內黑色素合成的關鍵酶，其表達和活性決定著黑色素生成的速度和產量，所以抑制酪氨酸酶的活性，黑色素合成量就可能得到有效控制。

黑面神這味具有民族特色的傳統(tǒng)中藥在治療皮膚病的應用中療效確切，目前關于其化學成分的研究報道較少，故而選其作為研究藥對象，先分離出單體成分，然后通過蘑菇酪氨酸酶抑制試驗進行活性篩選，以期發(fā)現(xiàn)具有抑制黑色素生成的天然藥物，從而為治療相關疾病的先導化合物的研究奠定基礎。

技術實現(xiàn)要素：

為解決上述技術問題，本發(fā)明的首要目的在于提供一種新的黃烷醇類化合物。

本發(fā)明的另一目的在于提供上述黃烷醇類化合物的制備方法。

本發(fā)明是通過以下技術方案實現(xiàn)：

本發(fā)明提供的一種黃烷醇類化合物，具有如下通式：

其中，r代表異丙基或異丁基。

根據(jù)本發(fā)明的目的，本發(fā)明通過對黑面神化學成分的研究，從黑面神中分離出來了如上通式結構所示的黃烷醇類化合物，經(jīng)分析鑒定，該類化合物是新的黃烷醇類化合物，該類化合物對酪氨酸酶單酚酶活性及二酚酶活性均具有較強的抑制作用。該新的化合物的具體結構如bf-1和bf-2所示：

本發(fā)明還提供了上述黃烷醇類化合物的制備方法，包括如下步驟：

a、將黑面神全株，粉碎，用乙醇回流提取，提取液減壓濃縮，得浸膏；

b、將浸膏依次用超純水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇萃取，分別離心后的上清液依

次濕法上樣于填有d101大孔樹脂的色譜柱，再分別用超純水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脫樣品，得到各濃度乙醇洗脫部位；

c、取60%乙醇洗脫部位，濃縮后制成凍干粉，將凍干粉溶解于甲醇中，然后用60~100

目的正相硅膠拌樣，烘干后上樣于填有200~300目的正相硅膠的色譜柱中，依次用100:0、99:1、98:2、97:3、95:5、9:1、85:15及75:25的二氯甲烷-甲醇洗脫液系統(tǒng)梯度洗脫，得到的各部位洗脫液通過tlc薄層色譜監(jiān)測后合并，然后經(jīng)ods開放柱層析、tlc薄層色譜、sephadexlh-20柱色譜以及制備型高效液相純化得到黃烷醇類化合物。

優(yōu)選的，步驟a具體為：將黑面神全株，粉碎，用6-10倍量70%乙醇回流提取3次，溫度控制在80-90℃，每次提取2-3小時，合并3次提取液，減壓濃縮，得浸膏。

本發(fā)明所述的黑面神（breyniafruticosa(linn.)hook.f.），又名田中逵、鬼畫符、廟公仔、猴寫字、四眼葉、鍋蓋仔、鐘馗草、青凡木等，為大戟科（euphorbiaceae）黑面神屬植物。

本發(fā)明還提供了上述黃烷醇類化合物在制備酪氨酸酶抑制劑藥物中的應用。

本發(fā)明還提供了一種酪氨酸酶抑制劑藥物組合物，包含上述黃烷醇類化合物和藥學上可接受的載體。其是以黃烷醇類化合物為主要活性成分，加入藥學可接受的載體，通過本領域公知的常用的生產方法制成藥學可接受的劑型。

所述的藥學可接受載體包括微晶纖維素、羥丙甲基纖維素、明膠、淀粉、糊精、硬脂酸鎂、乳糖、葡萄糖、滑石粉、氯化鈉、磷酸緩沖鹽水、甘油、乙醇等；所述的劑型可以是軟膏、片劑、膠囊、顆粒劑、散劑等。本發(fā)明藥物的給藥量可根據(jù)用藥途徑、患者的年齡、體重、所治療的疾病的類型和嚴重程度等變化。

本發(fā)明進一步對如上通式所示的黃烷醇類化合物對酪氨酸酶的抑制機理作了研究，試驗表明，新的黃烷醇類化合物bf-1、bf-2對酪氨酸酶的抑制率甚至超過作為陽性藥的曲酸，且對酪氨酸酶單酚酶活性及二酚酶活性均具有較強的抑制作用，可用于制備酪氨酸酶抑制劑藥物，為色素積聚引起的疾病的藥物治療研究奠定基礎。

附圖說明：

圖1為化合物bf-1和bf-2對酪氨酸酶單酚酶活性的影響的柱形圖；

圖2為化合物bf-1和bf-2對酪氨酸酶二酚酶活性的影響的柱形圖；

圖3為化合物bf-1對酪氨酸酶的抑制曲線圖；

圖4為化合物bf-2對酪氨酸酶的抑制曲線圖。

具體實施方式

下面通過具體實施方式來進一步說明本發(fā)明，以下實施例為本發(fā)明具體的實施方式，但本發(fā)明的實施方式并不受下述實施例的限制，其他的任何未背離本發(fā)明的精神實質與原理下所作的改變、修飾、替代、組合、簡化，均應為等效的置換方式，都包含在本發(fā)明的保護范圍之內。

實施例1

取黑面神全株50kg，粉碎，用8倍量70%乙醇回流提取3次，溫度控制在80-90℃，每次提取2-3個小時，合并3次提取液，減壓濃縮，得浸膏12.6kg；

取10kg浸膏依次用超純水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇萃取，分別離心后的上清液依次濕法上樣于填有d101大孔樹脂的色譜柱，分別用超純水、30%乙醇、60%乙醇、95%乙醇洗脫樣品，得各濃度乙醇洗脫部位；

取60%乙醇洗脫部位，濃縮后制成凍干粉，最后得600g凍干粉，再取其中500g凍干粉溶解于甲醇中，然后用1kg的60~100目的正相硅膠拌樣，烘干后上樣于填有200~300目的正相硅膠的色譜柱中，依次用100:0、99:1、98:2、97:3、95:5、9:1、85:15及75:25的二氯甲烷-甲醇洗脫液系統(tǒng)梯度洗脫，得到的各部位洗脫液通過tlc薄層色譜監(jiān)測后合并，然后經(jīng)ods開放柱層析、tlc薄層色譜、sephadexlh-20柱色譜以及制備型高效液相純化得到化合物bf-1（29.4mg）和bf-2（39mg）。

化合物的結構鑒定：

綠色無定型粉末，[α]21d?55.8(c0.33,ch3oh)，hr-esi-msm/z:579.2085[m+h]⁺(calcd.forc28h35o13,579.2072)，推斷分子式為c28h34o13。不飽和度ω=12。bf-1通過糖水解，衍生化后用hplc分析并與糖標準品的衍生物對照，證明其糖單元為d-葡萄糖。

ir譜顯示羥基吸收（3424cm^-1），羰基吸收（1724cm^-1）以及芳環(huán)吸收（1623，1591，1496，1447cm^-1）。

¹hnmr譜中顯示有2個呈雙峰的甲基信號δh1.12（3h,d,j=7hz），δh1.15（3h,d,j=7hz）和1個單峰甲基信號δh1.88（3h,s）。甲氧基氫質子δh3.73（3h,s）提示化合物母核上連有甲氧基。此外，¹hnmr譜中低場δh6.93（1h,s），6.76（2h）提示苯環(huán)上連著三個氫質子，分別為h-2'、h-5'、h-6'的氫質子信號，它們共同形成abx體系。δh6.34（1h,d,j=2hz），δh6.22（1h,d,j=2hz）表示苯環(huán)上間位偶合的兩個氫，提示其為5,7-二取代。一個葡萄糖的端基氫質子信號（δh4.86,δc102.5），其偶合常數(shù)為7，提示d-葡萄糖為β-構型。故化合物母核上連有1個β-d-葡萄糖基。

¹³cnmr譜中共顯示出28個碳信號，結合dept譜提示有4個甲基、2個亞甲基、13個次甲基及9個季碳。其中1個信號可能是一組葡萄糖碳信號包括（δc102.5、74.9、78.1、71.9、75.7、64.9）；低場區(qū)δc172.2、178.8為羰基信號；高場區(qū)δc19.5（2個）和δc21.0為3個甲基信號；δc56.0為甲氧基信號。將剩下碳信號與黃烷醇類化合物比對，提示可能是黃烷醇類化合物的衍生物。

hmbc譜顯示，葡萄糖氫質子glc-h2-6（δh4.21，4.25）及兩個甲基氫質子h-3'''（δh1.12），h-4'''（δh1.15）均與c-1'''（δc178.8）有遠程相關，此外，黃烷醇母核上質子h-3（δh5.38）及甲基質子h-2''（δh1.88）均與c-1''（δc172.2）有遠程相關，提示葡萄糖c-6位及黃烷醇母核c-3位上連接的羥基均被酯化，且與c-1'''相連的碳上連著兩個甲基，而c-1''連有另一個甲基。葡萄糖氫質子glc-h2-1（δh4.86）與c-5（δc158.1）有遠程相關，提示葡萄糖連接在c-5位上。甲氧基上氫質子（δh3.73）與c-7（δc161.0）有遠程相關，提示甲氧基連接在c-7位上。

根據(jù)¹hnmr、¹³cnmr、dept、¹h-¹hcosy、hmbc和hsqc譜的信息，對bf-1的碳氫信號進行全歸屬。

將bf-1水解后的母核與標準品(-)-表兒茶素的cd譜信號比對，二者信號吻合，可確定bf-1母核的絕對構型為2r，3r。

綜合以上解析，確定了bf-1化合物的結構為(2r,3r)-3-acetyl-7-methoxyl-(-)-epicatechin5-o-(6-isobutanoyloxyl)-β-d-glucopyranoside，中文名為：(2r,3r)-3-乙酰基-7-甲氧基-(-)-表兒茶素5-o-(6-異丁?；?-β-d-葡萄糖苷，經(jīng)過scifinder檢索發(fā)現(xiàn)該化合物為未見文獻報道的新化合物。

bf-2化合物的結構鑒定：

綠色無定型粉末，[α]22d?53.3(c0.46,ch3oh)，hr-esi-msm/z:593.2252[m+h]⁺（calcd.forc29h37o13，593.2229），推斷分子式為c29h36o13。不飽和度ω=12。bf-2通過糖水解，衍生化后用hplc分析并與糖標準品的衍生物對照，證明其糖單元為d-葡萄糖。

ir譜顯示羥基吸收（3422cm^-1），羰基吸收（1722cm^-1）以及芳環(huán)吸收（1623，1597，1501，1441cm^-1）。

¹hnmr譜中顯示有1個呈三重峰的甲基信號δh0.85（3h,t,j=7.5hz），1個呈雙峰的甲基信號δh1.13（3h,d,j=5.5hz）和1個單峰甲基信號δh1.88（3h,s）。甲氧基氫質子δh3.74（3h,s）提示化合物母核上連有甲氧基。此外，¹hnmr譜中低場δh6.93（1h,s），6.76（2h）提示苯環(huán)上連著三個氫質子，分別為h-2'、h-5'、h-6'的氫質子信號，它們共同形成abx體系。δh6.35（1h,d,j=2hz），δh6.22（1h,d,j=2hz）表示苯環(huán)上間位偶合的兩個氫，提示其為5,7-二取代。一個葡萄糖的端基氫質子信號（δh4.86,δc102.6），其偶合常數(shù)為7，提示d-葡萄糖為β-構型。故化合物母核上連有1個β-d-葡萄糖基。

¹³cnmr譜中共顯示出29個碳信號，結合dept譜提示有4個甲基、3個亞甲基、13個次甲基及9個季碳。其中1個信號可能是一組葡萄糖碳信號包括（δc102.6、74.9、78.1、71.9、75.7、64.8）；低場區(qū)δc172.2、178.4為羰基信號；高場區(qū)δc12.0、17.0、21.0為甲基信號，δc56.0為甲氧基信號。將剩下碳信號與黃烷醇類化合物比對，提示可能是黃烷醇類化合物的衍生物。將bf-2與化合物bf-1相比，他們的化學位移值相似，主要區(qū)別在于bf-2多了一個亞甲基，結合碳譜信號（δc178.4、42.4、27.9、12.0、17.0）及其各自相連的氫質子信號推測出2-甲基丁酸酯基團的存在。

hmbc譜顯示，葡萄糖氫質子glc-h2-6（δh4.19，4.47與c-1'''（δc178.8）有遠程相關，故2-甲基丁酸酯基團連接在glc-c-6位上。bf-2其余核磁數(shù)據(jù)均與bf-1一致。根據(jù)¹hnmr、¹³cnmr、dept、¹h-¹hcosy、hmbc和hsqc譜的信息，對bf-2的碳氫信號進行全歸屬。

將bf-2水解后的母核與標準品(-)-表兒茶素的cd譜信號比對，二者信號吻合，可確定bf-2母核的絕對構型亦為2r，3r。

綜合以上解析，確定了化合物的結構為(2r,3r)-3-acetyl-7-methoxyl-(-)-epicatechin5-o-[6-(2-methylbutanoyloxyl)]-β-d-glucopyranoside，中文名為：(2r,3r)-3-乙?；?7-甲氧基-(-)-表兒茶素5-o-[(6-(2-甲基異丁?；?]-β-d-葡萄糖苷，經(jīng)過scifinder檢索發(fā)現(xiàn)該化合物為未見文獻報道的新化合物。

實施例2：黃烷醇類化合物bf-1和bf-2對酪氨酸酶的抑制機理研究

試劑配制

（1）1mol/l氫氧化鉀溶液配制：將5.6g的氫氧化鉀溶于dd水中，然后定容至100ml。

（2）ph6.8的磷酸鹽緩沖溶液配制：將3.4g的磷酸二氫鉀溶于500mldd水中，用（1）中1mol/l氫氧化鉀溶液調ph至6.8。

（3）0.5mmol/l單酚底物配制：將9.10mg的l-酪氨酸溶于ph6.8的磷酸鹽緩沖溶液中，然后定容至100ml，4℃保存，待用。

（4）2mmol/l二酚底物配制：將39.44mg的l-dopa溶于ph6.8的磷酸鹽緩沖溶液中，然后定容至100ml，4℃保存，待用。

（5）酪氨酸酶的配制：將9.31mg(25ku)的蘑菇酪氨酸酶溶于9.31ml的磷酸鹽緩沖溶液中，再用磷酸鹽緩沖溶液稀釋2倍，得到1342.65u/ml的酶溶液（酶在體系中終濃度為191.8u/ml），稀釋4倍后，酶在體系中終濃度為95.9u/ml。

（6）化合物bf-1、bf-2溶液配制：精確稱取足量的單體，分別用含10%dmso的磷酸鹽緩沖溶液溶解配成不同濃度（0.15、0.3、0.6、1.2、2mmol/l）溶液。

化合物bf-1、bf-2對酪氨酸酶活性抑制試驗

化合物bf-1、bf-2的酪氨酸酶單酚酶活力測定是以0.5mmol/l的l-酪氨酸為底物，而二酚酶活力的測定則以1mmol/l的l-dopa為底物。測定單酚酶和二酚酶的活力，選配好的蘑菇酪氨酸酶母液，稀釋4倍，酶在體系中終濃度為95.9u/ml。而各單體樣品在體系終濃度為2mmol/l。按表1準確吸取1、2、3、4組反應液，每組反應體系為210μl，即在96孔板中，每孔有210μl的反應體系，每組設置3個復孔，充分混勻后再在37℃的搖床中孵育30min,迅速在490nm處測其吸光值，并按表1公式求抑制率（%ir）。

表1反應溶液系統(tǒng)

其中，a1、a2、a3、a4分別為第1組、第2組、第3組及第4組體系反應30min后測得的吸光度。

酪氨酸酶活力單位（u/min）規(guī)定：以每分鐘反應液在490nm波長的光密度值增加0.001為一個酶活力單位。

以曲酸對酪氨酸酶的抑制率作為陽性對照，研究化合物bf-1、bf-2對酪氨酸活性的抑制率，結果見圖1、2。圖1、2表明化合物bf-1、bf-2對酪氨酸酶單酚酶活性及二酚酶活性均有較強的抑制作用，且化合物bf-1、bf-2對酪氨酸酶的抑制率甚至超過作為陽性藥的曲酸，具有統(tǒng)計學意義。

化合物bf-1、bf-2對酪氨酸酶的ic50的測定

將不同濃度（0.15、0.3、0.6、1.2、2mmol/l）的化合物bf-1、bf-2溶液，分別以0.5mmol/l的l-酪氨酸和1mmol/l的l-dopa為底物，且酶在體系中終濃度為95.9u/ml，按上述2.方法分別測這各個濃度bf-1、bf-2對酪氨酸酶單酚酶和二酚酶活力的抑制率（%ir），求ic50值。

化合物bf-1和bf-2對酪氨酸酶的抑制曲線分別見圖3和4?；衔颾f-1和bf-2對酪氨酸酶的抑制率隨著濃度的增大而增大。

由圖3可知化合物bf-1濃度在0.6mmol/l以下時，樣品對酪氨酸酶的抑制率隨著樣品濃度的增加而顯著增加；但當濃度在0.6mmol/l以上時，抑制率的增加幅度趨緩?；衔颾f-1對酪氨酸酶的單酚酶活性及二酚酶活性的抑制達到50%時所對應的抑制劑濃度分別為0.89mmol/l和0.77mmol/l。

由圖4可知化合物bf-2濃度在0.3mmol/l以下時，樣品對酪氨酸酶的抑制率隨著樣品濃度的增加幅度較緩；但當濃度在0.3-0.6mmol/l時，抑制率的增加幅度較大，而當濃度在0.6mmol/l以上時，抑制率的增加幅度又趨緩?；衔颾f-2對酪氨酸酶的單酚酶活性及二酚酶活性的抑制達到50%時所對應的抑制劑濃度分別為0.82mmol/l和0.75mmol/l。

酶動力學研究

4.1米氏方程

對于簡單的酶促反應，底物濃度與酶反應初速度間的定量關系可以用數(shù)學表達式(3-2)表示，即米氏方程來表示:

式中，ν0表示酶促反應初速度；vm表示酶的最大反應初速度；［s］表示底物濃度；km表示米氏常數(shù)。

通常用lineweaver-burk雙倒數(shù)方程可以求出米氏方程中的km和vm值，即:

也就是說，在不同的底物濃度測定酶促反應的初速度，并以1/[s」為橫坐標、1/ν0為縱坐標作圖，可以獲得一條直線，直線在橫坐標軸上的截距為l/km的絕對值，在縱坐標上的截距即為1/vm。

4.2化合物bf-2對酪氨酸酶二酚催化活性抑制的類型

配好0.2、0.6、0.8、1、2mmol/l這四種濃度的底物l-dopa，用體系終濃度為95.9u/ml的酪氨酸酶來催化其反應，分別研究0、0.3、0.6mmol/l三種濃度的抑制劑bf-2對以上反應的影響，并通過lineweaver-burk雙倒數(shù)方程獲得km和vm，確定其抑制類型，解離常數(shù)可通過km/vm或1/vm與抑制劑濃度進行二次作圖得到。

在不同濃度化合物bf-2下，酪氨酸酶催化l-dopa氧化成多巴醌的線性擬合方程如表2所示。由表2可以看出，bf-2濃度對km和vm的影響規(guī)律表明，隨著bf-2濃度增大，米氏常數(shù)km值增大而最大反應初速度vm值隨之下降，雙倒數(shù)曲線交于第二象限，其抑制機理表現(xiàn)為混合型抑制，求得動力學參數(shù)列于表3中。再以直線的斜率km/vm和截距1/vm分別對bf-2濃度進行二次作圖，由橫軸截距可分別求出復合物［ei］和［esi］的解離常數(shù)ki，kis，計算結果分別為0.657mmol/l和4.896mmol/l(表3)。由解離常數(shù)的定義可知，解離常數(shù)越小，復合物越不容易解離，結構就越穩(wěn)定，由ki<kis可知，[esi]的穩(wěn)定性較［ei］差，因此，在此體系中的bf-2分子更容易與游離酶結合形成［ei］復合物，從而影響了酶對底物的催化。

表2化合物bf-2對酪氨酸酶催化二酚底物抑制作用的lineweaver-burk方程

表3化合物bf-2對酪氨酸酶催化二酚底物抑制作用的動力學參數(shù)

討論與總結

由上述研究結果表明，化合物bf-1和bf-2對酪氨酸酶單酚酶活性及二酚酶活性均有較強的抑制作用，化合物bf-1和bf-2對酪氨酸酶的抑制率甚至超過作為陽性藥的曲酸，具有統(tǒng)計學意義，而這兩個新的黃烷醇類化合物bf-1、bf-2的特征性官能團是兩個酯羰基，結合badria等的研究成果分析，具有酯羰基的黃烷醇類化合物顯示較強的活性與兩種底物l-酪氨酸及l(fā)-dopa同樣具有酯羰基有關，它們的結構更相似。

此外，黃烷醇類化合物bf-2對酪氨酸酶的抑制類型屬于混合型抑制。