本發(fā)明屬于細(xì)胞生物學(xué)領(lǐng)域，具體涉及一種b細(xì)胞篩選方法及其在單克隆抗體制備中的應(yīng)用。

背景技術(shù)：

單克隆抗體是由單一b細(xì)胞克隆產(chǎn)生的高度均一、僅針對(duì)某一特定抗原表位的抗體，通常采用雜交瘤技術(shù)來制備，雜交瘤(hybridoma)抗體技術(shù)是在細(xì)胞融合技術(shù)的基礎(chǔ)上，將具有分泌特異性抗體能力的致敏b細(xì)胞和具有無限繁殖能力的骨髓瘤細(xì)胞融合為b細(xì)胞雜交瘤。用具備這種特性的單個(gè)雜交瘤細(xì)胞培養(yǎng)成細(xì)胞群，可制備針對(duì)一種抗原表位的特異性抗體即單克隆抗體。雜交瘤細(xì)胞的制備是生物學(xué)領(lǐng)域中常用的技術(shù)手段，常規(guī)方法中對(duì)融合后的細(xì)胞株的檢測(cè)，鑒定費(fèi)時(shí)費(fèi)力，成功率不高。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

本發(fā)明所要解決的技術(shù)問題在于：雜交瘤細(xì)胞的制備過程中對(duì)融合細(xì)胞株的檢測(cè)費(fèi)時(shí)費(fèi)力、成功率不高。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明的技術(shù)方案為：提供一種b細(xì)胞篩選方法，包括如下步驟：

s11、在proteina蛋白基因的n端加上分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列，在c端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；

s12、將所述融合外源基因轉(zhuǎn)染已經(jīng)免疫完成的b細(xì)胞，作為待篩選細(xì)胞；

s13、向所述待篩選細(xì)胞中加入標(biāo)記熒光的抗原，使用流式細(xì)胞儀將帶有熒光的細(xì)胞分選收集，得到陽性b細(xì)胞。

在本發(fā)明提供的b細(xì)胞篩選方法中，所述步驟s11中，設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，在n端加上分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列，在c端加上跨膜蛋白基因序列，將這三段序列相連，以金黃色葡萄菌的dna為模板，采用所述上游引物和下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到所述融合外源基因。

在本發(fā)明提供的b細(xì)胞篩選方法中，所述上游引物和下游引物設(shè)計(jì)如下：

protein-bamhi-f:

5’-ccaggatccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggccaatgctgcgcaacacgatgaa-3’；

protein-xhoi-r:

5’-ccgctcgagtcagacacagaagaagatgcctagcccaatgaaaagcaggaggccggcgacgccccccagcacaatcagggcgccccccagcacaatcag-3’。

在本發(fā)明提供的b細(xì)胞篩選方法中，所述步驟s12中，將所述融合外源基因與慢病毒載體相連，得到慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染已經(jīng)免疫完成的b細(xì)胞。

在本發(fā)明提供的b細(xì)胞篩選方法中，所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與慢病毒輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染已經(jīng)免疫完成的b細(xì)胞。

在本發(fā)明提供的b細(xì)胞篩選方法中，取免疫后動(dòng)物的脾臟，分離得到的脾細(xì)胞即為所述已經(jīng)免疫完成的b細(xì)胞。

在本發(fā)明提供的b細(xì)胞篩選方法中，所述步驟s13中，分泌表達(dá)的proteina蛋白通過跨膜蛋白掛在細(xì)胞膜上，抗體分子同時(shí)被proteina蛋白吸附后被聚集在細(xì)胞膜表面，標(biāo)記熒光的抗原與抗體結(jié)合，形成proteina蛋白+目標(biāo)抗體分子+抗原的復(fù)合體，這種復(fù)合體與b細(xì)胞相連，由于抗原分子帶有熒光信號(hào)，采用流式細(xì)胞儀的分選收集陽性b細(xì)胞。

本發(fā)明還提供一種b細(xì)胞篩選方法在單克隆抗體制備中的應(yīng)用，將上述方法中篩選得到的陽性b細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，用于制備單克隆抗體。

本發(fā)明還提供一種單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

s21、在proteina蛋白基因的n端加上分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列，在c端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；

s22、將所述融合外源基因轉(zhuǎn)染已經(jīng)免疫完成的b細(xì)胞，作為待篩選細(xì)胞；

s23、向所述待篩選細(xì)胞中加入標(biāo)記熒光的抗原，使用流式細(xì)胞儀將帶有熒光的細(xì)胞分選收集，得到陽性b細(xì)胞；

s24、將所述陽性b細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，所得雜交瘤細(xì)胞用于制備單克隆抗體。

在本發(fā)明提供的單克隆抗體的制備方法中，所述步驟s24中，所述陽性b細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后，通過稀釋法培養(yǎng)得到單克隆細(xì)胞株，取其分泌的抗體。

實(shí)施本發(fā)明，具有如下有益效果：本發(fā)明通過設(shè)計(jì)分泌表達(dá)proteina蛋白，并在proteina蛋白的n端加上跨膜區(qū)蛋白，轉(zhuǎn)染已免疫完成的b細(xì)胞后，proteina蛋白自然通過跨膜蛋白與細(xì)胞膜連接，同時(shí)將免疫產(chǎn)生的抗體分子聚集在細(xì)胞表面，抗體更容易被識(shí)別和檢測(cè)，同時(shí)流式細(xì)胞儀是細(xì)胞生物學(xué)的常用儀器，它能夠快速有效對(duì)細(xì)胞進(jìn)行分析和分選，利用這個(gè)特點(diǎn)篩選陽性細(xì)胞，將大大提高實(shí)驗(yàn)效率。

附圖說明

圖1為實(shí)施例2中流式細(xì)胞儀篩選得到的陽性b細(xì)胞。

具體實(shí)施方式

下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明內(nèi)容做具體說明。

本發(fā)明創(chuàng)新點(diǎn)在于，將抗體分子集合在細(xì)胞表面，利用流式細(xì)胞儀的快速精密的分選功能，提前對(duì)待融合細(xì)胞進(jìn)行篩選，大大改進(jìn)傳統(tǒng)方法的成功率，準(zhǔn)確率，更是解決后期對(duì)單克隆抗體細(xì)胞株的檢測(cè)問題。

在本發(fā)明b細(xì)胞篩選方法的一個(gè)較佳實(shí)施例中，包括如下步驟：

s11、在proteina蛋白基因的n端加上分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列，在c端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；

s12、將所述融合外源基因轉(zhuǎn)染已經(jīng)免疫完成的b細(xì)胞，作為待篩選細(xì)胞；

s13、向所述待篩選細(xì)胞中加入標(biāo)記熒光的抗原，使用流式細(xì)胞儀將帶有熒光的細(xì)胞分選收集，得到陽性b細(xì)胞。

利用proteina蛋白能與抗體接合的特性，將proteina蛋白以跨膜表達(dá)的形式表達(dá)在b細(xì)胞膜表面，單抗分子形成時(shí)從b細(xì)胞內(nèi)分泌出來，正好被proteina蛋白截獲，通過已標(biāo)記熒光的抗原與抗體分子結(jié)合，這樣形成proteina蛋白+目標(biāo)單克隆抗體分子+抗原的復(fù)合體，這種復(fù)合體與b細(xì)胞相連，由于抗原分子帶有的熒光信號(hào)，可以采用流式細(xì)胞儀的分析分選功能，提前篩選，將帶有熒光的細(xì)胞收集，從而得到陽性b細(xì)胞。本發(fā)明中b細(xì)胞篩選方法將單克隆抗體的制備篩選過程提前進(jìn)行，利用流式細(xì)胞的分選，直接篩選出陽性細(xì)胞，再進(jìn)行融合，簡化實(shí)驗(yàn)操作，提高實(shí)驗(yàn)效率。

在本發(fā)明b細(xì)胞篩選方法的另一個(gè)較佳實(shí)施例中，在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)上，所述步驟s11中，設(shè)計(jì)上游引物和下游引物，在n端加上分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列，在c端加上跨膜蛋白基因序列，將這三段序列相連，以金黃色葡萄菌的dna為模板，采用所述上游引物和下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到所述融合外源基因。特別需要說明的是，其它能夠?qū)⑦@三段序列相連的方式其完全適用于本發(fā)明，例如全基因合成該融合外源基因，使得proteina蛋白基因的n端加上分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列，在c端加上跨膜蛋白基因序列。優(yōu)選的，所述上游引物和下游引物設(shè)計(jì)如下：

protein-bamhi-f:

5’-ccaggatccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggccaatgctgcgcaacacgatgaa-3’；

protein-xhoi-r:

5’-ccgctcgagtcagacacagaagaagatgcctagcccaatgaaaagcaggaggccggcgacgccccccagcacaatcagggcgccccccagcacaatcag-3’。

在本發(fā)明b細(xì)胞篩選方法的另一個(gè)較佳實(shí)施例中，在上述實(shí)施例的基礎(chǔ)上，所述步驟s12中，將所述融合外源基因與慢病毒載體相連，得到慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)染已經(jīng)免疫完成的b細(xì)胞。優(yōu)選的，所述慢病毒表達(dá)質(zhì)粒與慢病毒輔助質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染已經(jīng)免疫完成的b細(xì)胞。已經(jīng)免疫完成的b細(xì)胞直接動(dòng)物組織中分離，例如取免疫后動(dòng)物的脾臟，分離得到的脾細(xì)胞；當(dāng)然，其它淋巴組織中分離得到的b細(xì)胞也完全適用于本發(fā)明，例如，從消化道粘膜下的淋巴小結(jié)中分離得到的b細(xì)胞。

本發(fā)明還提供一種上述b細(xì)胞篩選方法在單克隆抗體制備中的應(yīng)用，將上述方法中篩選得到的陽性b細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，用于制備單克隆抗體。具體應(yīng)用過程即為一種單克隆抗體的制備方法，包括如下步驟：

s21、在proteina蛋白基因的n端加上分泌表達(dá)的信號(hào)肽序列，在c端加上跨膜蛋白基因序列，得到融合外源基因；

s22、將所述融合外源基因轉(zhuǎn)染已經(jīng)免疫完成的b細(xì)胞，作為待篩選細(xì)胞；

s23、向所述待篩選細(xì)胞中加入標(biāo)記熒光的抗原，使用流式細(xì)胞儀將帶有熒光的細(xì)胞分選收集，得到陽性b細(xì)胞；

s24、將所述陽性b細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合，所得雜交瘤細(xì)胞用于制備單克隆抗體。

優(yōu)選的，所述陽性b細(xì)胞與骨髓瘤細(xì)胞融合后，通過稀釋法培養(yǎng)得到單克隆細(xì)胞株，取其分泌的抗體。

實(shí)施例1

一、設(shè)計(jì)引物擴(kuò)增proteina基因序列，引物兩端分別帶有分泌信號(hào)肽及跨膜蛋白dna片段，同時(shí)引入酶切位點(diǎn)，引物設(shè)計(jì)如下：

protein-bamhi-f:

5’-ccaggatccaccatggagacagacacactcctgctatgggtactgctgctctgggttccaggttccactggtgacgcggccaatgctgcgcaacacgatgaa-3’；

protein-xhoi-r:

5’-ccgctcgagtcagacacagaagaagatgcctagcccaatgaaaagcaggaggccggcgacgccccccagcacaatcagggcgccccccagcacaatcag-3’。

在上游引物中引入bamhi酶切位點(diǎn)，下游引入xhoi，直接以金黃色葡萄菌菌液為模板，擴(kuò)增proteina基因。

二、慢病毒表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建

以plvx-puro慢病毒系統(tǒng)構(gòu)建，同時(shí)以bamhi及xhoi雙酶切plvx-puro和proteina，構(gòu)建成plvx-puro-proteina慢病毒表達(dá)質(zhì)粒，

三、proteina慢病毒液的制備

將plvx-puro-proteina質(zhì)粒和包裝質(zhì)粒pspax2,pcmv-vsv-g一起轉(zhuǎn)染293t細(xì)胞中，24小時(shí)后，收集上清液，即為proteina慢病毒液。

實(shí)施例2

以制備人糖蛋白tamm-horsfall(thp)單抗為例說明本發(fā)明完整的單克隆抗體的制備方法。

一、合成氨基酸序列

根據(jù)(ncbi)數(shù)據(jù)庫中查找到thp蛋白序列，經(jīng)過蛋白分析，選取thp抗原性較強(qiáng)的兩段蛋白序列合成多肽，序列分別為，同時(shí)分兩組合成，一組，直接合成多肽(標(biāo)記為thp)，以pbs配制成2μg/μl貯存，另外一組在合成的多肽c端偶聯(lián)熒光標(biāo)簽fitc(標(biāo)記為thp-fitc)，以pbs配制成2μg/μl避光貯存，多肽thp將作為免疫原直接免疫小鼠產(chǎn)生抗體，多肽thp-fitc作為標(biāo)記物進(jìn)行免疫熒光檢測(cè)。

二、小鼠免疫

采用balb/c小鼠的常規(guī)免疫方法，第一針免疫采用完全佐劑乳化多肽，每只小鼠免疫50微克多肽，總共免疫三只小鼠，同時(shí)取無免疫的小鼠作為參照，第二針，第三針均采用不完全佐劑乳化多肽，每針免疫時(shí)間間隔二周，其中每免疫一針后均采用斷尾法取血進(jìn)行抗體檢測(cè)。

三、小鼠脾細(xì)胞的制備

取免疫后的小鼠，摘眼球法采血，置于4℃冰箱靜止過夜，第二分離血清作為抗體陽性對(duì)照，同時(shí)通過頸脫位致死小鼠。浸泡于75％酒精中5分鐘消毒處理，于超凈臺(tái)上剪開腹部，取出脾臟置于含有血清的1460培養(yǎng)基中，剝?nèi)ブ車慕Y(jié)締組織，用無菌注射器往脾臟里注入培養(yǎng)基，使脾臟漲開，將脾細(xì)胞放于400目的篩網(wǎng)上，用注射器的內(nèi)芯擠壓脾臟，使脾細(xì)胞通過篩網(wǎng)過濾，待用。

四、proteina慢病毒液感染細(xì)胞

在制備好的小鼠脾細(xì)胞加入proteina慢病毒液感染細(xì)胞，繼續(xù)培養(yǎng)24小時(shí)，去盡培養(yǎng)基，更換新鮮培養(yǎng)基。

五、小鼠脾細(xì)胞的免疫熒光反應(yīng)

在經(jīng)過proteina慢病毒感染的小鼠脾細(xì)胞中以1比500的比例加入多肽thp-fitc，同時(shí)以無免疫小鼠脾細(xì)胞同樣處理作為陰性對(duì)照，于二氧化碳培養(yǎng)箱中反應(yīng)2小時(shí)，收集細(xì)胞，以1000r/min離心5分鐘，以pbs洗滌3次，重懸細(xì)胞于1mlpbs中，準(zhǔn)備通過流式細(xì)胞儀篩選。

六、流式細(xì)胞儀的篩選

將制備好的小鼠脾細(xì)胞通過流式細(xì)胞儀的篩選，收集陽性細(xì)胞，以1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，圖1為篩選得到的陽性細(xì)胞。

七、細(xì)胞融合

將陽性細(xì)胞與骨髓雜交瘤細(xì)胞sp2/0融合，2周后通過稀釋法得到單克隆細(xì)胞株。

八、單克隆抗體株的檢定

培養(yǎng)單克隆細(xì)胞株，取其分泌的抗體檢測(cè)，檢測(cè)結(jié)果顯示有thp單抗表達(dá)。

以上實(shí)施例進(jìn)一步說明本發(fā)明的內(nèi)容，但不應(yīng)理解為對(duì)本發(fā)明的限制。在不背離本發(fā)明精神和實(shí)質(zhì)的情況下，對(duì)本發(fā)明方法、步驟或條件所作的修改和替換，均屬于本發(fā)明的范圍。若未特別指明，實(shí)施例中所用的技術(shù)手段為本領(lǐng)域技術(shù)人員所熟知的常規(guī)手段。