本發(fā)明屬于微生物光密度監(jiān)測領域，尤其涉及微生物光密度檢測裝置及檢測方法。

背景技術：

微生物發(fā)酵和細菌耐藥性的研究分別是工業(yè)發(fā)酵和生物醫(yī)學領域中的兩大重要方向，然而無論是微生物發(fā)酵還是細菌耐藥性的研究，都需要對菌株的活性進行檢測，其菌株的活性檢測即菌株生長速率的測定。

微生物生長曲線的測定是微生物相關功能研究領域中反應微生物菌株活性的一個重要指標。生長曲線是定量描述液體培養(yǎng)基中微生物群體生長規(guī)律的實驗曲線。當把少量純種單細胞微生物接種到恒容積的液體培養(yǎng)基中進行批量培養(yǎng)后，在適宜的溫度、通氣等條件下，該群體就會由小到大，發(fā)生有規(guī)律的增長。以細胞數(shù)目的對數(shù)作縱坐標，以培養(yǎng)時間為橫坐標，就可繪出一條有延滯期、指數(shù)期、穩(wěn)定期和衰亡期4個階段組成的曲線，這就是微生物的典型生長曲線。

目前微生物生長曲線的測量方法常用有生物量測定法(如體積測量法、稱干重法、比濁法或菌絲長度測量法等)和微生物計數(shù)法(血球計數(shù)板法、染色計數(shù)法、比例計數(shù)法、液體稀釋法、平板菌落計數(shù)法、試劑紙法、膜過濾法或生理指標法等)。

然而以上的微生物生長曲線測量方法大多是人工操作測定，因此無法做到長時間、高通量、準確地連續(xù)測量，需要間隔一段時間手動取樣測量，而且取樣過程易造成對微生物生長溫度的干擾及污染，取樣過程還會對實驗人員的安全造成威脅，特別是病原微生物。

綜上所述，傳統(tǒng)的微生物生長曲線的測量方法具有耗時、耗人力、準確性低和干擾大的技術缺陷。因此，尋找一種能高通量、省時、準確性高的測量微生物生長曲線的裝置和方法是本領域技術人員亟待解決的技術問題。

技術實現(xiàn)要素：

有鑒于此，本發(fā)明公開的微生物光密度檢測裝置及檢測方法能有效解決傳統(tǒng)微生物生長曲線測量方法中耗時、耗人力、準確性低和干擾大的技術缺陷。

本發(fā)明提供的微生物光密度檢測裝置，包括固定架、均質(zhì)光板、微生物培養(yǎng)板和rgb通道檢測部件；

所述固定架包括橫向底板及至少一個縱向固定部件；

所述縱向固定部件固定設置于所述橫向底板上；

所述均質(zhì)光板設于所述固定架的橫向底板上表面；

所述微生物培養(yǎng)板固定設于所述均質(zhì)光板上方；

所述rgb通道檢測部件通過所述固定架的縱向固定部件設于所述均質(zhì)光板上方，所述rgb通道檢測部件用于測量所述微生物培養(yǎng)板中每個孔的透射光強度i；

所述微生物光密度檢測裝置還包括運算單元，所述運算單元與所述rgb通道檢測部件通信連接；運算單元通過每個孔對應的校正系數(shù)f在根據(jù)計算微生物培養(yǎng)板每個孔對應的autood值，其中it0為只含有培養(yǎng)基透射光強度，it為時間t含有微生物和培養(yǎng)基的透射光強度；所述f＝cscα，h為rgb通道檢測部件與微生物培養(yǎng)板中心的垂直距離，l為微生物培養(yǎng)板內(nèi)每個孔位與rgb通道檢測部件的距離。

作為優(yōu)選，所述透射光強度i，gwell為微生物培養(yǎng)板單個孔位的g通道圖像積分，s為微生物培養(yǎng)板單個孔位的圖像分割面積。

更為優(yōu)選，所述具體為h為rgb通道檢測部件與微生物培養(yǎng)板中心的垂直距離，l為微生物培養(yǎng)板內(nèi)每個孔位與rgb通道檢測部件的距離，gwellt0為只含有培養(yǎng)基時微生物培養(yǎng)板單個孔位的g通道圖像積分，gwellt為時間t含有微生物和培養(yǎng)基時微生物培養(yǎng)板單個孔位的g通道圖像積分，st0為只含有培養(yǎng)基時微生物培養(yǎng)板單個孔位的圖像分割面積，st為時間t含有微生物和培養(yǎng)基時微生物培養(yǎng)板單個孔位的圖像分割面積。

作為優(yōu)選，所述微生物培養(yǎng)板為24孔板或48孔板。

作為優(yōu)選，所述微生物培養(yǎng)板為48孔時，所述每個孔的校正系數(shù)f的范圍為0.945～1.065。

作為優(yōu)選，所述微生物培養(yǎng)板為24孔時，所述每個孔的校正系數(shù)f的范圍為0.979～1.02。

進一步的，微生物培養(yǎng)板上不同的孔與上方的rgb通道檢測部件的焦點會形成一夾角，使得培養(yǎng)板上不同的孔與rgb通道檢測部件的光程距離各不相同會造成檢測出現(xiàn)偏差，所述的校正系數(shù)f能把這種偏差修正。

作為優(yōu)選，所述運算單元還根據(jù)微生物的autood值通過預置公式1-4任一公式得到所述微生物常規(guī)od600值。

進一步的，微生物常規(guī)od600值為通過本發(fā)明的微生物檢測裝置獲得的微生物的autood值根據(jù)所述預置公式1-4轉換得到，微生物常規(guī)od600值與用傳統(tǒng)方法測得的微生物od600值相當。這方便了科研人員采用本發(fā)明測量微生物得到的od600值數(shù)據(jù)與傳統(tǒng)方法得到的od600值能在同一水平上進行研究的需要。

作為優(yōu)選，所述運算單元獲得24孔微生物培養(yǎng)板的autood值，根據(jù)預置公式1得到好氧條件的24孔微生物培養(yǎng)板常規(guī)od600值；所述預置公式1為a＝13.67，b＝20.95，x為微生物autood值，y為微生物常規(guī)od600值。

作為優(yōu)選，所述運算單元獲得24孔微生物培養(yǎng)板的autood值，根據(jù)預置公式2得到厭氧條件的24孔微生物培養(yǎng)板常規(guī)od600值；所述預置公式2為a＝9.07，b＝19.03，x為微生物autood值，y為微生物常規(guī)od600值。

作為優(yōu)選，所述運算單元獲得48孔微生物培養(yǎng)板的autood值，根據(jù)預置公式3得到好氧條件的48孔微生物培養(yǎng)板常規(guī)od600值；所述預置公式3為a＝13.56，b＝16.78，x為微生物autood值，y為微生物常規(guī)od600值。

作為優(yōu)選，所述運算單元獲得48孔微生物培養(yǎng)板的autood值，根據(jù)預置公式4得到厭氧條件的所述48孔微生物培養(yǎng)板常規(guī)od600值；所述預置公式4為a＝9.11，b＝17.89，x為微生物autood值，y為微生物常規(guī)od600值。

作為優(yōu)選，所述固定架的底板包括與所述均質(zhì)光相適應的凹槽。

作為優(yōu)選，所述固定架底板的凹槽與所述均質(zhì)光板通過螺栓螺母固定。

作為優(yōu)選，所述固定架為亞克力架。

作為優(yōu)選，所述固定架為黑色亞克力架。

更為優(yōu)選，所述黑色亞克力架為涂有黑色啞光漆料亞克力架。

進一步的，所述黑色啞光漆料亞克力架能有效避免均質(zhì)光板透射在微生物培養(yǎng)板的光的散射。

進一步的，本發(fā)明還公開了微生物光密度檢測方法，包括：

s1，獲取微生物培養(yǎng)板中每個孔只含有培養(yǎng)基時透射光強度it0；

s2，獲取微生物培養(yǎng)板中每個孔的時間t含有微生物和培養(yǎng)基時透射光強度it；

s3，根據(jù)微生物培養(yǎng)板是否為24孔板或48孔板進行判斷，輸出微生物培養(yǎng)板上每個孔對應的校正系數(shù)f，所述f＝cscα，h為rgb通道檢測部件與微生物培養(yǎng)板中心的垂直距離，l為微生物培養(yǎng)板內(nèi)每個孔位與rgb通道檢測部件的距離；

s4，根據(jù)公式計算微生物培養(yǎng)板每個孔的autood值，所述微生物培養(yǎng)板為48孔時，所述每個孔的校正系數(shù)f的范圍為0.945～1.065，所述微生物培養(yǎng)板為24孔時，所述每個孔的校正系數(shù)f的范圍為0.979～1.02。

作為優(yōu)選，所述的微生物光密度檢測方法，還包括：

s5，根據(jù)微生物培養(yǎng)板是否為厭氧條件的24孔板，或厭氧條件的48孔板，或好氧條件的24孔板，或好氧條件的48孔板，進行判斷；

s6，通過s5獲得的autood值通過預置公式1得到好氧條件的24孔微生物培養(yǎng)板常規(guī)od600值，或通過預置公式2得到厭氧條件的24孔微生物培養(yǎng)板常規(guī)od600值，或通過預置公式3得到好氧條件的48孔微生物培養(yǎng)板常規(guī)od600值，或通過預置公式4得到厭氧條件的48孔微生物培養(yǎng)板常規(guī)od600值。

進一步的，本發(fā)明公開的所述微生物光密度檢測和所述的微生物光密度檢測方法在檢測微生物生長狀態(tài)中的應用。

本發(fā)明公開的微生物光密度檢測裝置的運算單元通過獲取的rgb通道數(shù)值后根據(jù)autood值計算公式可以獲得微生物的autood值(od是opticaldelnsity，光密度)。本發(fā)明的微生物檢測裝置提出了校正系數(shù)用以解決微生物培養(yǎng)板每個孔與rgb通道檢測部件光程不一所造成的結果不準確的缺陷；本發(fā)明公開的autood值計算公式做了一系列的優(yōu)化后大大提高了本檢測方法在測量微生物生物量的準確性。本發(fā)明的微生物光密度檢測裝置的均質(zhì)光板發(fā)出均質(zhì)光作為微生物培養(yǎng)板的光源，光線豎直穿過培養(yǎng)板并投影與rgb通道檢測部件中，使rgb通道檢測部件測定出微生物的rgb通道數(shù)值，運算單元經(jīng)過一系列的判斷和計算得到微生物的autood值和常規(guī)od600值，該微生物光密度檢測裝置不僅重量輕，還容易生產(chǎn)，具有良好的商用前景。

因此，本發(fā)明提供的微生物光密度檢測裝置及檢測方法具有高通量、省時省力、測量精準的優(yōu)點。

附圖說明

為了更清楚地說明本發(fā)明實施例或現(xiàn)有技術中的技術方案，下面將對實施例或現(xiàn)有技術描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹。

圖1示微生物光密度檢測裝置的結構示意圖；

圖2示本發(fā)明微生物光密度檢測方法與分光光度計測量法測量大腸桿菌結果相關性圖；

圖3示傳統(tǒng)手工測量大腸桿菌的生長曲線；

圖4示應用本發(fā)明測量大腸桿菌的生長曲線；

圖5示傳統(tǒng)手工測量大腸桿菌的生長速率擬合圖；

圖6示本發(fā)明檢測方法測量大腸桿菌的生長速率擬合圖；

圖7示傳統(tǒng)手工測量和應用本發(fā)明測量大腸桿菌的生長速率標準偏差分析；

圖8示本發(fā)明微生物光密度檢測方法與分光光度計測量法測量肺炎鏈球菌結果相關性圖；

圖9示傳統(tǒng)手工測量肺炎鏈球菌的生長曲線；

圖10示應用本發(fā)明測量肺炎鏈球菌的生長曲線；

圖11示傳統(tǒng)手工測量肺炎鏈球菌的生長速率擬合圖；

圖12示本發(fā)明檢測方法測量肺炎鏈球菌的生長速率擬合圖；

圖13示傳統(tǒng)手工測量和應用本發(fā)明測量肺炎鏈球菌的生長速率標準偏差分析；

圖14示本發(fā)明的測量方法測量金色葡萄糖球菌的生長速率展示圖；

圖15示應用本發(fā)明測量大腸桿菌的生長曲線；

圖16示應用本發(fā)明測量大腸桿菌的生長速率擬合圖；

圖17示傳統(tǒng)手工測量和應用本發(fā)明測量大腸桿菌的生長速率標準偏差分析；

其中，附圖標記，1為橫向底板、2為均質(zhì)光板、3為微生物培養(yǎng)板、4為縱向固定部件、5為rgb通道檢測部件、6為運算單元。

具體實施方式

本發(fā)明提供了微生物光密度檢測裝置及檢測方法，能有效解決傳統(tǒng)微生物生長曲線測量方法中耗時、耗人力、準確性低和干擾大的技術缺陷。

下面將對本發(fā)明實施例中的技術方案進行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實施例僅僅是本發(fā)明一部分實施例，而不是全部的實施例?；诒景l(fā)明中的實施例，本領域普通技術人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動前提下所獲得的所有其他實施例，都屬于本發(fā)明保護的范圍。

其中，革蘭氏陰性菌為大腸桿菌e.colibw25113；革蘭氏陽性菌為金色葡萄糖球菌atcc29213；革蘭氏陽性菌為肺炎鏈球菌d39；lb培養(yǎng)基配方為胰蛋白胨(tryptone)10g/l，酵母提取物(yeastextract)5g/l，氯化鈉(nacl)10g/l；胰蛋白胨大豆肉湯培養(yǎng)基配方為trypticsoybroth(tsb)t8907(sigma)30g/l；thye培養(yǎng)基(0.5％酵母提取物)配方為todd-hewittbroth36.4g/l，yeastextract5.0g/l；分光光度計型號為evolμtion300μv-vis(thermoscientific)；均質(zhì)光板購買自香港美達亮medalight膠卷底片菲林觀片器lp-100n燈板拷貝臺燈箱；rgb通道檢測單元為尼康coolpixa相機；本發(fā)明使用的原料均為市售。

實施例1

請參閱圖1，本發(fā)明提供了微生物光密度檢測裝置，實施例1包括橫向底板1、均質(zhì)光板2、微生物培養(yǎng)板3、縱向固定部件4、rgb通道檢測部件5；縱向固定部件4固定垂直設置于橫向底板1的一邊；均質(zhì)光板2固定設于固定架的橫向底板1上表面；rgb通道檢測單元通過固定架的縱向固定部件4設于均質(zhì)光板2上方；運算單元6與所述rgb通道檢測部件5通信連接。

實施例2

請參閱圖1，本發(fā)明提供了微生物光密度檢測裝置，實施例2包括橫向底板1、均質(zhì)光板2、微生物培養(yǎng)板3、縱向固定部件4、rgb通道檢測部件5；縱向固定部件4固定垂直設置于橫向底板1的一邊；固定架的橫向底板1含有與均質(zhì)光板2相適應的凹槽；均質(zhì)光板2固定設于固定架的橫向底板1上表面；rgb通道檢測部件5固定設于縱向固定部件4上方，rgb通道檢測部件5需正對均質(zhì)光板2；橫向底板1和縱向固定部件4均為黑色亞克力架，黑色亞克力架能有效避免均質(zhì)光板透射在微生物培養(yǎng)板的光的散射。

實施例3

為了評價本發(fā)明檢測裝置和方法的微生物培養(yǎng)液od值測量準確性，使用分光光度計測量微生物的od值，然后使用本發(fā)明的檢測裝置和檢測方法測量同一微生物的od值。將兩種測量結果結果做相關性分析，從而評價本發(fā)明的測量結果的準確性以及與傳統(tǒng)精密儀器測量值的對應性。

1.將大腸桿菌e.colibw25113培養(yǎng)過夜，用培養(yǎng)基將大腸桿菌e.colibw25113按13個不同濃度進行稀釋。

2.用thermo分光光度計測量步驟1中13個不同濃度的大腸桿菌e.colibw25113的od600值。

3.使用本發(fā)明檢測步驟1中13個不同濃度的大腸桿菌e.colibw25113的auto24od值，包括以下步驟：

①將24孔板中每個孔加入1mllb培養(yǎng)基，設置相機參數(shù)，對焦后并拍攝只含有培養(yǎng)基的照片，獲得it0(純培養(yǎng)基透射光強度)的數(shù)值。

②吸出24孔板中每個孔位內(nèi)的lb培養(yǎng)基，每個孔加入1ml同一od的含有大腸桿菌e.colibw25113的lb培養(yǎng)液，在厭氧環(huán)境(靜止的二氧化碳培養(yǎng)箱)中測量該大腸桿菌的auto24od值，設置相機參數(shù)(光圈f20，快門1/4秒，微距對焦)，對焦后并拍攝含有培養(yǎng)基和大腸桿菌e.colibw25113的照片，獲得it(接種細菌后時間t菌液的透射光強度)的數(shù)值。

③將步驟①和②獲得的it0和it數(shù)值通過公式得出大腸桿菌e.colibw25113的auto24od值。

④以thermo分光光度計測量od600結果為y’值，本發(fā)明測量的auto24od值為x’值進行擬合，預置公式x為大腸桿菌e.colibw25113的auto24od值，y為大腸桿菌e.colibw25113的常規(guī)od600值，進行s型曲線擬合，計算兩種測量方法的相關性。

從圖2(24od為本發(fā)明檢測方法得到的auto24od值，od600為分光光度計測得的od600值)結果可以看到，對兩種方法得到od值進行線性擬合后，24個孔位的r2分布范圍在0.98767～0.99385，說明兩種方法測量結果具有很強相關性，同時在od600＝0.05～2.0范圍內(nèi)，說明本發(fā)明的微生物光密度檢測裝置和檢測方法得到的微生物od結果能達到分光光度計的測量準確度和精度。

實施例4

使用本發(fā)明檢測革蘭氏陰性菌大腸桿菌e.colibw25113的生長狀態(tài)，包括以下步驟：

1、lb培養(yǎng)基高溫121℃滅菌30min，常規(guī)24孔板紫外照射30min備用；

2、將大腸桿菌活化過夜，再次活化的菌液值od600值為0.6；

3、將固定架放入搖床中固定，并將相機5固定于固定架的縱向固定部件4，鏡頭對準均質(zhì)光板2；

4、在24孔板中加入1mllb培養(yǎng)基，蓋上24孔板板蓋，然后將24孔板通過螺絲固定在固定架的均質(zhì)光板上表面，打開均質(zhì)光板電源燈光；

5、設定相機參數(shù)(光圈f20，快門1/4秒，微距對焦)，微距對焦后，拍照586張，間隔時間2s，蓋上大搖床蓋，設定參數(shù)：溫度37℃，轉速220rpm，開機檢測，獲得初始條件的it0；

6、按照體積比1∶100，接入10μl菌液于1mllb培養(yǎng)基，重新將24孔板固定于固定架，在大腸桿菌e.colibw25113好氧環(huán)境下(搖床轉動條件)拍攝，設定相機參數(shù)(光圈f20，快門1/4秒，微距對焦)，微距對焦后，拍照586張，間隔時間60s，蓋上大搖床蓋，設定參數(shù)：溫度37℃，轉速220rpm，開機檢測，獲得it；

7、根據(jù)其中it0為純培養(yǎng)基透射光強度，it為接種細菌后時間t菌液的透射光強度，f為校正系數(shù)，f＝cscα，h為rgb通道檢測部件與微生物培養(yǎng)板中心的垂直距離，l為微生物培養(yǎng)板內(nèi)每個孔位與rgb通道檢測部件的距離，f系數(shù)范圍為0.979～1.02，獲得本發(fā)明檢測方法的大腸桿菌e.colibw25113的auto24od值，根據(jù)公式的a＝13.67.b＝20.95，x為大腸桿菌e.colibw25113的auto24od值，y為大腸桿菌e.colibw25113的常規(guī)od600值，得到大腸桿菌e.colibw25113的常規(guī)od600值，將常規(guī)od600值繪制成圖4(times/min為時間/分鐘，od600為采用本裝置測得常規(guī)od600值)，將得到的常規(guī)od600值取log10后為y軸，以時間為x軸，進行擬合作圖，得到平滑曲線繪制得到圖6(times/min為時間/分鐘，log10od600為采用本法裝置測得的常規(guī)od600值取log10)；

8、同時使用傳統(tǒng)的手工測量方法，把大腸桿菌e.colibw25113菌液按照1∶100體積比接種到滅菌錐形瓶中，設置三個重復，標記為wt1、wt2和wt3，放入恒溫大搖床中培養(yǎng)，設定參數(shù)：溫度37℃，轉速220rpm；

9、手工測量方法每隔30min，從錐形瓶中取出1ml菌液，用thermo分光光度計測量大腸桿菌e.colibw25113菌液od600值，繪出圖3(times/h為時間/小時，od600為分光光度計測得的od600值)的生長曲線，還將得到的所述的od600值取log10后為y’軸，以時間為x’軸，wt1、wt2和wt3的生長曲線分別進行進行生長速率擬合，得到圖5(wt1、wt2和wt3為三組重復，times/h為時間/小時，縱坐標為傳統(tǒng)手工測量得到的od600值取log10)；

10、本發(fā)明的檢測方法得到的auto24od值(圖7中標記為auto24od)和傳統(tǒng)手工方法得到的od600值(圖7中標記為手動測試)進行標準偏差分析，如圖7(手動測試為傳統(tǒng)手工測量方法得到的標準偏差，auto24od為本發(fā)明的測量方法得到autood值的標準偏差)所示，樣本標準偏差為每個時間點得到的od值x1，x2，...，xn的均值，n為樣品個數(shù)；使用同樣的方法計算大腸桿菌在48孔培養(yǎng)板的標準偏差，如圖17(手動測試為傳統(tǒng)手工測量方法得到的標準偏差，auto48od為本發(fā)明的測量方法得到的標準偏差)。

從結果可以看到，對比傳統(tǒng)的手工測量方法，本發(fā)明可以在很短的時間間隔進行測量，測量數(shù)據(jù)點多，而且本發(fā)明的樣本標準偏差小于傳統(tǒng)手動測試方法，其準確度大大高于傳統(tǒng)手工方法，擬合的生長曲線較平滑，符合標準的生長曲線模型。

實施例5

以革蘭氏陽性菌為肺炎鏈球菌d39評價本發(fā)明裝置和測量方法測量肺炎鏈球菌od的準確性，使用實驗室分光光度計測量肺炎鏈球菌的od600值，然后使用本發(fā)明測量同一肺炎鏈球菌的od值。計算得到的結果做相關性分析，從而評價本發(fā)明的測量結果的準確性以及與傳統(tǒng)精密儀器測量值的對應性。

1、將肺炎鏈球菌d39培養(yǎng)過夜，用培養(yǎng)基將肺炎鏈球菌d39按13個不同濃度進行稀釋。

2、用thermo分光光度計測量步驟1中13個不同濃度的肺炎鏈球菌d39的od值。

3、使用本發(fā)明檢測步驟1中13個不同濃度的肺炎鏈球菌d39的auto24od值，包括以下步驟：

①將24孔板中每個孔加入1mlthye培養(yǎng)基，設置相機參數(shù)，對焦后并拍攝只含有培養(yǎng)基的照片，獲得it0(純培養(yǎng)基透射光強度)的數(shù)值。

②吸出24孔板中每個孔位內(nèi)的thye培養(yǎng)基，每個孔加入1ml同一od的含有肺炎鏈球菌d39的lb培養(yǎng)液，在靜止的二氧化碳培養(yǎng)箱中測量該肺炎鏈球菌d39的auto24od值，設置相機參數(shù)(光圈f20，快門1/4秒，微距對焦)，對焦后并拍攝含有培養(yǎng)基和肺炎鏈球菌d39的100張照片，獲得it(接種細菌后時間t菌液的透射光強度)的數(shù)值。

③將步驟①和②獲得的it0和it數(shù)值通過公式得出肺炎鏈球菌d39的auto24od值。

④以thermo分光光度計測量od(圖8的縱坐標)結果為y’值，本發(fā)明測量的auto24od值(標記為24od)為x’，根據(jù)預置公式進行s型擬合，計算兩種測量方法的相關性，如圖8(24od為本發(fā)明檢測方法得到的auto24od值，od為分光光度計測得的od值)所示。

從圖8可以看到，對兩種方法得到od值進行線性擬合后，24個孔位的r2分布范圍在0.98626～0.99238，說明兩種方法測量結果具有很強相關性，同時在od＝0.05～1.40范圍內(nèi)，本發(fā)明的測量結果能達到通用分光光度計的測量準確度和精度。

實施例6

使用本發(fā)明檢測革蘭氏陽性肺炎鏈球菌d39的生長狀態(tài)，包括以下步驟：

1、thye培養(yǎng)基高溫110℃滅菌15min，常規(guī)24孔板紫外照射30min備用；

2、肺炎鏈球菌d39在厭氧培養(yǎng)箱內(nèi)活化過夜，再次活化菌液值od600為0.5；

3、將本發(fā)明的檢測裝置放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱內(nèi)固定，并將相機固定于縱向固定部件上部；

4、在24孔板中加入1mlthye培養(yǎng)基，蓋上24孔板板蓋，然后將24孔板通過螺絲固定在固定架的均質(zhì)光板上表面，打開均質(zhì)光板電源燈光；

5、設定相機參數(shù)(光圈f20，快門1/4秒，微距對焦)，微距對焦后，拍照300張，間隔時間2s，蓋上大搖床蓋，設定參數(shù)：溫度37℃，轉速220rpm，開機檢測，獲得初始條件的it0；

6、按照體積比1∶50，接入20μl菌液于1ml的thye培養(yǎng)基，重新將24孔板固定于固定架，在肺炎鏈球菌d39厭氧環(huán)境下拍攝，設定相機參數(shù)(光圈f20，快門1/4秒，微距對焦)，微距對焦后，拍照600張，間隔時間60s，獲得it；

7、根據(jù)其中it0為純培養(yǎng)基透射光強度，it為接種細菌后時間t菌液的透射光強度，f為校正系數(shù)，f＝cscα，h為rgb通道檢測部件與微生物培養(yǎng)板中心的垂直距離，l為微生物培養(yǎng)板內(nèi)每個孔位與rgb通道檢測部件的距離，f系數(shù)范圍為0.979～1.02，獲得本發(fā)明檢測方法的肺炎鏈球菌d39的auto24od值，根據(jù)公式a＝9.07，b＝19.03，x為肺炎鏈球菌d39的auto24od值，y為肺炎鏈球菌d39的常規(guī)od600值，得到肺炎鏈球菌d39的常規(guī)od600值，將常規(guī)od600值繪制成圖10(times/min為時間/分鐘，od600為采用本裝置測得常規(guī)od600值)，將得到的常規(guī)od600值取log10后為y軸，以時間為x軸，進行擬合作圖，得到平滑曲線繪制得到圖12(times為時間/分鐘，log10od600為采用本檢測裝置測得常規(guī)od600值取log10)；

8、同時使用傳統(tǒng)的手工測量方法，把肺炎鏈球菌d39菌液按照1：50體積比接種到滅菌錐形瓶中，設置三個重復，標記為wt1、wt2和wt3，放入?yún)捬跖囵B(yǎng)箱中培養(yǎng)，設定參數(shù)：溫度37℃；

9、手工測量方法每隔45min，從錐形瓶中取出600μl菌液，用thermo分光光度計測量肺炎鏈球菌d39菌液od600值，繪出圖9(times/h為時間/小時，od600為分光光度計測得的od值)的生長曲線，還將得到的od600值取log10后為y’軸，以時間為x’軸，wt1、wt2和wt3的生長曲線分別進行生長速率擬合，得到圖11(wt1、wt2和wt3為三組重復，times/h為時間/小時，縱坐標為傳統(tǒng)手工測量得到的od600值取log10)；

10、本發(fā)明的檢測方法得到的auto24od值(圖13中標記為auto24od)和傳統(tǒng)手工方法得到的常規(guī)od600值(圖13中標記為手動測試)進行誤差分析，如圖13(手動測試為傳統(tǒng)手工測量方法得到的標準偏差，auto24od為本發(fā)明的測量方法得到autood值的標準偏差)所示，樣本標準偏差為每個時間點得到的od值x1，x2，...，xn的均值，n為樣品個數(shù)。

從結果可以看到，對比傳統(tǒng)的手工測量方法，本發(fā)明可以在很短的時間間隔進行測量，測量數(shù)據(jù)點多，測量誤差率大大降低，擬合的生長曲線較平滑，符合標準的生長曲線模型，而且手動測試需要在超凈臺取出菌液，從而影響細菌的生長，因此所得生長曲線生長較慢，而且在取出菌液過程中容易發(fā)生雜菌污染，相比之下本發(fā)明的優(yōu)勢更加明顯。

實施例7

使用本發(fā)明檢測革蘭氏陽性菌金色葡萄糖球菌atcc29213的生長狀態(tài)，包括以下步驟：

1、tsb(胰蛋白胨大豆肉湯)培養(yǎng)基高溫121℃滅菌30min，常規(guī)24孔板紫外照射30min備用；

2、金色葡萄糖球菌活化過夜，再次活化菌液值od600值為1；

3、將固定架放入搖床中固定，并將相機5固定于固定架的縱向固定部件4，鏡頭對準均質(zhì)光板2；

4、在24孔板中加入1mltsb培養(yǎng)基，蓋上平板蓋，然后將平板放入l架子中，并旋緊螺絲固定，打開均質(zhì)光板電源燈光；

5、設定相機參數(shù)(光圈f20，快門1/4秒，微距對焦)，微距對焦后，拍照300張，間隔時間2s，蓋上大搖床蓋，設定參數(shù)：溫度37℃，轉速220rpm，開機檢測，獲得初始條件的it0；

6、按照體積比1∶100，接入10μl菌液于1mltsb培養(yǎng)基，重新將24孔板固定于固定架，在大腸桿菌bw25113好氧環(huán)境下(搖床轉動條件)拍攝，設定相機參數(shù)(光圈f20，快門1/4秒，微距對焦)，微距對焦后，拍照1000張，間隔時間60s，蓋上大搖床蓋，設定參數(shù)：溫度37℃，轉速220rpm，開機檢測，獲得it；

7、根據(jù)其中it0為純培養(yǎng)基透射光強度，it為接種細菌后時間t菌液的透射光強度，f為校正系數(shù)，f＝cscα，h為rgb通道檢測部件與微生物培養(yǎng)板中心的垂直距離，l為微生物培養(yǎng)板內(nèi)每個孔位與rgb通道檢測部件的距離，f系數(shù)范圍為0.979～1.02，獲得本發(fā)明檢測方法的大腸桿菌bw25113的auto24od值取log10后為y，時間為x繪圖，得到圖14(well1-24為第1-24孔，縱坐標為auto24od值取log10，橫坐標為時間/分鐘)。

從圖14可以看到，本發(fā)明適用于各種菌種的生長曲線測定，測定結果良好且穩(wěn)定，不受培養(yǎng)基種類和菌株種類的限制，實用性好。

實施例8

使用本發(fā)明檢測革蘭氏陰性菌大腸桿菌e.colibw25113的生長狀態(tài)，包括以下步驟：

1、lb培養(yǎng)基高溫121℃滅菌30min，常規(guī)24孔板紫外照射30min備用；

2、將大腸桿菌活化過夜，再次活化菌液值od600值為0.6；

3、將固定架放入搖床中固定，并將相機5固定于固定架的縱向固定部件4，鏡頭對準均質(zhì)光板2；

4、在48孔板中加入400μllb培養(yǎng)基，蓋上平板蓋，然后將48孔板通過螺絲固定在固定架的均質(zhì)光板上表面，打開均質(zhì)光板電源燈光；

5、設定相機參數(shù)(光圈f20，快門1/4秒，微距對焦)，微距對焦后，拍照300張，間隔時間2s，蓋上大搖床蓋，設定參數(shù)：溫度37℃，轉速220rpm，開機檢測，獲得初始條件的it0；

6、調(diào)零板拍攝完畢后，按照體積比1∶100，接入4μl菌液于400μl的lb培養(yǎng)基，重新將24孔板固定于固定架，在大腸桿菌bw25113好氧環(huán)境下(搖床轉動條件)拍攝，設定相機參數(shù)(光圈f20，快門1/4秒，微距對焦)，微距對焦后，拍照1000張，間隔時間60s，蓋上大搖床蓋，設定參數(shù)：溫度37℃，轉速220rpm，開機檢測，獲得it；

7、根據(jù)其中it0為純培養(yǎng)基透射光強度，it為接種細菌后時間t菌液的透射光強度，f為校正系數(shù)，f＝cscα，h為rgb通道檢測部件與微生物培養(yǎng)板中心的垂直距離，l為微生物培養(yǎng)板內(nèi)每個孔位與rgb通道檢測部件的距離，f系數(shù)范圍為0.945～1.065，獲得本發(fā)明檢測方法的大腸桿菌e.colibw25113的auto48od值，根據(jù)公式a＝13.56.b＝16.78，x為大腸桿菌e.colibw25113的auto48od值，y為大腸桿菌e.colibw25113的常規(guī)od600值，得到大腸桿菌e.colibw25113的常規(guī)od600值，將常規(guī)od600值繪制成圖15(well1-48為第1-48孔，od600為采用本檢測裝置測得大腸桿菌常規(guī)od600值)，將得到的常規(guī)od600值取log10后為y軸，以時間為x軸，進行擬合作圖，得到平滑曲線繪制得到圖16(time為時間/分鐘，log10od600為采用本檢測裝置測得常規(guī)od600值取log10)。

結果如圖15-圖16所示，在48孔板的測量模塊下，本發(fā)明仍然取得較好的測試結果，可以檢測出48條平滑的生長曲線。

以上所述僅是本發(fā)明的優(yōu)選實施方式，應當指出，對于本技術領域的普通技術人員來說，在不脫離本發(fā)明原理的前提下，還可以做出若干改進和潤飾，這些改進和潤飾也應視為本發(fā)明的保護范圍。