本發(fā)明涉及肝素鈉提取領(lǐng)域，具體而言，涉及復(fù)合酶提取肝素的方法。
背景技術(shù)：
：肝素(heparin)是重要的生物藥品，具有很重要的生物功能，產(chǎn)品形式通常是肝素鈉鹽。據(jù)ims統(tǒng)計(jì)，2008年肝素市場(chǎng)的全球銷售額已突破50億美元。我國(guó)是肝素鈉主要出口國(guó)家之一，但出口產(chǎn)品以低價(jià)的粗品肝素為主。我國(guó)現(xiàn)行的肝素提取和純化工藝比較落后，產(chǎn)品雜質(zhì)含量較高。為了滿足醫(yī)學(xué)臨床及生化研究，每年要從國(guó)外大量進(jìn)口精品肝素及低分子肝素。目前臨床上用于抗血栓的藥劑主要是低分子肝素制劑。肝素是一種高度硫酸化、復(fù)雜、多分散的線形糖胺聚糖(glycosaminoglycans,簡(jiǎn)稱gags)，是具有不同鏈長(zhǎng)即不同分子量的各種大小分子所組成的混合物，因此其分子量具有多分散性，一般其分子量在3000-30000道爾頓之間，平均分子量約為15000道爾頓。最早的肝素提取方法介紹見于howell在美國(guó)生理雜志上發(fā)表的文章，肝素提取需要去除雜質(zhì)后再精制，因此在處理原料時(shí)要通過(guò)酶水解、鹽析等方法去除蛋白質(zhì)，得到肝素粗品。粗品肝素中含有其它黏多糖，也含有一些殘余的蛋白質(zhì)和核酸類物質(zhì)，從而使粗品肝素的效價(jià)過(guò)低?，F(xiàn)有的工藝對(duì)酸堿性雜質(zhì)，是通過(guò)等電點(diǎn)沉淀及熱變性作用、鹽析作用等辦法去除；對(duì)低抗凝活性的水溶雜質(zhì)，通過(guò)控制產(chǎn)品溶液濃度特別是酒精沉淀濃度來(lái)加以去除；對(duì)熱原雜質(zhì)，通過(guò)超濾氧化及離子交換方法加以去除。國(guó)內(nèi)常用的豬小腸肝素提取方法是鹽析法；60、70年代美國(guó)專利技術(shù)-氧化法純化技術(shù)在國(guó)外曾經(jīng)廣泛采用；國(guó)內(nèi)90年代以前基本采用組合氧化法純化技術(shù)是肝素的主要純化方法，因此對(duì)氧化法純化技術(shù)研究的比較多。例如，現(xiàn)有技術(shù)(cn102746421a)公開了一種粗品肝素鈉提純的方法，主要時(shí)對(duì)粗品肝素鈉進(jìn)行溶解、吸附、洗脫、沉淀和干燥處理，最終得到肝素鈉產(chǎn)品。同時(shí)，現(xiàn)有技術(shù)(cn103588902a)公開了一種采用吸附、醇沉以及兩步氧化法對(duì)粗品肝素鈉進(jìn)行提純的方法。同樣的，現(xiàn)有技術(shù)(cn10299336a)公開了一種采用加入硅藻土、聚合氯化鋁后經(jīng)離心除雜，再經(jīng)醇沉、雙氧水氧化、醇沉以及過(guò)濾、冷凍干燥后得到肝素鈉產(chǎn)品。然而，這些傳統(tǒng)方法工藝較為復(fù)雜，產(chǎn)品的生產(chǎn)周期長(zhǎng)，并且在提純過(guò)程中需要加入化學(xué)試劑，處理成本較高，精制的過(guò)程也較為復(fù)雜，產(chǎn)品純度也難以保證。近幾年，隨著生物技術(shù)的進(jìn)展，以及新型高分子材料的不斷出現(xiàn)，又有新成果出現(xiàn)。酶解輔助提取肝素，離子交換層析分離肝素技術(shù)是現(xiàn)在企業(yè)主要使用的技術(shù)。加入蛋白水解酶，可以減少水解時(shí)間和減少微生物的污染。但酶解技術(shù)受限于溫度、ph的控制，提取肝素后還要滅酶、并將其除去，同時(shí)采用離子交換法從酶解液中吸附肝素時(shí)，由于吸附不完全，所以會(huì)導(dǎo)致殘留液中仍含有較高量的肝素，從而影響肝素得率。雖然肝素提取純化技術(shù)的研究已有眾多報(bào)道，專家們?cè)诟鞣N提取、分離純化肝素的技術(shù)研究方面也做了大量工作，但綜合而言，提取技術(shù)水平較高的仍然是發(fā)達(dá)國(guó)家，他們不僅開創(chuàng)和掌握了扎實(shí)的提取技術(shù)，并具有專用的高分子材料和裝備。國(guó)內(nèi)目前這方面欠缺的是先進(jìn)的工藝和配套的裝備。為此，進(jìn)一步深入探索粗肝素的酶解、提取和分離純化技術(shù)，選擇適合我國(guó)中小企業(yè)的粗品肝素生產(chǎn)模式及研究適合的技術(shù)裝備，將具有重要的實(shí)用價(jià)值。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一目的在于提供一種復(fù)合酶提取肝素的方法，所述方法中，通過(guò)使用堿性蛋白酶和胰蛋白酶的復(fù)合酶進(jìn)行酶解，從而能夠有效的將肝素鈉從原材料中分離得到，進(jìn)而提高肝素鈉粗品的提取率。本發(fā)明的第二目的在于提供一種由本發(fā)明方法提取得到的肝素鈉粗品。本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種肝素鈉的制備方法。為了實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的上述目的，特采用以下技術(shù)方案：一種復(fù)合酶提取肝素的方法，所述方法包括如下步驟：收集豬小腸新鮮粘膜，并粉碎，加水?dāng)嚢?，然后加鹽攪拌均勻，加入堿性蛋白酶和胰蛋白酶進(jìn)行酶解；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到肝素鈉粗品。可選的，本發(fā)明中，鹽濃度為0.60～0.70mol/l；優(yōu)選的，鹽濃度為0.65～0.68mol/l?？蛇x的，本發(fā)明中，所述方法還進(jìn)一步包括在酶解前將體系的ph調(diào)節(jié)至8.5～9的步驟；優(yōu)選的，是將體系的ph調(diào)節(jié)至8.6～8.8?？蛇x的，本發(fā)明中，所述堿性蛋白酶和胰蛋白酶的總量為0.3～0.5g/l?？蛇x的，本發(fā)明中，所述堿性蛋白酶和胰蛋白酶的用量比為(2～4)：(1～2)；優(yōu)選的，所述堿性蛋白酶和胰蛋白酶的用量比為(2～3)：(1～1.5)；更優(yōu)選的，所述堿性蛋白酶和胰蛋白酶的用量比為(2～2.5)：1?？蛇x的，本發(fā)明中，所述酶解的溫度為55～65℃，酶解的時(shí)間為2～4h；優(yōu)選的，酶解的溫度為60～62℃，酶解的時(shí)間為3～4h?？蛇x的，本發(fā)明中，所述樹脂為大孔樹脂；優(yōu)選的，所述樹脂為d208樹脂?？蛇x的，本發(fā)明中，所述干燥的溫度為80～85℃，干燥的時(shí)間為10～15h。同時(shí)，本發(fā)明還提供了由本發(fā)明所述方法提取得到肝素鈉粗品。進(jìn)一步的，本發(fā)明也提供了一種肝素鈉的制備方法，所述方法中首先按照本發(fā)明所述方法提取得到肝素鈉粗品，再由肝素鈉粗品精制得到肝素鈉。與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明的有益效果為：(1)相較于使用單一種類的酶進(jìn)行酶解而言，本發(fā)明采用復(fù)合酶進(jìn)行酶解的方法，能夠有效提高酶解效率，同時(shí)提高肝素鈉粗品的產(chǎn)率；(2)本發(fā)明中，通過(guò)對(duì)酶解條件的選擇和調(diào)整，能夠進(jìn)一步優(yōu)化酶解反應(yīng)流程，進(jìn)一步提高肝素鈉粗品的產(chǎn)率。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的實(shí)施方案進(jìn)行詳細(xì)描述，但是本領(lǐng)域技術(shù)人員將會(huì)理解，下列實(shí)施例僅用于說(shuō)明本發(fā)明，而不應(yīng)視為限制本發(fā)明的范圍。實(shí)施例中未注明具體條件者，按照常規(guī)條件或制造商建議的條件進(jìn)行。所用試劑或儀器未注明生產(chǎn)廠商者，均為可以通過(guò)市售購(gòu)買獲得的常規(guī)產(chǎn)品。鑒于目前現(xiàn)有技術(shù)中對(duì)肝素提取所存在的肝素得率低等問(wèn)題，本發(fā)明特采用一種復(fù)合酶酶解提取-提取液濃縮-過(guò)濾-樹脂吸附-洗脫-沉淀-干燥的方法進(jìn)行肝素提取，從而有效提高了肝素的得率，具體的：本發(fā)明中，所用原材料為豬小腸粘膜，其可以由新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理后得到；然后，將所得到的豬小腸新鮮粘膜粉碎，然后加入適量的水進(jìn)行攪拌，并攪拌均勻；接著，加入適量的鹽，并優(yōu)選的使得體系中鹽濃度能夠達(dá)到0.65～0.68mol/l，繼續(xù)攪拌均勻；然后，將體系的ph調(diào)節(jié)至8.5～9，優(yōu)選的調(diào)節(jié)至8.6、8.7，或者8.8；同時(shí)，將體系溫度調(diào)整至55～65℃，優(yōu)選的調(diào)整至60～62℃；在經(jīng)過(guò)如上的調(diào)整后，體系已經(jīng)適于進(jìn)行酶解反應(yīng)，然后，按照(2～4)：(1～2)的質(zhì)量比，分別加入適量堿性蛋白酶和胰蛋白酶，并使得體系中酶的總濃度能夠達(dá)到0.3～0.5g/l；其中，優(yōu)選的，可以將兩種酶的質(zhì)量比調(diào)整為(2～3)：(1～1.5)；更優(yōu)選的，兩種酶的質(zhì)量比為(2～2.5)：1；酶解的時(shí)間控制在2～4h，更優(yōu)選的，酶解時(shí)間控制在3～4h；然后，將所得酶解液濃縮，并在濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入大孔樹脂進(jìn)行吸附，優(yōu)選的，所述大孔樹脂為d208樹脂；進(jìn)一步優(yōu)選的，在使用之前需要對(duì)大孔樹脂進(jìn)行預(yù)處理，預(yù)處理的步驟可參考如下：將原料干樹脂在蒸餾水中充分浸泡，然后在溶脹后濾干，加等體積乙醇攪拌1h,用蒸餾水洗凈濾干,加4倍量的2mol/l的鹽酸溶液攪拌2h,用蒸餾水洗至中性,濾干；加2倍量2mol/l的氫氧化鈉溶液攪拌2h,蒸餾水洗至中性,濾干；最后用2倍量2mol/l的鹽酸溶液攪拌2h,水洗至中性,濾干后備用；加入大孔樹脂進(jìn)行吸附的步驟可優(yōu)選的參考如下：將濃縮過(guò)濾后所得濾液加入吸附罐中，然后加入離子交換水，并調(diào)整其鹽濃度為1～6mol/l；然后加入樹脂進(jìn)行離子交換，并吸附肝素鈉；此步驟的時(shí)間控制在0.5～8h；離子交換后的樹脂以清水清洗后，進(jìn)行洗脫；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，得到洗脫液；然后將洗脫液以酒精沉淀，沉淀的時(shí)間控制在10～12h；然后，將體系進(jìn)行固液分離，將固形物在80～85℃條件下干燥10～15h后，即得到肝素鈉粗品。進(jìn)一步的，還可以以本發(fā)明肝素鈉粗品為原料，并進(jìn)一步精制得到高純度的肝素鈉，從而進(jìn)一步提高產(chǎn)品的價(jià)值。實(shí)施例1新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢?，然后加鹽攪拌均勻，使得體系中鹽濃度達(dá)到0.68mol/l；將體系ph調(diào)節(jié)至8.7，溫度調(diào)整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.4g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例1的肝素鈉粗品。實(shí)施例2新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢?，然后加鹽攪拌均勻，使得體系中鹽濃度達(dá)到0.60mol/l；將體系ph調(diào)節(jié)至8.7，溫度調(diào)整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.4g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例2的肝素鈉粗品。實(shí)施例3新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢?，然后加鹽攪拌均勻，使得體系中鹽濃度達(dá)到0.70mol/l；將體系ph調(diào)節(jié)至8.7，溫度調(diào)整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.4g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例3的肝素鈉粗品。實(shí)施例4新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢?，然后加鹽攪拌均勻，使得體系中鹽濃度達(dá)到0.68mol/l；將體系ph調(diào)節(jié)至8.5，溫度調(diào)整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.4g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例4的肝素鈉粗品。實(shí)施例5新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢?，然后加鹽攪拌均勻，使得體系中鹽濃度達(dá)到0.68mol/l；將體系ph調(diào)節(jié)至9.0，溫度調(diào)整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.4g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例5的肝素鈉粗品。實(shí)施例6新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢?，然后加鹽攪拌均勻，使得體系中鹽濃度達(dá)到0.68mol/l；將體系ph調(diào)節(jié)至8.7，溫度調(diào)整至62℃，然后，按照2.5:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.5g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例6的肝素鈉粗品。實(shí)施例7新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁缓蠹欲}攪拌均勻，使得體系中鹽濃度達(dá)到0.68mol/l；將體系ph調(diào)節(jié)至8.7，溫度調(diào)整至62℃，然后，按照4:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.4g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例7的肝素鈉粗品。實(shí)施例8新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢瑁缓蠹欲}攪拌均勻，使得體系中鹽濃度達(dá)到0.68mol/l；將體系ph調(diào)節(jié)至8.7，溫度調(diào)整至62℃，然后，按照1:1的比例加入堿性蛋白酶以及胰蛋白酶，并使得體系中兩種酶的濃度達(dá)到0.4g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到實(shí)施例8的肝素鈉粗品。對(duì)比例1新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢?，然后加鹽攪拌均勻，使得體系中鹽濃度達(dá)到0.68mol/l；將體系ph調(diào)節(jié)至8.7，溫度調(diào)整至62℃，然后，加入堿性蛋白酶，并使得體系中的酶濃度達(dá)到0.4g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到對(duì)比例1的肝素鈉粗品。對(duì)比例2新鮮豬小腸經(jīng)刮腸機(jī)處理得到新鮮粘膜，將粘膜粉碎后加水?dāng)嚢?，然后加鹽攪拌均勻，使得體系中鹽濃度達(dá)到0.68mol/l；將體系ph調(diào)節(jié)至8.7，溫度調(diào)整至62℃，然后，加入胰蛋白酶，并使得體系中的酶濃度達(dá)到0.4g/l,并進(jìn)行酶解，酶解的時(shí)間控制在3h；將所得酶解液濃縮后過(guò)濾，然后向?yàn)V液中加入樹脂進(jìn)行吸附；將吸附后的樹脂以鹽水洗脫，然后將洗脫液以酒精沉淀，固液分離后，將固形物干燥得到對(duì)比例2的肝素鈉粗品。實(shí)驗(yàn)例1按照肝素鈉得率＝肝素鈉粗品質(zhì)量/新鮮粘膜質(zhì)量，分別計(jì)算各組實(shí)施例和對(duì)比例的肝素鈉得率，結(jié)果如下：實(shí)驗(yàn)組肝素鈉得率(×100％)實(shí)施例10.034實(shí)施例20.031實(shí)施例30.029實(shí)施例40.025實(shí)施例50.027實(shí)施例60.028實(shí)施例70.022實(shí)施例80.021對(duì)比例10.016對(duì)比例20.012由如上的對(duì)比數(shù)據(jù)可以看出，以復(fù)合酶進(jìn)行酶解能夠有效提高肝素鈉粗品的得率；同時(shí)，由各實(shí)施例組的得率數(shù)據(jù)對(duì)比也可以看出，酶解反應(yīng)條件對(duì)于肝素鈉粗品的得率也有著一定的影響。然后，分別對(duì)各組所制得的肝素鈉粗品進(jìn)行吸光度測(cè)試，結(jié)果顯示：實(shí)施例1的肝素鈉粗品的吸光度明顯低于對(duì)比例1、2的吸光度。由此可見，以復(fù)合酶進(jìn)行酶解所得肝素鈉粗品的純度要優(yōu)于采用單一酶進(jìn)行酶解的產(chǎn)物；同時(shí)，實(shí)施例2-8所得肝素鈉粗品的吸光度基本相當(dāng)，且稍高于實(shí)施例1產(chǎn)品。由此可見，相較于其他實(shí)驗(yàn)組而言，以實(shí)施例1條件進(jìn)行酶解所得肝素鈉的純度最高。盡管已用具體實(shí)施例來(lái)說(shuō)明和描述了本發(fā)明，然而應(yīng)意識(shí)到，在不背離本發(fā)明的精神和范圍的情況下可以作出許多其它的更改和修改。因此，這意味著在所附權(quán)利要求中包括屬于本發(fā)明范圍內(nèi)的所有這些變化和修改。當(dāng)前第1頁(yè)12