本發(fā)明屬于微生物檢測領域，具體涉及一種選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌(包括可培養(yǎng)狀態(tài)和非可培養(yǎng)狀態(tài))的方法。

背景技術：

副溶血性弧菌為革蘭氏陰性菌，具有嗜鹽、耐熱特征，主要存在于海洋、河口環(huán)境及魚、蝦、貝等生物體中，是沿海地區(qū)主要食源性病原菌之一。從人類健康安全的角度出發(fā)，對水產(chǎn)品污染的可能性進行準確判斷異常重要。到目前為止，多種分析檢測方法得到了研究與應用，比如傳統(tǒng)的培養(yǎng)法、免疫法，以及基于遺傳物質(zhì)信息的分子生物學方法——生物傳感器法、聚合酶鏈式反應(pcr)法、環(huán)介導等溫基因擴增法等，近年來都得到了迅猛的發(fā)展。特別是基于環(huán)介導等溫基因擴增的各種方法(yamazakiw,yukok,ryokou,etal.evaluationofaloop-mediatedisothermalamplificationassayforrapidandsimpledetectionofvibrioparahaemolyticusinnaturallycontaminatedseafoodsamples.foodmicrobiology,2011,28,1238；zengj,weih,zhangl,etal.rapiddetectionofvibrioparahaemolyticusinrawoystersusingimmunomagneticseparationcombinedwithloop-mediatedisothermalamplification.internationaljournaloffoodmicrobiology,2014,174,123；wangy,lidx,wangy,etal.rapidandsensitivedetectionofvibrioparahaemolyticusandvibriovulnificusbymultipleendonucleaserestrictionreal-timeloop-mediatedisothermalamplificationtechnique.molecules,2016,21,111；wangr,xiaoxn,cheny,etal.aloop-mediated,isothermalamplification-basedmethodforvisualdetectionofvibrioparahaemolyticuswithinonly1h,fromshrimpsamplingtoresults.analyticalmethods,2017,9,1695)，較之于pcr法具有更高的靈敏度(最低可以檢測出1個拷貝的基因)和特異性，而且生化反應對模板溶液中的血漿、細胞殘渣等干擾物質(zhì)耐受能力強(zhangx,lowesb,goodingjj.briefreviewofmonitoringmethodsforloop-mediatedisothermalamplification(lamp).biosensor&bioelectronics,2014,61,491)，是近期研究熱點之一。然而，大多基于環(huán)介導等溫基因擴增的檢測方法，只能用于診斷被檢測樣品中是否存在目標微生物標識基因，不能有效確定該基因是否來自于活性(包括可培養(yǎng)狀態(tài)和非可培養(yǎng)狀態(tài))副溶血性弧菌。

近來，已有文獻報道采用疊氮溴化丙錠和環(huán)介導等溫基因擴增法相結合選擇性檢測活的微生物(chens，wangf，beaulieujc，etal.rapiddetectionofviablesalmonellaeinproducebycouplingpropidiummonoazidewithloop-mediatedisothermalamplification.applied&environmentalmicrobiology,2011,77,4008；ahmadf,stedtfeldrd,waseemh,etal.mostprobablenumber-loopmediatedisothermalamplification(mpn-lamp)forquantifyingwaterbornepathogensin<25min.journalofmicrobiologicalmethods,2017,132,27)，但過程中需要特定的連續(xù)光譜光源照射處理，操作繁瑣；而且疊氮溴化丙錠價格昂貴。

技術實現(xiàn)要素：

本發(fā)明要解決的技術問題在于提供一種選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌(包括可培養(yǎng)狀態(tài)和非可培養(yǎng)狀態(tài))的方法，所述方法工作原理為：自然光條件下，疊氮化鈉上的疊氮基團生成高反應性的氮賓基，遇到雙鏈dna時，極易與碳氫化合物部分結合生成穩(wěn)定牢固的共價氮碳鍵，從而形成穩(wěn)定的dna修飾，使dna失去擴增性能。此外，由于疊氮化鈉完全不能通透細胞膜，它只能選擇性的修飾死細胞“暴露”的dna(包括胞外dna)。因此，采用疊氮化鈉處理可以選擇性保留活的副溶血性弧菌(包括可培養(yǎng)狀態(tài)和非可培養(yǎng)狀態(tài))中的dna，然后通過環(huán)介導等溫基因擴增，即可選擇性檢測出活的副溶血性弧菌。

本發(fā)明是通過以下步驟來實現(xiàn)：

一種選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌的方法，步驟包括膜過濾采集總菌、疊氮化鈉處理采集到的總菌和環(huán)介導等溫基因擴增測定；所述活的副溶血性弧菌包括可培養(yǎng)狀態(tài)和非可培養(yǎng)狀態(tài)。

進一步，所述的膜過濾采集總菌的步驟，指原位收集待測定海水；采用孔徑為0.45μm的水系微孔濾膜過濾采集海水中總菌。

進一步，所述的疊氮化鈉處理采集到的總菌的步驟，指首先采用細胞釋放溶液將微孔濾膜上的總菌洗脫到容器里，加入疊氮化鈉溶液，自然光條件下反應20min，獲得總菌懸浮液。

進一步，所述的環(huán)介導等溫基因擴增測定的步驟，指以疊氮化鈉處理過的總菌懸浮液為生化擴增反應模板，然后加入包括引物、酶在內(nèi)的擴增反應試劑和指示劑，封閉反應管，放入61-65℃下反應；同時做陽性和陰性對照，指示劑顏色變化指示環(huán)介導等溫基因擴增結果。

進一步，所述的指示劑為genefinder核酸染料；

進一步，所述的各步驟，均采用無菌的潔凈器具。

本發(fā)明還提供具體的一種選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌的方法，步驟如下：

1)清洗、滅菌所有需要的器具，使用前密封保存；

2)用60ml一次性無菌注射器抽取海水樣品50ml，然后裝上直徑13mm、孔徑0.45μm水系微孔濾器，緩慢推出海水；

3)從濾器中取出濾膜放入5ml離心管，加入1ml細胞釋放溶液，手動震蕩1min，將濾膜上所得總菌洗脫到離心管內(nèi)溶液中；

4)向上述離心管溶液中加入10μl10mmol/l疊氮化鈉，搖勻，自然光下反應20min，獲得總菌懸浮液；

5)向0.2ml薄壁pcr管中加入環(huán)介導等溫基因擴增試劑，制得生化反應混合液；25μl的反應體系包括各1.6μmol/l的引物fip和bip，各0.8μmol/l的引物lf和lb，各0.2μmol/l的引物f3和b3，1.4mmol/l的dntps，6.0mmol/l的mgso4和1×緩沖液；其中引物針對副溶血性弧菌的tlh基因，序列分別為(5’-3’)：

f3：agctactcgaaagatgatcc；

b3：ggttgtatgagaagcgattg；

fip：atgtttttaaatgaaacggagctccggcaaaaaacgaagatggt；

bip：acgtcgcaaaacgttatccggcgaagaacgtaatgtctg；

lf：accagtagccgtcaatg；

lb：ttagatttggcgaacgaga；

6)取5μl總菌懸浮液加入上述生化反應混合液中，不蓋pcr管蓋子，輕微振動混勻；隨后將反應管放入高于95℃的水中10min，取出后冷卻至室溫；

7)向pcr管內(nèi)溶液中加入1μlbst2.0dna聚合酶，不蓋pcr管蓋子，輕微振動混勻；

8)向pcr管蓋子內(nèi)部均勻涂上1μlgenefinder核酸染料，然后蓋上蓋子，并將pcr管置于64℃水浴中反應60min；

9)取出pcr管，上下顛倒幾次或者劇烈震蕩，使genefinder核酸染料混入環(huán)介導等溫基因擴增生化反應液；

10)結果判斷：自然光條件下，pcr管中反應后混合液如果顯示橙色，表明待測海水中不含副溶血性弧菌；顯示綠色，表明待測海水中含有活的副溶血性弧菌。

本發(fā)明與現(xiàn)有技術對比的有益效果：

(1)本發(fā)明采用價格低廉、易于獲得的疊氮化鈉預處理死菌中的dna和胞外dna，使它們失去擴增活性，進而通過基因擴增實現(xiàn)選擇性檢測活的副溶血性弧菌。

(2)操作過程中無需特定光源設備和其它貴重儀器，操作簡易，成本低。

具體實施方式

下面通過實施例對本發(fā)明的內(nèi)容作進一步的解釋，并通過與傳統(tǒng)方法對比詮釋本發(fā)明的優(yōu)點。但本發(fā)明的保護范圍不受實施例任何形式上的限制。

實施例1選擇性檢測浴場海水中活的副溶血性弧菌

步驟一、清洗、滅菌所有需要的器具，使用前密封保存。

步驟二、用60ml一次性無菌注射器抽取海水樣品50ml，然后裝上直徑13mm的水系微孔濾器(天津津騰，孔徑0.45μm)，緩慢推出海水。

步驟三、從濾器中取出濾膜放入5ml離心管，加入1ml細胞釋放溶液(深圳市安必勝科技有限公司產(chǎn)品)，手動震蕩1min，將濾膜上所得總菌洗脫到離心管內(nèi)溶液中。

步驟四、向上述離心管溶液中加入10μl疊氮化鈉(10mmol/l)，搖勻，自然光下反應20min，獲得總菌懸浮液。

步驟五、向0.2ml薄壁pcr管中加入環(huán)介導等溫基因擴增試劑，制得生化反應混合液。25μl的反應體系包括各1.6μmol/l的引物fip和bip，各0.8μmol/l的引物lf和lb，各0.2μmol/l的引物f3和b3，1.4mmol/l的dntps，6.0mmol/l的mgso4和1×緩沖液。其中引物針對副溶血性弧菌的tlh基因，序列分別為(5’-3’)：

f3：agctactcgaaagatgatcc；

b3：ggttgtatgagaagcgattg；

fip：atgtttttaaatgaaacggagctccggcaaaaaacgaagatggt；

bip：acgtcgcaaaacgttatccggcgaagaacgtaatgtctg；

lf：accagtagccgtcaatg；

lb：ttagatttggcgaacgaga。

步驟六、取5μl總菌懸浮液加入上述生化反應混合液中，不蓋pcr管蓋子，輕微振動混勻。隨后將反應管放入高于95℃的水中10min。取出后冷卻至室溫。

步驟七、向pcr管內(nèi)溶液中加入1μlbst2.0dna聚合酶(美國neb公司產(chǎn)品)，不蓋pcr管蓋子，輕微振動混勻。

步驟八、向pcr管蓋子內(nèi)部均勻涂上1μlgenefinder核酸染料(廈門百維信公司產(chǎn)品)，然后蓋上蓋子，并將pcr管置于64℃水浴中反應60min。

步驟九、取出pcr管，上下顛倒幾次或者劇烈震蕩，使genefinder核酸染料混入環(huán)介導等溫基因擴增生化反應液。

步驟十、結果判斷：自然光條件下，pcr管中反應后混合液如果顯示橙色，表明待測海水中不含副溶血性弧菌；顯示綠色，表明待測海水中含有活的(包括可培養(yǎng)狀態(tài)和非可培養(yǎng)狀態(tài))副溶血性弧菌。

注：實驗需同時做陽性對照和陰性對照至少各2個用來確保反應系統(tǒng)正常。

實施例2

現(xiàn)有技術中，與實施例1的區(qū)別僅是在步驟四向所述離心管溶液中加入同摩爾量疊氮溴化丙錠(該試劑價格是疊氮化鈉的20余倍)，然后放入配備有連續(xù)光譜光源或者led(波長范圍465-475nm)光源的專用設備(例如pma-lite^tmledphotolysisdevice)中照射處理20min。比較可知，本發(fā)明具有成本低廉、操作簡便和無需特殊專用器材三個明顯優(yōu)勢。

sequencelisting

<110>中國水產(chǎn)科學研究院黃海水產(chǎn)研究所

<120>一種選擇性檢測海水中活的副溶血性弧菌的方法

<130>無

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