本發(fā)明涉及一種腫瘤特異性環(huán)狀rna的篩選方法，尤其涉及一種三陰性乳腺癌特異性環(huán)狀rna的篩選方法。

背景技術(shù)：

環(huán)狀rna(circularrna,環(huán)狀)是一類不同于線性rna的內(nèi)源非編碼rna，它是通過反向剪接形成的閉合環(huán)狀rna分子，屬于非編碼rna家族成員。其以保守、穩(wěn)定、特異、高含量為特點，可作為microrna海綿調(diào)控靶mirna的活性，并參與基因轉(zhuǎn)錄和蛋白生成的調(diào)控，逐漸成為非編碼rna調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的新星。隨著rna研究技術(shù)的進一步進步，研究者們發(fā)現(xiàn)環(huán)狀rna在心血管系統(tǒng)疾病、神經(jīng)系統(tǒng)疾病、朊蛋白疾病等多種疾病的發(fā)生發(fā)展中發(fā)揮重要作用，并且在腫瘤診斷、治療和預(yù)后等方面具有巨大的潛能，有望成為新的腫瘤生物標志物或分子靶向治療靶點。

三陰乳腺癌(triple‐negativebreastcancer,tnbc)是指雌激素受體(estrogenreceptor，er)、孕激素受體(progesteronereceptor，pr)及人類上皮細胞生長因子受體2(humanepidermalgrowthfactorreceptor2，her2)均無表達的一類乳腺癌，具有發(fā)病低齡化、惡性程度高，侵襲性強，僅有部分對放化療敏感，治療棘手及易復(fù)發(fā)的特征，在治療后1～3年內(nèi)為復(fù)發(fā)高峰期，大多數(shù)患者死于治療的最初5年，是目前乳腺癌治療最棘手的亞型之一。

那么，環(huán)狀rna是否能夠成為診斷治療三陰性乳腺癌的切入點呢？現(xiàn)有技術(shù)中，關(guān)于三陰性乳腺癌特異性環(huán)狀rna的研究還處于一片空白。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

針對現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述不足，本發(fā)明提供了一種三陰性乳腺癌特異性環(huán)狀rna的篩選方法，該方法以乳腺癌特有的70個環(huán)狀rna為引物，通過比較三陰性乳腺癌血漿標本及正常對照組的環(huán)狀基因表達，篩選出4個對三陰性乳腺癌具有特異性顯著表達的環(huán)狀rna。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明采用了如下技術(shù)方案：

三陰性乳腺癌特異性環(huán)狀rna的篩選方法，該方法包括如下步驟：

(1)選取多個三陰性乳腺癌女性患者血漿作為實驗組a；選取與實驗組a數(shù)量相等的正常女性血漿作為對照組b；

(2)分別對實驗組和對照組血漿進行處理提取rna，并對提取的rna進行質(zhì)量檢測；

(3)分別對提取的rna進行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna；

(4)以乳腺癌特有的70個環(huán)狀rna為引物分別對合成的cdna進行qpcr實驗；

(5)對比三陰性乳腺癌血漿標本及正常對照組的環(huán)狀基因表達篩選出三陰性乳腺癌特異性環(huán)狀rna。

作為本發(fā)明的一種優(yōu)選方案，目標基因的表達采用2^‐△△ct法。

作為本發(fā)明的另一種優(yōu)選方案，步驟(2)中，rna的提取包括如下步驟：

a.ep管中分別加入血漿，0.04倍蛋白酶k，于55～60℃水浴保溫5～15分鐘；

b.加入3倍magzollsreagent，震蕩混勻后室溫放置5～10分鐘；

c.加入0.02倍冰醋酸和0.8倍氯仿，用手劇烈震蕩10～30秒后室溫放置2～3分鐘；

d.4℃下，12,000xg離心10～20分鐘后；

e.小心轉(zhuǎn)移上清液至新的ep管中，加入1～2倍無水乙醇渦旋混勻10～30秒；

f.收集管中加入hipurernamicrocolumn，轉(zhuǎn)移混合液至柱子中，8,000xg離心20～40秒；

g.倒棄濾液把柱子裝回收集管中，加入2.4倍bufferrw2(已用乙醇稀釋)至柱子中，8,000xg離心20～40秒；

h.倒棄濾液把柱子裝回收集管中，加入2.4倍bufferrw2(已用乙醇稀釋)至柱子中，8,000xg離心20～40秒；

i.倒棄濾液把柱子裝回收集管中，13,000xg離心空柱2～4分鐘甩干柱子的基質(zhì)；

j.將柱子轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入0.06‐0.12倍depc水至柱子的膜中央，室溫靜置1～5分鐘，13,000xg離心1～2分鐘；

k.丟棄rna柱子，把rna樣品保存‐80℃；

l.取1μlrna樣品在核酸蛋白檢測儀上測定od值，記錄a260/280比值和rna濃度。

作為本發(fā)明的又一種優(yōu)選方案，步驟(3)中rna逆轉(zhuǎn)錄合成cdna的步驟如下：

a.按下表配制第一鏈cdna合成反應(yīng)液：

b.用移液器輕輕吹打混勻反應(yīng)液后25℃保溫10分鐘；

c.42℃孵育15分鐘；

d.85℃孵育5分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

作為本發(fā)明的一種改進方案，步驟(4)中qpcr實驗步驟如下：

a.樣品配制：先準備好乳腺癌環(huán)狀rnaqpcr芯片，將步驟(3)合成的cdna按照1：20稀釋后，加入2.5μl作為模板。其中芯片的基因列表涵蓋70個乳腺癌特有的環(huán)狀rna、6個內(nèi)參基因及6個對照(rtc、ppc)，其具體情況如下：

芯片上的qpcr反應(yīng)體系如下：

b.qpcr反應(yīng)程序設(shè)置如下：

與現(xiàn)有技術(shù)相比，本發(fā)明具有如下優(yōu)點：

1、以乳腺癌特有的70個環(huán)狀rna為引物，通過比較三陰性乳腺癌血漿標本及正常對照組的環(huán)狀基因表達，篩選出對三陰性乳腺癌具有特異性顯著表達的環(huán)狀rna，其結(jié)果對于三陰性乳腺癌的診斷治療具有重要的意義。

附圖說明

圖1為實驗組1擴增曲線圖；

圖2為實驗組1溶解曲線圖；

圖3為實驗組2擴增曲線圖；

圖4為實驗組2溶解曲線圖；

圖5為對照組1擴增曲線圖；

圖6為對照組1溶解曲線圖；

圖7為對照組2擴增曲線圖；

圖8為對照組2溶解曲線圖；

圖9為差異表達的乳腺癌環(huán)狀rna表達熱圖；

圖10為hsa_circ_002024差異表達柱狀圖；

圖11為hsa_circ_000016差異表達柱狀圖；

圖12為hsa_circ_000178差異表達柱狀圖；

圖13為hsa_circ_000436差異表達柱狀圖；

圖14為hsa_circ_000444差異表達柱狀圖；

圖15為hsa_circ_000535差異表達柱狀圖；

圖16為hsa_circ_000566差異表達柱狀圖；

圖17為hsa_circ_000595差異表達柱狀圖；

圖18為hsa_circ_000601差異表達柱狀圖；

圖19為hsa_circ_000611差異表達柱狀圖；

圖20為hsa_circ_000747差異表達柱狀圖；

圖21為hsa_circ_000763差異表達柱狀圖；

圖22為hsa_circ_000773差異表達柱狀圖；

圖23為hsa_circ_000782差異表達柱狀圖；

圖24為hsa_circ_000789差異表達柱狀圖；

圖25為hsa_circ_000791差異表達柱狀圖；

圖26為hsa_circ_000807差異表達柱狀圖；

圖27為hsa_circ_000808差異表達柱狀圖；

圖28為hsa_circ_000826差異表達柱狀圖；

圖29為hsa_circ_000857差異表達柱狀圖；

圖30為hsa_circ_000873差異表達柱狀圖；

圖31為hsa_circ_000904差異表達柱狀圖；

圖32為hsa_circ_000919差異表達柱狀圖；

圖33為hsa_circ_000989差異表達柱狀圖；

圖34為hsa_circ_001066差異表達柱狀圖；

圖35為hsa_circ_001068差異表達柱狀圖；

圖36為hsa_circ_001069差異表達柱狀圖；

圖37為hsa_circ_001083差異表達柱狀圖；

圖38為hsa_circ_001084差異表達柱狀圖；

圖39為hsa_circ_001101差異表達柱狀圖；

圖40為hsa_circ_001107差異表達柱狀圖；

圖41為hsa_circ_001109差異表達柱狀圖；

圖42為hsa_circ_001118差異表達柱狀圖；

圖43為hsa_circ_001198差異表達柱狀圖；

圖44為hsa_circ_001298差異表達柱狀圖；

圖45為hsa_circ_001349差異表達柱狀圖；

圖46為hsa_circ_001422差異表達柱狀圖；

圖47為hsa_circ_001454差異表達柱狀圖；

圖48為hsa_circ_001460差異表達柱狀圖；

圖49為hsa_circ_001482差異表達柱狀圖；

圖50為hsa_circ_001552差異表達柱狀圖；

圖51為hsa_circ_001555差異表達柱狀圖；

圖52為hsa_circ_001736差異表達柱狀圖；

圖53為hsa_circ_001747差異表達柱狀圖；

圖54為hsa_circ_001756差異表達柱狀圖；

圖55為hsa_circ_001757差異表達柱狀圖；

圖56為hsa_circ_001803差異表達柱狀圖；

圖57為hsa_circ_001828差異表達柱狀圖；

圖58為hsa_circ_001833差異表達柱狀圖；

圖59為hsa_circ_001835差異表達柱狀圖；

圖60為hsa_circ_001936差異表達柱狀圖；

圖61為hsa_circ_001860差異表達柱狀圖；

圖62為hsa_circ_001934差異表達柱狀圖；

圖63為hsa_circ_001936差異表達柱狀圖；

圖64為hsa_circ_002040差異表達柱狀圖；

圖65為hsa_circ_002088差異表達柱狀圖；

圖66為hsa_circ_002146差異表達柱狀圖；

圖67為hsa_circ_002162差異表達柱狀圖；

圖68為hsa_circ_002176差異表達柱狀圖；

圖69為hsa_circ_001736差異表達散點圖；

圖70為hsa_circ_001747差異表達散點圖；

圖71為hsa_circ_001803差異表達散點圖；

圖72為hsa_circ_002176差異表達散點圖。

具體實施方式

下面結(jié)合附圖和具體實施方式對本發(fā)明作進一步詳細地描述。

三陰性乳腺癌特異性環(huán)狀rna的篩選方法，該方法包括如下5個步驟：

(1)選取多個三陰性乳腺癌女性患者血清作為實驗組a；選取與實驗組a數(shù)量相等的正常女性血清作為對照組b。本實施例中，分析了15例三陰性乳腺癌女性患者血清，并以15例正常女性血清為對照。附圖中選取部分實驗組和對照組中的溶解、擴增曲線圖，如圖1～8所示，圖1為實驗組1擴增曲線圖；圖2為實驗組1溶解曲線圖；圖3為實驗組2擴增曲線圖；圖4為實驗組2溶解曲線圖；圖5為對照組①擴增曲線圖；圖6為對照組①溶解曲線圖；圖7為對照組②擴增曲線圖；圖8為對照組②溶解曲線圖。

(2)分別對實驗組和對照組血漿進行處理提取rna，并對提取的rna進行質(zhì)量檢測，其具體操作如下：

a.ep管中移入250μl血漿，10μl蛋白酶k，于57℃水浴保溫10分鐘；

b.加入0.75mlmagzollsreagent，震蕩混勻后室溫放置5～10分鐘；

c.加入5μl冰醋酸和200ml氯仿，用手劇烈震蕩15秒后室溫放置2～3分鐘；

d.4℃下，12,000xg離心15分鐘后；

e.小心轉(zhuǎn)移上清液至新的ep管中，加入1.5倍無水乙醇渦旋混勻10～30秒；

f.收集管中加入hipurernamicrocolumn，轉(zhuǎn)移混合液至柱子中，8,000xg離心30秒；

g.倒棄濾液把柱子裝回收集管中，加入600μlbufferrw2(已用乙醇稀釋)至柱子中，8,000xg離心30秒；

h.倒棄濾液把柱子裝回收集管中，加入600μlbufferrw2(已用乙醇稀釋)至柱子中，8,000xg離心20～40秒；

i.倒棄濾液把柱子裝回收集管中，13,000xg離心空柱3分鐘甩干柱子的基質(zhì)；

j.將柱子轉(zhuǎn)移至1.5ml離心管中，加入15‐30μldepc水至柱子的膜中央，室溫靜置2分鐘，13,000xg離心1分鐘；

k.丟棄rna柱子，把rna樣品保存‐80℃；

l.取1μlrna樣品在核酸蛋白檢測儀上測定od值，記錄a260/280比值和rna濃度，檢測結(jié)果顯示a260/a280比值在1.8～2.0之間，即表明提取的rna具有高的純度，具體檢測結(jié)果如下：

(3)分別對提取的rna進行逆轉(zhuǎn)錄合成cdna，逆轉(zhuǎn)錄合成cdna的具體操作如下：

a.按下表配制第一鏈cdna合成反應(yīng)液：

b.用移液器輕輕吹打混勻反應(yīng)液后25℃保溫10分鐘；

c.42℃孵育15分鐘；

d.85℃孵育5分鐘滅活逆轉(zhuǎn)錄酶。

(4)以乳腺癌特有的70個環(huán)狀rna為引物分別對合成的cdna進行qpcr實驗，其實驗步驟如下：

a.樣品配制：先準備好乳腺癌環(huán)狀rnaqpcr芯片，將步驟(3)合成的cdna按照1：20稀釋后，加入2.5μl作為模板。其中乳腺癌環(huán)狀rnaqpcr芯片的基因列表涵蓋70個乳腺癌特有的環(huán)狀rna、6個內(nèi)參基因及6個對照(rtc、ppc)，附圖中選取部分差異表達柱狀圖，如圖10‐68所示(注：1、柱狀圖中，值越大表示表達量越低，反映出表達量高低。2、空白柱子表示該樣品檢測目的基因無表達。)，其具體情況如下：

芯片上的qpcr反應(yīng)體系如下：

b.qpcr反應(yīng)程序設(shè)置如下：

(5)對比三陰性乳腺癌血漿標本及正常對照組的環(huán)狀基因表達篩選出三陰性乳腺癌特異性環(huán)狀rna。其中目標基因表達情況采用的方法為2^‐△△ct法，即設(shè)定cta1為1號樣本目標基因ct值，ctb1為1號樣本內(nèi)參基因ct值；cta2為2號樣本目標基因ct值，ctb2為2號樣本內(nèi)參基因ct值，則1號樣本和2號樣本目標基因表達水平比值可粗略計算為2^‐△△ct，即2號樣本內(nèi)目標基因的表達水平為1號樣本內(nèi)的2^‐x倍，其中△△ct＝(cta2‐ctb2)‐(cta1‐ctb1)＝x。

對實驗結(jié)果分析發(fā)現(xiàn)實驗組中有4個環(huán)狀rna與對照組有差異性表達(p<0.05)，如圖69‐圖72所示，其分別為has‐circ‐001736、has‐circ‐001747、has‐circ‐001803、has‐circ‐002176。即說明has‐circ‐001736、has‐circ‐001747、has‐circ‐001803、has‐circ‐002176為三陰性乳腺癌特異性環(huán)狀rna。

本發(fā)明以乳腺癌中特有的70個環(huán)狀rna為引物，分別對30例人血漿樣本進qpcr分析，篩選出4個三陰性乳腺癌特異性環(huán)狀rna，為三陰性乳腺癌的診斷和治療提供方向。

最后說明的是，以上實施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案而非限制，盡管參照較佳實施例對本發(fā)明進行了詳細說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當理解，可以對本發(fā)明的技術(shù)方案進行修改或者等同替換，而不脫離本發(fā)明技術(shù)方案的宗旨和范圍，其均應(yīng)涵蓋在本發(fā)明的權(quán)利要求范圍當中。