本發(fā)明涉及酵母菌dd12-7菌株及其應(yīng)用。
背景技術(shù)：
：1963年，bevan和makower首次在保存的釀酒酵母菌（saccharomycescerevisiae）中發(fā)現(xiàn)酵母菌株間存在著相互殺死的現(xiàn)象，進(jìn)而發(fā)現(xiàn)一種具有嗜殺活性的酵母菌，它分泌的外毒素能抑制或殺死野生酵母菌。嗜殺酵母分泌的嗜殺毒素稱(chēng)為嗜殺因子，能夠殺死敏感酵母菌株，但對(duì)嗜殺酵母本身卻沒(méi)有嗜殺作用，也就是說(shuō)具有免疫性。從已純化和表征的嗜殺毒素來(lái)看，嗜殺酵母所產(chǎn)的嗜殺毒素多為蛋白質(zhì)或糖蛋白，在生物學(xué)特性上不耐熱、對(duì)蛋白酶敏感。嗜殺酵母分泌的嗜殺因子可作為抑制某些病原酵母及類(lèi)酵母的抗真菌藥制劑。白色假絲酵母又稱(chēng)白色念珠菌（candidaalbicans），是一種真菌，通常存在于正常人口腔，上呼吸道，腸道及陰道，一般在正常機(jī)體中數(shù)量少，不引起疾病，當(dāng)機(jī)體免疫功能或一般防御力下降或正常菌群相互制約作用失調(diào)，則本菌大量繁殖并改變生長(zhǎng)形式（芽生菌絲相）侵入細(xì)胞引起疾病。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的目的之一是提供酵母菌dd12-7菌株。本發(fā)明目的之二涉及上述酵母菌株的應(yīng)用。具體地，涉及應(yīng)用該酵母菌株生產(chǎn)抗白色假絲酵母（candidaalbicans）的嗜殺因子的方法。本發(fā)明提供酵母菌株，為擬威爾酵母(williopsissp.)dd12-7，其保藏號(hào)為cgmccno.9833，具有分泌抗白色假絲酵母的嗜殺因子能力。該酵母菌來(lái)源于海洋，分離純化自遼寧丹東鴨綠江入?？诔练e物。應(yīng)用上述酵母菌株生產(chǎn)抗白色假絲酵母（candidaalbicans）的嗜殺因子的方法，在培養(yǎng)基中培養(yǎng)williopsissp.dd12-7使細(xì)菌分泌抗白色假絲酵母嗜殺因子，以在細(xì)菌和培養(yǎng)基中聚集了抗白色假絲酵母嗜殺因子后，從培養(yǎng)基和細(xì)菌內(nèi)回收并提純。所述培養(yǎng)基為ypd培養(yǎng)基，其中包含葡萄糖1.5~3%、蛋白胨1.5~3%和酵母粉0.5~2%。所述培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)，在20~30℃和ph4.5~5.0下進(jìn)行，轉(zhuǎn)速100~150rpm，發(fā)酵時(shí)間60~80h。本發(fā)明的優(yōu)點(diǎn)是：從海洋環(huán)境中分離出產(chǎn)嗜殺因子的williopsissp.dd12-7菌株，其所產(chǎn)嗜殺因子能夠殺滅致病菌白色假絲酵母。該菌株dd12-7具有營(yíng)養(yǎng)要求簡(jiǎn)單，發(fā)酵周期短的特點(diǎn)，因此用該菌株生產(chǎn)抗白色假絲酵母的嗜殺因子具有很高的成本優(yōu)勢(shì)和良好的應(yīng)用前景。本發(fā)明所述酵母菌在中國(guó)微生物菌種保藏管理委員會(huì)普通微生物中心的保藏號(hào)為：cgmccno.9833，保藏日期為：2014年10月19日，分類(lèi)命名為：擬威爾酵母williopsissp.。附圖說(shuō)明圖1嗜殺酵母初篩結(jié)果。圖2嗜殺因子粗提液復(fù)篩結(jié)果。圖3純化嗜殺因子對(duì)敏感菌的作用。具體實(shí)施方式以下結(jié)合具體的實(shí)施例對(duì)本發(fā)明作進(jìn)一步的說(shuō)明，其中以下采用的原料或者試劑，如無(wú)特殊指明均為市售。實(shí)施例1ypd培養(yǎng)基：1l培養(yǎng)基中含有：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%，nacl2%和甘油15%，培養(yǎng)基用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制，調(diào)節(jié)ph值至4.5。檢測(cè)培養(yǎng)基：1.0%（w/v）酵母粉，2.0%（w/v）葡萄糖，2.0%（w/v）蛋白胨，2.5%-3.5%（w/v）瓊脂，1.5mg/100ml美藍(lán)，用0.05m的檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖液控制ph4.5，緩沖液用蒸餾水配制。1.采集樣品：采集遼寧丹東鴨綠江入海口處表層海水，加入液體ypd培養(yǎng)基中震蕩培養(yǎng)3天。將0.1ml該液體培養(yǎng)基涂布于固體ypd平板，培養(yǎng)3天后挑取單菌落進(jìn)行初篩。2.初篩：以白色假絲酵母（candidaalbicans）作為敏感菌，將細(xì)胞含量為107~108cells/ml的敏感菌用滅菌的棉簽沾取涂布于平板中，將1中挑取的酵母菌單菌落點(diǎn)到檢測(cè)培養(yǎng)基的平板上，培養(yǎng)3天后挑選出周?chē)型该魅Φ木?。初篩結(jié)果見(jiàn)圖1。3.復(fù)篩：通過(guò)比較嗜殺活力進(jìn)行復(fù)篩，得到具有高產(chǎn)嗜殺因子的一株酵母菌株。將初篩中具有抗白色假絲酵母的菌株進(jìn)一步在ypd平板中純化，后挑取單菌落于裝有50ml產(chǎn)嗜殺因子培養(yǎng)基的250ml三角瓶，在28℃，140rpm培養(yǎng)3天，發(fā)酵液經(jīng)5000×g離心5min得上清，在涂有敏感菌的檢測(cè)培養(yǎng)基上放上牛津杯，取250ul的發(fā)酵清夜加到牛津杯當(dāng)中，28℃培養(yǎng)3天。篩出具有高嗜殺活性的酵母菌株，如圖2所示，牛津杯周?chē)蟹浅Ｃ黠@的透明圈，表明發(fā)酵液中的嗜殺因子對(duì)檢測(cè)培養(yǎng)基平板上的白色假絲酵母具有很強(qiáng)的殺滅作用。4.菌株通過(guò)形態(tài)觀察和生理生化鑒定白色奶油樣菌落，細(xì)胞出芽生殖，有簡(jiǎn)單的假菌絲。生理生化特性如下：發(fā)酵實(shí)驗(yàn)：葡萄糖麥芽糖半乳糖蔗糖乳糖棉子糖蜜二糖+-++-++同化實(shí)驗(yàn)：葡萄糖麥芽糖半乳糖蔗糖乳糖棉子糖蜜二糖可溶性淀粉++++++++海藻糖纖維二糖d-果膠糖木糖l-果膠糖-+--+通過(guò)比較嗜殺活力進(jìn)行復(fù)篩，得到具有高產(chǎn)嗜殺因子的一株酵母菌株。該菌株通過(guò)形態(tài)觀察和生理生化鑒定為williopsissp.。菌株編號(hào)：dd12-7。生產(chǎn)嗜殺因子的液體培養(yǎng)基為ypd培養(yǎng)基，其組成為：1l培養(yǎng)基中含有：葡萄糖2%，蛋白胨2%，酵母粉1%，nacl2%和甘油15%，培養(yǎng)基用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制，調(diào)節(jié)ph值至4.5。實(shí)施例2嗜殺因子的生產(chǎn)在培養(yǎng)基中培養(yǎng)williopsissp.dd12-7使細(xì)菌分泌抗白色假絲酵母嗜殺因子，以在細(xì)菌和培養(yǎng)基中聚集了抗白色假絲酵母嗜殺因子后，將培養(yǎng)基離心收集上清液，即為嗜殺因子粗提液。培養(yǎng)基為產(chǎn)嗜殺因子培養(yǎng)基，其中包含葡萄糖2%、蛋白胨2%，酵母粉1%，nacl2%和甘油15%，培養(yǎng)基用檸檬酸-磷酸氫二鈉緩沖溶液配制，ph調(diào)為4.5。培養(yǎng)為振蕩培養(yǎng)，在28℃和ph4.5下進(jìn)行，轉(zhuǎn)速140rpm，發(fā)酵時(shí)間72h。提純工藝：取發(fā)酵液經(jīng)10kda的超濾膜濃縮，然后過(guò)deaesepharosefastflow離子交換柱進(jìn)行陰離子交換，所得收集液經(jīng)sephadexg50tm凝膠過(guò)濾，純的嗜殺因子。采用實(shí)施例1中第3步驟的方法，即在涂有敏感菌的檢測(cè)培養(yǎng)基上放上牛津杯，取250ul的純化的嗜殺因子加到牛津杯當(dāng)中，28℃培養(yǎng)3天，如圖3所示，純化的嗜殺因子對(duì)白色假絲酵母具有很強(qiáng)的殺滅作用，牛津杯周?chē)耐该魅Ψ浅Ｃ黠@。以上實(shí)施實(shí)例對(duì)本發(fā)明不同的實(shí)施過(guò)程進(jìn)行了詳細(xì)的闡述，但是本發(fā)明的實(shí)施方式并不僅限于此。所述
技術(shù)領(lǐng)域：
的普通技術(shù)人員依據(jù)本發(fā)明中公開(kāi)的內(nèi)容，均可實(shí)現(xiàn)本發(fā)明的目的。當(dāng)前第1頁(yè)12