本發(fā)明申請是基于申請日為2011年8月24日，申請?zhí)枮椤?01180051316.8”(國際申請?zhí)枮閜ct/ep2011/064585)、名稱為“熱穩(wěn)定性persephonella碳酸酐酶及其用途”的發(fā)明專利申請的分案申請。

提及序列表

本申請含有計算機可讀形式的序列表，通過提述并入本文。

發(fā)明領(lǐng)域

本發(fā)明涉及自persephonellamarina可獲得的碳酸酐酶在例如從煙道氣體、沼氣、天然氣(naturalgas)或環(huán)境空氣提取co2中的用途。本發(fā)明還涉及用于提取二氧化碳的生物反應(yīng)器和可用于此類提取工藝的組合物。

發(fā)明背景

二氧化碳(co2)排放是全球變暖現(xiàn)象的一個主要貢獻因素。co2是一種燃燒副產(chǎn)物，并且它產(chǎn)生操作的、經(jīng)濟的、和環(huán)境的問題。co2排放可以在排放到大氣中前通過捕獲co2氣體來控制。存在著幾種控制co2排放的化學(xué)辦法(a.kohl和r.nielsen,gaspurification,第5版,gulfprofessionalpublishing,houston,tx,1997)。然而，許多這些辦法具有缺點，如高能量消耗、緩慢的過程、和使用生態(tài)學(xué)可疑的或有毒的化合物。

使用碳酸酐酶以非常高的速率(周轉(zhuǎn)率(turnover)是每秒多至10⁵個co2分子)催化co2轉(zhuǎn)化為碳酸氫鹽的能力的基于酶的辦法克服了與co2捕獲有關(guān)的反應(yīng)速率和環(huán)境問題。使用碳酸酐酶從氣體，如燃燒氣體或呼吸氣體提取co2的技術(shù)方案已經(jīng)記載于wo2006/089423、us6,524,842、wo2004/007058、wo2004/028667、us2004/0029257、us7,132,090、wo2005/114417、us6,143,556、wo2004/104160、us2005/0214936、wo2008/095057。一般地，這些技術(shù)通過使可溶性或固定化的碳酸酐酶與co2接觸來運行，所述co2可以處于氣相或液相。在存在水的情況下，碳酸酐酶催化co2轉(zhuǎn)化成碳酸氫鹽離子，其可以根據(jù)介質(zhì)的ph而進一步質(zhì)子化或去質(zhì)子化為碳酸和/或碳酸鹽離子。離子可以用來促進利用碳酸氫鹽/碳酸鹽作為碳源的藻類或微生物的生長，誘導(dǎo)周圍介質(zhì)中的ph變化或供應(yīng)緩沖能力，提供碳酸氫鹽/碳酸鹽作為活性劑用于隨后的化學(xué)過程，或者作為鹽碳酸鹽沉淀，或者轉(zhuǎn)化回到純co2，然后其可以使用(例如在增強的油回收中、用于尿素的生產(chǎn)、用于食物和飲料加工、或者為溫室或養(yǎng)殖池供應(yīng)co2)、釋放(例如自容納式生命支持環(huán)境如潛水艇、航天器、或人工肺)、壓縮(例如用于經(jīng)由管道運輸)、或貯存(如在地質(zhì)學(xué)或深海構(gòu)造或含鹽含水層中)。

一般地，哺乳動物、植物和原核碳酸酐酶(α和β類ca)在生理學(xué)溫度(37℃)或更低的溫度發(fā)揮功能。然而，燃燒氣體或溶解它們的液體的溫度可以容易超過碳酸酐酶用于捕獲co2的最適溫度。使用基于酶的解決方案的缺點之一在于在使含有co2的氣體/具有碳酸酐酶的液體接觸前在co2提取過程中可能需要廣泛的冷卻，并且冷卻是一個能量消耗過程。因此，在要在工業(yè)相關(guān)條件下使用酶時需要更加熱穩(wěn)定的碳酸酐酶。

附圖簡述

圖1是中空纖維膜生物反應(yīng)器的示意圖。數(shù)字代表下列特征：1.二氧化碳(co2)罐；2.氮氣(n2)罐；3.質(zhì)量流控制器(massflowcontroller,mfc)；4.載體液體貯液器；5.液體泵；6.壓力表；7.中空纖維膜模塊；8.廢物；9.進料氣(feedgas)；10.洗滌氣(scrubbedgas)；11.質(zhì)量流表(mfm)；12.氣體取樣閥；13.氣相色譜儀；14.進料氣入；15.洗滌氣出；16.液體入；17.液體出。

圖2是用于從混合氣體提取co2的一般再循環(huán)吸收/解吸過程的示意圖。在一般的過程中，富含co2的進料氣(1)進入吸收模塊(2)，優(yōu)選氣體進入一端(例如，底部)，在那里它與co2貧乏的載體液體(3)接觸，所述載體液體(3)進入吸收模塊，優(yōu)選在與進料氣相反的末端(例如，頂部)進入。已經(jīng)除去co2的洗滌氣(4)離開吸收模塊。富含co2的載體液體(5)離開吸收模塊，并且(任選地)通過溫度調(diào)節(jié)器(例如，熱交換器)(6)，之后進入(優(yōu)選在一端(例如，頂部))解吸模塊(7)。對解吸模塊應(yīng)用的熱(8)(如由再沸器或直接蒸汽供應(yīng))或真空(9)，或這些的組合引起提取的co2從載體液體釋放，并離開(10)解吸模塊，(任選地)通過冷凝器(11)以除去載體液體蒸汽，之后壓縮和/或使用純化的co2氣體(12)。co2貧乏的載體液體離開解吸模塊，并且(任選地)通過溫度調(diào)節(jié)器(例如，熱交換器)，之后回到吸收模塊?？梢栽诠に囍械亩鄠€點處，如在指示的位置(13a和13b)處添加消耗的和/或輔助的載體液體組分?？梢栽诠に囍械亩鄠€點處，如在指示的位置(14)處自循環(huán)液體除去不溶性污染物。

圖3是克隆質(zhì)粒c6221的示意圖。該圖中的縮寫在下文描述?！癱a”是經(jīng)密碼子優(yōu)化的碳酸酐酶編碼基因?！皊p”是來自地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)的α-淀粉酶信號肽?！皌erm”是終止子序列?！癱am”是編碼氯霉素乙酰基轉(zhuǎn)移酶的基因?！皃el”是用于對宿主細胞基因組的同源重組的枯草芽孢桿菌(bacillussubtilis)果膠酸裂合酶基因基因座?！皀eo”是卡那霉素抗性基因。“amp”是β-內(nèi)酰胺酶基因。“cryiiia區(qū)”是包含cryiiia穩(wěn)定化元件的三重啟動子系統(tǒng)。

發(fā)明概述

本發(fā)明的一個方面是源自persephonella屬的細菌的或由persephonella屬的細菌可生成的碳酸酐酶用于自含有二氧化碳的介質(zhì)提取二氧化碳的用途。本發(fā)明中使用的碳酸酐酶在55℃以上，優(yōu)選60℃以上，優(yōu)選65℃以上，更優(yōu)選70℃、75℃、80℃、或85℃以上，甚至更優(yōu)選90℃以上，且最優(yōu)選高于100℃的溫度在1mnahco3緩沖液ph8.0中15分鐘，優(yōu)選2小時后維持至少30％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％殘余活性。熱穩(wěn)定性碳酸酐酶特別在能夠提取從燃燒、或從粗天然氣或合成氣或沼氣或環(huán)境空氣排放的co2的生物反應(yīng)器中使用，此時提取過程中的條件需要酶暴露于高溫。然而，酶也可以在不在高溫發(fā)生的工藝中采用，因為它們于較低的溫度，例如0℃、室溫(20至25℃)和37℃也維持活性。熱穩(wěn)定性在制造、使用期間，或者在閑置期(例如熱倉庫中貯存)期間將碳酸酐酶暴露于高溫環(huán)境(即，其中溫度可以超過45℃、50℃或甚至55℃)時也是有用的。使用期間的熱穩(wěn)定性可以包括如下的情況，其中碳酸酐酶在一個溫度(例如，45℃、50℃、55℃、60℃或65℃)實施有用的催化，然后，由于使用過程中的不同階段，暴露于更高的溫度(例如，70℃、75℃、80℃、85℃、90℃、95℃或100℃)，其中它也實施有用的催化，或者保持閑置，直至暴露于工藝的下一階段，如于更低的溫度，其中碳酸酐酶再次實施有用的催化。在這些情況中，碳酸酐酶可能必須經(jīng)受住在使用過程中重復(fù)暴露于較低和較高的溫度，因此需要熱穩(wěn)定性碳酸酐酶。

在又一個方面，本發(fā)明提供了一種組合物，其包含適于固定化的基質(zhì)和源自persephonella屬的細菌的或由persephonella屬的細菌可生成的碳酸酐酶。

在又一個方面，本發(fā)明提供了一種適于提取二氧化碳的生物反應(yīng)器。

具體地，本發(fā)明涉及如下各項：

1.可從屬于persephonella屬的菌株獲得的或可由屬于persephonella屬的菌株生成的碳酸酐酶用于從含有二氧化碳的介質(zhì)提取二氧化碳的用途。

2.依照項1的用途，其中所述碳酸酐酶可從選自下組的菌株獲得或可由選自下組的菌株生成：菌種persephonellamarina、persephonellahydrogeniphila或persephonellaguaymasensis中的一種。

3.依照項1或2的用途，其中所述碳酸酐酶可從如下菌株之一獲得或可由如下菌株之一生成：persephonellamarinadsm14350、persephonellahydrogeniphiladsm15103或persephonellaguaymasensisdsm14351。

4.依照項1至3中任一項的用途，其中所述碳酸酐酶是

a)源自persephonellamarinadsm14350的或可由persephonellamarinadsm14350生成的；或

b)具有與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251對應(yīng)的氨基酸序列的多肽；或

c)與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251至少60％相同的多肽；或

d)(a)、(b)或(c)中具有碳酸酐酶活性的片段；或

e)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列在中等嚴格性條件下與如下雜交：

i)編碼seqidno:2或seqidno:4的成熟多肽的多核苷酸序列；或

ii)seqidno:1或seqidno:3的多核苷酸序列；或

iii)(i)或(ii)中至少100個連續(xù)核苷酸的亞序列；或

iv)(i)或(ii)的互補鏈；或

f)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列由于遺傳密碼簡并性不與seqidno:1或seqidno:3的多核苷酸序列雜交，但其編碼具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽；或

g)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列與seqidno:1或seqidno:3至少60％相同。

5.依照前述項中任一項的用途，其中所述碳酸酐酶在80℃以上的溫度15分鐘后維持至少50％殘余活性。

6.依照前述項中任一項的用途，其中所述含有二氧化碳的介質(zhì)是氣體或多相混合物。

7.依照項6的用途，其中所述含有二氧化碳的氣體或多相混合物通過燃燒發(fā)出。

8.依照項6的用途，其中所述氣體是煙道氣體。

9.依照項6的用途，其中所述含有二氧化碳的氣體或多相混合物是粗天然氣或合成氣。

10.依照項6的用途，其中所述含有二氧化碳的氣體或多相混合物是沼氣。

11.依照項1至5中任一項的用途，其中所述含有二氧化碳的介質(zhì)是含有碳酸氫鹽的液體，而所述二氧化碳提取是碳酸氫鹽向二氧化碳的轉(zhuǎn)化。

12.依照項11的用途，其中所述含有二氧化碳的介質(zhì)進一步包含基于胺的化合物。

13.依照項12的用途，其中所述基于胺的化合物是tris或mdea。

14.依照項11至13中任一項的用途，其中所述含有二氧化碳的介質(zhì)進一步包含hpo4^2-，如k2hpo4或na2hpo4。

15.依照前述項中任一項的用途，其中在55℃-120℃的溫度實施所述二氧化碳提取。

16.一種用于提取二氧化碳的方法，包括用可從屬于persephonella屬的菌株獲得的或可由屬于persephonella屬的菌株生成的碳酸酐酶處理含有二氧化碳的介質(zhì)。

17.一種分離或合成的多核苷酸，其編碼具有碳酸酐酶活性的多肽，其中所述多核苷酸選自下組：

a)通過seqidno:1的密碼子優(yōu)化獲得的多核苷酸，其中經(jīng)密碼子優(yōu)化的多核苷酸的核苷酸序列與seqidno:1至少60％相同；或

b)具有與seqidno:3的核酸殘基88至653對應(yīng)的核苷酸序列的多核苷酸；或

c)與seqidno:3的核酸殘基88至653至少85％相同的多核苷酸；或

d)(a)或(b)中編碼具有碳酸酐酶活性的多肽的片段。

18.一種包含項17的多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述多核苷酸與指導(dǎo)所述多肽在表達宿主中生成的一個或多個控制序列可操作連接。

19.一種重組表達載體，其包含項18的核酸構(gòu)建體。

20.一種重組宿主細胞，其包含項18的核酸構(gòu)建體或項19的重組表達載體。

21.一種組合物，其包含賦形劑和選自下組的碳酸酐酶：

a)源自persephonellamarinadsm14350的或可由persephonellamarinadsm14350生成的多肽；或

b)具有與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251對應(yīng)的氨基酸序列的多肽；或

c)與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251至少60％相同的多肽；或

d)(a)、(b)或(c)中具有碳酸酐酶活性的片段；或

e)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列在中等嚴格性條件下與如下雜交：

i)編碼seqidno:2或seqidno:4的成熟多肽的多核苷酸序列；或

ii)seqidno:1或seqidno:3的多核苷酸序列；或

iii)(i)或(ii)中至少100個連續(xù)核苷酸的亞序列；或

iv)(i)或(ii)的互補鏈；或

f)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列由于遺傳密碼簡并性不與seqidno:1或seqidno:3的多核苷酸序列雜交，但其編碼具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽；或

g)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列與seqidno:1或seqidno:3至少60％相同。

22.依照項21的組合物，其中所述組合物包含適于固定化的基質(zhì)。

23.依照項22的組合物，其中所述基質(zhì)選自下組：珠、織物、纖維、中空纖維、膜、微粒、多孔表面、棒、和管。

24.一種用于提取二氧化碳的生物反應(yīng)器，其中所述反應(yīng)器包含可從如下菌株獲得的或可由如下菌株生成的碳酸酐酶：屬于persephonella屬的菌株，優(yōu)選選自由persephonellamarina、persephonellahydrogeniphila或persephonellaguaymasensis組成的菌種的組的菌株，甚至更優(yōu)選作為dsm14350、dsm15103或dsm14351保藏的菌株。

25.依照項24的生物反應(yīng)器，其中所述碳酸酐酶是

a)源自persephonellamarinadsm14350的或可由persephonellamarinadsm14350生成的；或

b)具有與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251對應(yīng)的氨基酸序列的多肽；或

c)與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251至少60％相同的多肽；或

d)(a)、(b)或(c)中具有碳酸酐酶活性的片段；或

e)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列在中等嚴格性條件下與如下雜交：

i)編碼seqidno:2或seqidno:4的成熟多肽的多核苷酸序列；或

ii)seqidno:1或seqidno:3的多核苷酸序列；或

iii)(i)或(ii)中至少100個連續(xù)核苷酸的亞序列；或

iv)(i)或(ii)的互補鏈；或

f)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列由于遺傳密碼簡并性不與seqidno:1或seqidno:3的多核苷酸序列雜交，但其編碼具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽；或

g)由核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列與seqidno:1或seqidno:3至少60％相同。

26.依照項24或25的反應(yīng)器，其中所述反應(yīng)器包含下列元件：

a)至少一個吸收模塊；

b)至少一個沉淀臺；

c)載體液體；和

d)用于使所述吸收模塊與所述沉淀臺連接，使得所述載體液體可以從所述吸收模塊通到所述沉淀臺的手段。

27.依照項24或25的反應(yīng)器，其中所述反應(yīng)器包含下列元件：

a)至少一個吸收模塊；

b)至少一個解吸模塊；

c)載體液體；和

d)用于連接所述吸收模塊和所述解吸模塊，使得所述載體液體可以從所述吸收模塊通到所述解吸模塊的手段。

28.依照項24、25或27中任一項的生物反應(yīng)器，其中所述碳酸酐酶包埋在所述吸收模塊中或在所述解吸模塊中或在這兩個模塊中，或包埋在所述沉淀臺中。

29.依照項24至28中任一項的生物反應(yīng)器，其中所述反應(yīng)器進一步包含基于碳酸氫鹽的載體液體。

30.依照項24至29中任一項的生物反應(yīng)器，其中所述反應(yīng)器進一步包含基于胺的載體液體。

31.依照項30的生物反應(yīng)器，其中所述基于胺的載體液體包括tris或mdea。

32.依照項29至31中任一項的生物反應(yīng)器，其中所述反應(yīng)器進一步包含hpo4^2-，如k2hpo4或na2hpo4。

發(fā)明詳述

本發(fā)明的一個方面關(guān)注從persephonella屬細菌菌株可獲得的或由persephonella屬細菌菌株可生成的碳酸酐酶用于自含有co2的介質(zhì)，如氣體、液體或多相混合物提取co2的用途。本發(fā)明在含有co2的介質(zhì)的溫度高于商業(yè)上可得到的碳酸酐酶，如自人或牛紅細胞分離的ca-i或ca-ii的最適溫度的情況中是特別有用的。

定義

術(shù)語“碳酸酐酶活性”或“ca活性”在本文中定義為催化二氧化碳和碳酸氫鹽之間轉(zhuǎn)化的ec4.2.1.1活性。出于本發(fā)明的目的，依照實施例4中所描述的規(guī)程測定ca活性。一個單位的ca活性根據(jù)wilbur[1u＝(1/tc)-(1/tu)x1000]定義，其中u是單位，而tc和tu分別代表催化和未催化反應(yīng)以秒計的時間(wilbur,1948,j.biol.chem.176:147-154)。若本發(fā)明的多肽具有由與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251對應(yīng)的氨基酸序列組成的多肽的ca活性的至少20％，優(yōu)選至少40％，甚至更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，且甚至最優(yōu)選至少100％，則認為它們具有ca活性。

術(shù)語“co2貧乏的”和“富含co2的”載體液體是本發(fā)明中用于描述在載體液體遍及整個工藝循環(huán)時其中存在的碳(例如，以溶解的co2、起化學(xué)反應(yīng)的co2、碳酸氫鹽、碳酸和/或鹽碳酸鹽形式)相對量的術(shù)語。如本文中使用的，術(shù)語“co2貧乏的載體液體”一般指進入吸收模塊的載體液體。術(shù)語“富含co2的載體液體”一般指進入解吸模塊的載體液體。應(yīng)當(dāng)理解，術(shù)語“co2貧乏的載體液體”也可以應(yīng)用于離開解吸模塊的載體液體，而術(shù)語“富含co2的載體液體”也可以應(yīng)用于離開吸收模塊的載體液體。與給定時間點時系統(tǒng)內(nèi)co2貧乏的載體液體相比，富含co2的載體液體含有更多碳。

術(shù)語“含有co2的介質(zhì)”用于描述含有至少0.001％co2，優(yōu)選至少0.01％，更優(yōu)選至少0.1％，更優(yōu)選至少1％，更優(yōu)選至少5％，最優(yōu)選10％，甚至更優(yōu)選至少20％，且甚至最優(yōu)選至少50％co2的任何材料。優(yōu)選含有co2的介質(zhì)具有任何壓力下5℃-110℃，更優(yōu)選10℃-100℃，更優(yōu)選20℃-95℃，更優(yōu)選30℃-90℃，更優(yōu)選40℃-85℃，更優(yōu)選50℃-80℃，更優(yōu)選55℃-75℃，且最優(yōu)選60℃-70℃的溫度。特別地，含有co2的介質(zhì)是氣相(包括氣體混合物)、液體或多相混合物，但是也可以是固體。例如，含有co2的氣相是自油井、氣井、和凝析井(condensatewell)可獲得的粗天然氣、通過將含碳燃料(例如，甲烷)氣化為包含co和h2的氣體產(chǎn)物生成的合成氣、或來自燃燒過程，例如來自基于碳的電力發(fā)電廠，或來自此類工廠、工業(yè)爐、爐、灶、或壁爐的煙道氣體煙囪/煙道(stack)或來自飛機或汽車排氣裝置的排放流?；蛘?，含有co2的氣相可以是環(huán)境空氣(包括熱(高于40℃)空氣，例如，沙漠空氣)，或者來自哺乳動物(如人工肺中含有co2的氣相)、活的植物和其它排放co2的物種中的呼吸過程，特別來自溫室。含有co2的氣相也可以是來自需氧或厭氧發(fā)酵，如釀造、生成有用產(chǎn)物如乙醇的發(fā)酵、或沼氣生成的廢氣(off-gas)。若此類發(fā)酵過程由嗜熱微生物促進(例如這在沼氣的生產(chǎn)中遇到)，則它們可以在高溫發(fā)生?；蛘?，含有co2的氣相可以是出于使用或貯存目的而富含co2的氣相。上文所描述的氣相也可以以多相混合物存在，其中氣體與某種程度的流體(例如，水或其它溶劑)和/或固體材料(例如，灰分或其它顆粒)共存。含有co2的液體是含有可測量量的co2，優(yōu)選在任何壓力下以上文提及的水平之一含有可測量量的co2的任何溶液或流體，特別是水性液體。可以通過將含有co2的氣體或固體(例如，干冰或含有可溶性碳酸鹽的鹽)通入液體中來獲得含有co2的液體。含有co2的流體也可以是壓縮的co2液體(其含有污染物，如干洗流體)、超臨界co2、或co2溶劑液體，如離子液體。含有co2的液體也可以稱為“載體液體”。含有co2的液體也可以包括能夠改善液體的含co2能力的化合物。如hco3^-(khco3或nahco3)、co3^2-(na2co3或k2co3)、hpo4^2-(k2hpo4或na2hpo4)或mdea或tris。

術(shù)語“co2提取”應(yīng)當(dāng)理解為從含有co2的介質(zhì)降低碳。此類提取可以從一種介質(zhì)至另一種，例如氣體至液體、液體至氣體、氣體至液體至氣體、液體至液體或液體至固體實施，但是提取液也可以是在同一介質(zhì)內(nèi)co2轉(zhuǎn)化成碳酸氫鹽、碳酸鹽或碳酸或者在同一介質(zhì)內(nèi)碳酸氫鹽轉(zhuǎn)化成co2。術(shù)語co2捕獲也用于指示co2從一種介質(zhì)到另一種的提取或者co2轉(zhuǎn)化成碳酸氫鹽/碳酸鹽或者碳酸氫鹽/碳酸鹽轉(zhuǎn)化成co2。

在本文中使用時，術(shù)語“編碼序列”意指直接規(guī)定產(chǎn)物多肽的氨基酸序列的多核苷酸序列。一般地，編碼序列的邊界由開讀框決定，所述開讀框通常以atg起始密碼子或者備選起始密碼子如gtg和ttg開始，并且以終止密碼子如taa、tag和tga結(jié)束。編碼序列可以是dna、cdna、mrna、合成或重組多核苷酸。

術(shù)語“多肽的功能性片段”或“具有碳酸酐酶活性的多肽片段”用于描述源自較長的多肽(親本多肽)，例如成熟多肽，而且已經(jīng)在n端區(qū)或c端區(qū)中或者在這兩個區(qū)中截短以生成親本多肽片段的多肽。為了成為功能性多肽，片段必須維持親本多肽的ca活性的至少20％，優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，更優(yōu)選至少70％，更優(yōu)選至少80％，甚至更優(yōu)選至少90％，最優(yōu)選至少95％，且甚至最優(yōu)選至少100％。

術(shù)語“同一性”用于描述兩種氨基酸序列或兩種核酸序列間的相關(guān)性。出于本發(fā)明的目的，使用needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,j.mol.biol.48:443-453)確定兩種氨基酸序列間的序列同一性程度，如在emboss包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,rice等,2000,trendsgenet.16:276-277)，優(yōu)選版本3.0.0或更后的needle程序中執(zhí)行的。使用的任選參數(shù)是缺口打開罰分10、缺口延伸罰分0.5、和eblosum62(blosum62的emboss版本)取代矩陣。標記為“最長同一性”(使用-nobrief選項獲得)的needle輸出作為百分比同一性使用，并且如下計算：

(相同的殘基x100)/(比對長度-比對中缺口總數(shù))

出于本發(fā)明的目的，使用needleman-wunsch算法(needleman和wunsch,1970,見上文)測定兩種脫氧核糖核苷酸序列間的序列同一性程度，如在emboss包(emboss:theeuropeanmolecularbiologyopensoftwaresuite,rice等,2000,見上文)，優(yōu)選版本3.0.0或更后的needle程序中執(zhí)行的。使用的任選參數(shù)是缺口打開罰分10、缺口延伸罰分0.5、和ednafull(ncbinuc4.4的emboss版本)取代矩陣。標記為“最長同一性”(使用-nobrief選項獲得)的needle輸出作為百分比同一性使用，并且如下計算：

(相同的脫氧核糖核苷酸x100)/(比對長度-比對中缺口總數(shù))

術(shù)語“熱穩(wěn)定性”在提及酶如碳酸酐酶使用時指示在升高的溫度，即，高于45℃，優(yōu)選地高于50℃，更優(yōu)選地高于55℃，更優(yōu)選地高于60℃，甚至更優(yōu)選地高于65℃，最優(yōu)選地高于70℃，最優(yōu)選地高于75℃，最優(yōu)選地高于80℃，最優(yōu)選地高于85℃，最優(yōu)選地高于90℃，且甚至最優(yōu)選地高于100℃為功能性或活性(即，可以實施催化)的酶。在一個優(yōu)選的實施方案中，碳酸酐酶于上文指示的溫度之一展示最佳活性，即酶的最適溫度于上文指示的溫度之一?？梢越?jīng)由配制，例如通過與穩(wěn)定化化學(xué)品組合或者通過酶固定化或者通過化學(xué)修飾，例如交聯(lián)以便以其活性三維形狀保持酶以某種程度提高碳酸酐酶的溫度穩(wěn)定性。為了使酶視為熱穩(wěn)定性的，它于升高的溫度在至少15分鐘，優(yōu)選至少2小時，更優(yōu)選至少24小時，更優(yōu)選至少7天，更優(yōu)選至少10天，甚至更優(yōu)選至少14天，最優(yōu)選至少30天，甚至最優(yōu)選至少50天后保持活性。一般地，在1mnahco3緩沖液中于ph8于給定的升高溫度溫育規(guī)定的時間后使用實施例3中描述的測定法測量活性水平?？梢员容^該活性與溫度升高前的酶活性，由此獲得熱處理后的酶殘余活性。優(yōu)選殘余活性于升高的溫度在給定時間后是至少30％，更優(yōu)選至少40％，更優(yōu)選至少50％，更優(yōu)選至少60％，甚至更優(yōu)選至少70％，最優(yōu)選至少80％，甚至最優(yōu)選殘余活性是至少90％，且絕對最優(yōu)選殘余活性的水平于升高的溫度在給定的時間后至少是相等或不變的。

術(shù)語“宿主細胞”意指易于用包含本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體或表達載體轉(zhuǎn)化、轉(zhuǎn)染、轉(zhuǎn)導(dǎo)等的任何細胞類型。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細胞不同的任何親本細胞后代。

術(shù)語“分離的多核苷酸”意指相對于如存在于自然界中的所述多核苷酸，人為修飾的多核苷酸。在一個方面，分離的多核苷酸是至少1％純的，例如至少5％純的，更優(yōu)選至少10％純的，至少20％純的，至少40％純的，至少60％純的，至少80％純的，至少90％純的，及至少95％純的，如通過瓊脂糖電泳確定的。多核苷酸可以是基因組、cdna、rna、半合成、合成起源的，或其任何組合。

如本文中使用的，術(shù)語“分離的多肽”指如通過sds-page確定的，至少20％純的，優(yōu)選至少40％純的，更優(yōu)選至少60％純的，甚至更優(yōu)選至少80％純的，最優(yōu)選至少90％純的，且甚至最優(yōu)選至少95％純的多肽。

術(shù)語“成熟多肽”意指翻譯和任何翻譯后修飾，如n端加工、c端截短、糖基化、磷酸化等后其最終形式的多肽。在一個方面，成熟多肽是seqidno:2的20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251。本領(lǐng)域中已知的是，宿主細胞可以生成由同一多核苷酸表達的兩種以上不同的成熟多肽(即，具有不同c端和/或n端氨基酸)的混合物。

術(shù)語“成熟多肽編碼序列”意指編碼具有碳酸酐酶活性的成熟多肽的多核苷酸。

術(shù)語“可操作連接的”意指控制序列相對于多核苷酸的編碼序列在合適的位置處放置，使得控制序列指導(dǎo)編碼序列表達的構(gòu)造。

如本文中使用的，術(shù)語“分泌的多肽”應(yīng)當(dāng)理解為在細胞中表達后轉(zhuǎn)運并釋放至周圍的胞外介質(zhì)或者在細胞膜中結(jié)合/包埋，使得多肽的至少一部分暴露于周圍的胞外介質(zhì)的多肽。

術(shù)語“亞序列”意指從成熟多肽編碼序列的5’和/或3’端缺失一個或多個(幾個)核苷酸的多核苷酸，其中該亞序列編碼具有碳酸酐酶活性的片段。

術(shù)語“基本上純的多肽”在本文中意指含有至多10％、優(yōu)選地至多8％、更優(yōu)選地至多6％、更優(yōu)選地至多5％、更優(yōu)選地至多4％、至多3％、甚至更優(yōu)選地至多2％、最優(yōu)選至多1％，且甚至最優(yōu)選至多0.5％(按重量計)與其天然關(guān)聯(lián)的其它多肽材料的多肽制備物。因此，優(yōu)選的是，基本上純的多肽是至少92％純的、優(yōu)選至少94％純的、更優(yōu)選至少95％純的、更優(yōu)選至少96％純的、更優(yōu)選至少96％純的、更優(yōu)選至少97％純的、更優(yōu)選至少98％純的、甚至更優(yōu)選至少99％、最優(yōu)選至少99.5％純的、且甚至最優(yōu)選地100％純的(按重量計)在制備物中存在的總多肽材料。優(yōu)選本發(fā)明的多肽為基本上純的形式。特別地，優(yōu)選的是多肽為“基本上純的形式”，即，多肽制備物基本上不含與其天然關(guān)聯(lián)的其它多肽材料。這可以例如通過依靠公知的重組方法制備多肽或者通過經(jīng)典的純化方法來實現(xiàn)。

在本文中，術(shù)語“基本上純的多肽”與術(shù)語“分離的多肽”和“分離形式的多肽”是同義的。

術(shù)語“合成氣”或“合成氣體”用于描述含有不同量的通過將含碳燃料(例如甲烷或天然氣)氣化成具有熱值的氣體產(chǎn)物生成的一氧化碳和氫氣的氣體混合物。co2在合成氣反應(yīng)中生成，并且必須除去以增加熱值。

術(shù)語“嗜熱的”就生物體而言描述于相對較高的溫度，即高于45℃茁壯生長(thrive)的生物體。超嗜熱生物體在極端熱的環(huán)境(也就是說，比60℃左右高，最佳溫度高于80℃)中茁壯生長。

自persephonella可獲得的碳酸酐酶及其用途

目前，幾種熱穩(wěn)定性碳酸酐酶是已知的，包括來自熱自養(yǎng)甲烷桿菌(methanobacteriumthermoautotrophicum)δh的β類ca(cab)(已經(jīng)報告了其對于高至75℃是熱穩(wěn)定的(smith和ferry,1999,j.bacteriol.181:6247-6253))和來自嗜熱甲烷八疊球菌(methanosarcinathermophila)tm-1的γ類碳酸酐酶(cam)。在1994年第一次分離出cam(alber和ferry,1994,proc.natl.acad.sci.usa91:6909-1913)，并且在1996年，顯示了它對于于55℃加熱15分鐘是穩(wěn)定的(alber和ferry,1996,j.bacteriol.178:3270-3274)。cam是唯一分離的γ類酶，并且自其發(fā)現(xiàn)起已經(jīng)進行了許多表征研究。wo2010/081007描述了cam的熱穩(wěn)定性變體。us2006/0257990描述了人碳酸酐酶ii變體，其中最穩(wěn)定的變體高至65℃顯示活性。us2004/0259231披露了cab及非熱穩(wěn)定性人ca同等型iv在co2溶解和濃縮過程中的用途。wo2008/095057描述了來自克勞氏芽孢桿菌(bacillusclausii)和耐鹽芽孢桿菌(bacillushalodurans)的熱穩(wěn)定性α-碳酸酐酶及其用于提取co2的用途。wo2010/151787(申請no.pct/us2010/040022)描述了來自caminibacter的熱穩(wěn)定性α-碳酸酐酶及其用于提取co2的用途。

本發(fā)明的一個方面是自persephonella屬細菌菌株分離的熱穩(wěn)定性碳酸酐酶、或落入本發(fā)明的persephonella碳酸酐酶的給定序列同一性內(nèi)的碳酸酐酶在從含有co2的介質(zhì)，如氣體、液體、或多相混合物提取co2中的技術(shù)應(yīng)用。優(yōu)選persephonella碳酸酐酶是α類碳酸酐酶。優(yōu)選將co2從一種介質(zhì)，如氣體提取到第二介質(zhì)如液體，牽涉在第二介質(zhì)內(nèi)將co2轉(zhuǎn)化成碳酸氫鹽，這又稱作co2的吸收。含有co2的介質(zhì)中碳酸氫鹽轉(zhuǎn)化成co2，然后該co2可以從第一介質(zhì)釋放到第二介質(zhì)，如氣體的相反提取過程也是期望的過程，其中可以應(yīng)用本發(fā)明的碳酸酐酶。此過程又稱作co2的解吸。本發(fā)明在含有co2的介質(zhì)的溫度和/或提取過程中存在碳酸酐酶的某些階段的溫度高于商業(yè)上可得到的碳酸酐酶，如自人或牛紅細胞分離的ca-i或ca-ii(其具有約37℃的最適溫度)的最適溫度的情況中，或者在溫度高于少數(shù)已知的熱穩(wěn)定性碳酸酐酶的最適溫度的情況中是特別有用的。可以出現(xiàn)升高的溫度的過程階段的一個例子是在使熱煙道氣體與用于從煙道氣體吸收co2的含有碳酸酐酶的液體接觸時。另一個例子是目前的co2洗滌技術(shù)，如用碳酸鹽(例如，熱碳酸鉀過程)、鏈烷醇胺(例如，單乙醇胺、甲基二乙醇胺等)或其它胺(例如，氨)的化學(xué)吸收，其在解吸過程中使用升高的溫度(高至約120至130℃)。

已經(jīng)自深海熱水出口分離出屬于persephonella屬的幾種細菌菌株。目前，已經(jīng)鑒定出三種物種，即persephonellamarina、persephonellahydrogeniphila和persephonellaguaymasensis(等,2002,internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,52,1349-1359及nakagawa等,2003,internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,53,863-869)。已經(jīng)報告了所述菌株于70℃或70℃左右的溫度生長。persephonellamarina已經(jīng)進行了基因組測序(embl-ebiidcp001230)。本申請中以seqidno:1鑒定的開讀框自此工作獲得，并且預(yù)測了以uniprot登錄號c0qrb5(seqidno:2)發(fā)表的翻譯多肽序列可以生成具有碳酸酐酶活性的蛋白質(zhì)。似乎所述蛋白質(zhì)從未表達或表征以確認此預(yù)測。本發(fā)明的實施例第一次描述了克隆、表達和分離來自p.marinadsm14350的成熟碳酸酐酶，而且確認氨基酸序列生成具有碳酸酐酶活性的酶。顯示了所述酶在1mnahco3中于ph8于80℃溫育15分鐘及2小時后維持所有其碳酸酐酶活性。

與具有uniprot登錄號：c0qrb5的persephonella碳酸酐酶最緊密相關(guān)的碳酸酐酶是53％相同的allochromatiumvinosum碳酸脫水酶(ec4.2.1.1,uniprot登錄號：d3rv11)。

在本發(fā)明的一個實施方案中，要在co2提取中應(yīng)用的碳酸酐酶源自選自如下的細菌菌株、可從選自如下的細菌菌株獲得或可由選自如下的細菌菌株生成：菌種persephonellamarina,persephonellahydrogeniphila或persephonellaguaymasensis之一，優(yōu)選要在co2提取中應(yīng)用的碳酸酐酶源自persephonellamarinadsm14350、persephonellahydrogeniphiladsm15103或persephonellaguaymasensisdsm14351保藏的菌株之一或可由其生成。

在又一個實施方案中，要在co2提取中應(yīng)用的碳酸酐酶是a)源自persephonellamarinadsm14350的、可從persephonellamarinadsm14350獲得或可由persephonellamarinadsm14350生成的；或b)具有與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251對應(yīng)的氨基酸序列的多肽；或c)與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251至少60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％相同的多肽；或d)(a)、(b)或(c)中具有碳酸酐酶活性的片段；或e)由在非常低的、低的、中等的、中等-高的或高的嚴格性條件下與如下雜交的核酸序列編碼的多肽：i)編碼seqidno:2的成熟多肽的多核苷酸序列；或ii)seqidno:1或seqidno:3的多核苷酸序列；或iii)(i)或(ii)中至少100個連續(xù)核苷酸的亞序列，或iv)(i)或(ii)的互補鏈(sambrook,fritsch和maniatis,1989,molecularcloning,alaboratorymanual,第2版,coldspringharbor,newyork)；或f)由如下的核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列由于遺傳密碼簡并性不與seqidno:1或seqidno:3的多核苷酸序列雜交，但其編碼具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽；或g)由如下的核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列與seqidno:1或seqidno:3至少60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同。c)、e)或g)中的多肽可以是合成的或者源自與persephonella不同的物種，只要多肽落入所要求保護的同一性內(nèi)，并且維持碳酸酐酶活性。在使用術(shù)語persephonella碳酸酐酶時，它還包括c)、e)和g)的碳酸酐酶。

依照本發(fā)明，雜交條件如下定義。對于長度至少100個核苷酸的長探針，非常低的到非常高的嚴格性條件定義為于42℃在5xsspe、0.3％sds、200μg/ml剪切的且變性的鮭精dna、和25％甲酰胺(對于非常低的和低的嚴格性)、35％甲酰胺(對于中等的和中等-高的嚴格性)、或50％甲酰胺(對于高的和非常高的嚴格性)中遵循標準的southern印跡規(guī)程預(yù)雜交和雜交最佳地12至24小時。最終，使用2xssc、0.2％sds優(yōu)選至少于45℃(非常低的嚴格性)、更優(yōu)選至少于50℃(低嚴格性)、更優(yōu)選至少于55℃(中等嚴格性)、更優(yōu)選至少于60℃(中等-高嚴格性)、甚至更優(yōu)選至少于65℃(高嚴格性)、且最優(yōu)選至少于70℃(非常高的嚴格性)將載體材料洗滌三次，各15分鐘。在一個具體的實施方案中，使用0.2xssc、0.2％sds優(yōu)選至少于45℃(非常低的嚴格性)、更優(yōu)選至少于50℃(低嚴格性)、更優(yōu)選至少于55℃(中等嚴格性)、更優(yōu)選至少于60℃(中等-高嚴格性)、甚至更優(yōu)選至少于65℃(高嚴格性)、且最優(yōu)選至少于70℃(非常高的嚴格性)進行洗滌。在另一個具體的實施方案中，使用0.1xssc、0.2％sds優(yōu)選至少于45℃(非常低的嚴格性)、更優(yōu)選至少于50℃(低嚴格性)、更優(yōu)選至少于55℃(中等嚴格性)、更優(yōu)選至少于60℃(中等-高嚴格性)、甚至更優(yōu)選至少于65℃(高嚴格性)、且最優(yōu)選至少于70℃(非常高的嚴格性)進行洗滌。對于長度約15個核苷酸至約70個核苷酸的短探針，嚴格性條件定義為于低于計算的tm約5℃至約10℃在0.9mnacl、0.09mtris-hclph7.6、6mmedta、0.5％np-40、1x登哈特(denhardt)氏溶液、1mm焦磷酸鈉、1mm磷酸二氫鈉、0.1mmatp、和每ml0.2mg酵母rna中遵循標準的southern印跡規(guī)程的預(yù)雜交、雜交和雜交后洗滌，所述計算的tm使用依照bolton和mccarthy(1962,proceedingsofthenationalacademyofsciencesusa48:1390)的計算得到。將載體材料在加有0.1％sds的6xscc中洗滌一次達15分鐘，并使用6xssc于低于計算的tm5℃至10℃洗滌兩次，各15分鐘。

與seqidno:2或seqidno:4具有給定％同一性的多肽序列或與seqidno:1或seqidno:3具有給定％同一性的多核苷酸序列可以獲自天然存在的來源，如其它細菌菌株。或者，通過在親本序列(例如seqidno:1或seqidno:3(對于多核苷酸)及seqidno:2或seqidno:4(對于多肽)的成熟序列)中取代、缺失、和/或插入一個或多個氨基酸或核酸獲得多肽或多核苷酸序列。優(yōu)選親本序列或由親本多核苷酸編碼的多肽中改變的氨基酸數(shù)目是1-5、1-10、1-20、1-30或1-40個氨基酸。優(yōu)選氨基酸變化是性質(zhì)上較不重要的，其是不顯著影響蛋白質(zhì)折疊和/或活性的保守氨基酸取代或插入；通常1至約30個氨基酸的小缺失；小的氨基或羧基端延伸，如氨基端甲硫氨酸殘基；多至約20-25個殘基的小接頭肽；或便于通過改變凈電荷或另一種功能進行純化的小延伸，如多組氨酸標簽或多組氨酸-谷氨酸標簽、抗原性表位或結(jié)合域。保守取代的例子在堿性氨基酸(精氨酸、賴氨酸和組氨酸)、酸性氨基酸(谷氨酸和天冬氨酸)、極性氨基酸(谷氨酰胺和天冬酰胺)、疏水性氨基酸(亮氨酸、異亮氨酸和纈氨酸)、芳香族氨基酸(苯丙氨酸、色氨酸和酪氨酸)、和小氨基酸(甘氨酸、丙氨酸、絲氨酸、蘇氨酸和甲硫氨酸)的組內(nèi)。一般不改變比活的氨基酸取代是本領(lǐng)域中已知的，并且例如由neurath和hill,1979,于theproteins,academicpress,newyork描述。最通常存在的交換是ala/ser,val/ile,asp/glu,thr/ser,ala/gly,ala/thr,ser/asn,ala/val,ser/gly,tyr/phe,ala/pro,lys/arg,asp/asn,leu/ile,leu/val,ala/glu,和asp/gly。在20種標準的氨基酸外，可以用非標準氨基酸(如4-羥脯氨酸、6-n-甲基賴氨酸、2-氨基異丁酸、異纈氨酸、和α-甲基絲氨酸)替換野生型多肽的氨基酸殘基?？梢杂糜邢迶?shù)目的非保守氨基酸、不由遺傳密碼編碼的氨基酸、和非天然氨基酸替換氨基酸殘基。“非天然氨基酸”在蛋白質(zhì)合成后已經(jīng)經(jīng)過修飾，和/或在其側(cè)鏈中具有與標準氨基酸不同的化學(xué)結(jié)構(gòu)。非天然氨基酸可以是化學(xué)合成的，且優(yōu)選是商業(yè)上可得到的，并且包括哌可酸(pipecolicacid)、噻唑烷羧酸(thiazolidinecarboxylicacid)、脫氫脯氨酸、3-和4-甲基脯氨酸、和3,3-二甲基脯氨酸。

可以依照本領(lǐng)域中已知的規(guī)程，如定點誘變或丙氨酸掃描誘變鑒定親本多肽中的必需氨基酸(cunningham和wells,1989,science244:1081-1085)。在后來的技術(shù)中，在分子中的每個殘基處引入單一丙氨酸突變，并且對所得的突變體分子測試生物學(xué)活性(即，碳酸酐酶活性)以鑒定對于分子活性至關(guān)重要的氨基酸殘基。還可參見hilton等,1996,j.biol.chem.271:4699-4708。也可以通過對結(jié)構(gòu)的物理分析來確定酶或其它生物學(xué)相互作用的活性位點，如通過如核磁共振、晶體學(xué)、電子衍射、或光親和標記等技術(shù)以及推定的接觸位點氨基酸的突變確定的。參見例如devos等,1992,science255:306-312；smith等,1992,j.mol.biol.224:899-904；wlodaver等,1992,febslett.309:59-64。已經(jīng)對碳酸酐酶實施大量這些分析，最重要的分析綜述于例如tripp等,2001,j.biol.chem.276:48615-48618及l(fā)indskog,1997,pharmacol.ther.74:1-20。也可通過分析與多肽的同一性推斷必需氨基酸的身份，所述多肽與依照本發(fā)明的多肽有關(guān)。

α-碳酸酐酶根據(jù)其共有序列基序：s-e-[hn]-x-[livm]-x(4)-[fyh]-x(2)-e-[livmga]-h-[livmfa](2)鑒定。相應(yīng)的共有殘基對應(yīng)于seqidno:2中的第112位至第128位和seqidno:4中的第120位至第136位。在一個優(yōu)選的實施方案中，所有共有位置存在于碳酸酐酶中。

預(yù)測以下氨基酸殘基h107、h109和h126(依照seqidno:2編號)形成對于催化重要的組氨酸三聯(lián)體。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，碳酸酐酶在第107位、第109位、和第126位(使用seqidno:2編號)中含有組氨酸。

預(yù)測以下氨基酸殘基h82、e113、q105和t193(使用seqidno:2編號)參與質(zhì)子穿梭機制，其對于酶的催化活性也是相關(guān)的(與人caii類似，如由smith和ferry,2000,femsmicrobiolrev.24:335-366描述的)。在又一個實施方案中，碳酸酐酶含有第82位(使用seqidno:2編號)中的組氨酸和/或第105位(使用seqidno:2編碼)中的谷氨酰胺和/或第113位(使用seqidno:2編號)中的谷氨酸和/或第193位(使用seqidno:2編號)中的蘇氨酸。優(yōu)選碳酸酐酶中存在至少一個質(zhì)子穿梭位置，更優(yōu)選地存在至少兩個質(zhì)子穿梭位置，更優(yōu)選地存在至少三個質(zhì)子穿梭位置，且最優(yōu)選地存在所有質(zhì)子穿梭位置。

預(yù)測以下半胱氨酸殘基c44和c197(使用seqidno:2編號)參與半胱氨酸橋，并且因此對于碳酸酐酶的穩(wěn)定性可以是重要的。先前在淋病奈瑟氏球菌(neisseriagonorrhoeae)ca(huanget等,1998,jmolbiol,283:301-310)中鑒定出相應(yīng)的半胱氨酸殘基。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，碳酸酐酶含有第44位和第197位(使用seqidno:2編號)中的半胱氨酸。

可以進行并測試單處或多處氨基酸取代，其使用誘變、重組、和/或改組的已知方法，接著是相關(guān)的篩選規(guī)程，如那些由reidhaar-olson和sauer,1988,science241:53-57；bowie和sauer,1989,proc.natl.acad.sci.usa86:2152-2156；wo95/17413；或wo95/22625披露的篩選規(guī)程進行?？梢允褂玫钠渌椒òㄒ族epcr、噬菌體展示(例如，lowman等,1991,biochem.30:10832-10837；美國專利no.5,223,409；wo92/06204)、和區(qū)域指導(dǎo)的誘變(derbyshire等,1986,gene46:145；ner等,1988,dna7:127)。

可以組合誘變/改組方法與高通量、自動化篩選方法以檢測由宿主細胞表達的克隆的、誘變的多肽的活性?？梢允褂帽绢I(lǐng)域中的標準方法將編碼活性多肽的誘變dna分子自宿主細胞回收，并快速測序。這些方法容許快速測定感興趣多肽中個別氨基酸殘基的意義，并且可以應(yīng)用于未知結(jié)構(gòu)的多肽。

上文所描述的persephonella碳酸酐酶可用于下文更為詳細描述的一系列應(yīng)用。在下文提及persephonella碳酸酐酶或碳酸酐酶時，意圖包括本發(fā)明中所描述的所有碳酸酐酶，特別若它們落入所要求保護的身份內(nèi)。

特別地，可以使用persephonella碳酸酐酶來從co2排放流，例如，從電力發(fā)電廠中基于碳的或基于碳氫化合物的燃燒，或者從此類工廠、工業(yè)爐、爐、灶、或壁爐的煙道氣體煙囪/煙道或從飛機或汽車排氣裝置提取二氧化碳。也可以使用persephonella碳酸酐酶來除去在工業(yè)用氣如乙炔(c2h2)、一氧化碳(co)、氯氣(cl2)、氫氣(h2)、甲烷(ch4)、氧化亞氮(n2o)、丙烷(c3h8)、二氧化硫(so2)、氬(ar)、氮(n2)、和氧氣(o2)制備中的co2。也可以使用persephonella碳酸酐酶在加工成天然氣期間從粗天然氣除去co2。從粗天然氣除去co2會用來富集天然氣中的甲烷(ch4)含量，由此增加熱單位/m³。一般地，粗天然氣獲自氣油井、氣井、和凝析井。天然氣在通過常規(guī)方法自地質(zhì)學(xué)天然氣儲層獲得時含有1％至10％co2，但是根據(jù)天然來源或使用的回收方法，可以含有高至50％co2或甚至更高。也可以使用碳酸酐酶來純化天然氣，使得它基本上不含co2，例如，使得co2含量低于1％，優(yōu)選地低于0.5％、0.2％、0.1％、0.05％，且最優(yōu)選地低于0.02％。與天然氣的甲烷富集類似，也可以使用碳酸酐酶來富集沼氣中的甲烷含量。沼氣總會含有相當(dāng)程度的co2，因為發(fā)酵過程中使用的細菌生成甲烷(60-70％)和co2(30-40％)?？梢允褂檬葴鼗蚴葻嵛⑸飳嵤┱託馍?。嗜熱菌株容許于升高的溫度，例如40℃至80℃、或50℃至70℃、或55℃至60℃發(fā)生發(fā)酵。在此類過程中，熱穩(wěn)定性碳酸酐酶特別可用于自甲烷除去co2。本發(fā)明提供了persephonella碳酸酐酶降低沼氣中二氧化碳含量的用途，優(yōu)選地co2含量降低為使得它構(gòu)成小于25％、更優(yōu)選地小于20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％且最優(yōu)選地小于0.1％。在一個優(yōu)選的實施方案中，碳酸酐酶是熱穩(wěn)定的。此外，可以如下在合成氣的生成中應(yīng)用碳酸酐酶，即除去通過氣化含碳燃料(例如，甲烷或天然氣)生成的co2，由此富集合成氣的co、h2含量。在于升高的溫度發(fā)生合成氣生成的情況中，使用熱穩(wěn)定性碳酸酐酶是一項優(yōu)點。本發(fā)明提供了碳酸酐酶降低合成氣生成中二氧化碳含量的用途。優(yōu)選co2含量降低為使得它構(gòu)成小于25％、更優(yōu)選地小于20％、15％、10％、5％、2％、1％、0.5％且最優(yōu)選地小于0.1％。在一個優(yōu)選的實施方案中，碳酸酐酶是熱穩(wěn)定的。優(yōu)選如上文所描述的要用于co2提取的碳酸酐酶在1mnahco3緩沖液ph8中于高于45℃、優(yōu)選高于50℃、高于55℃、高于60℃、高于65℃、更優(yōu)選高于70℃、最優(yōu)選高于80℃、最優(yōu)選高于90℃、最優(yōu)選高于100℃、最優(yōu)選高于105℃，且甚至最優(yōu)選高于110℃的溫度于升高的溫度溫育至少15分鐘、優(yōu)選至少2小時、更優(yōu)選至少24小時、更優(yōu)選至少7天、更優(yōu)選至少10天、甚至更優(yōu)選至少14天、最優(yōu)選至少30天、甚至最優(yōu)選至少50天后維持至少30％、優(yōu)選地高于40％、更優(yōu)選地高于50％、更優(yōu)選地高于60％、甚至更優(yōu)選地高于70％、最優(yōu)選地高于80％、最優(yōu)選地高于85％、最優(yōu)選地高于90％、最優(yōu)選地高于95％的殘余活性，且甚至最優(yōu)選地殘余活性不變?？梢酝ㄟ^配制，例如，通過酶的固定化以某種程度提高碳酸酐酶的溫度穩(wěn)定性和/或壽命。

在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的碳酸酐酶(其可以用于co2提取，如上文所描述的)在1mnahco3溶液(約ph8-10)中在溫度范圍25-90℃中溫育15分鐘時維持至少85％活性。于50℃，酶在ph范圍4-11里維持完全活性達一天。于50℃在10天后，酶在ph范圍4-11里維持超過50％活性。

在本發(fā)明的一個方面，在基于酶的生物反應(yīng)器中實施從含有co2的介質(zhì)提取co2。在生物反應(yīng)器中加工含有二氧化碳的介質(zhì)前，可以將其純化至使其不含污染物，該污染物可以擾亂酶促反應(yīng)或以其它方式(例如通過堵塞出口或膜)干擾生物反應(yīng)器功能性。優(yōu)選對自燃燒過程，例如，煙道氣體或排氣裝置排放的氣體/多相混合物清除灰分、顆粒、nox和/或so2，之后將氣體/多相混合物通道生物反應(yīng)器中。來自不同地區(qū)的粗天然氣可以具有不同組成和分離需要。優(yōu)選除去油、凝析油、水和天然氣液體(若存在于粗天然氣中的話)，之后在基于酶的生物反應(yīng)器中提取co2。自燃燒過程排放或存在于粗天然氣的co2可以在與脫硫相同的過程中提取，或者它可以在完全不同的過程中提取。若此點時的氣體超過本發(fā)明碳酸酐酶的最適溫度，則可以需要一定程度的冷卻。在co2提取過程期間碳酸酐酶暴露的溫度(無論它是生物反應(yīng)器中的工藝溫度或是進料氣溫度)可為0℃-120℃。優(yōu)選工藝溫度是45℃-110℃，更優(yōu)選50℃-100℃，更優(yōu)選55℃-90℃，甚至更優(yōu)選60℃-80℃，且最優(yōu)選65℃-75℃。

用于氣體分離，包括co2提取的反應(yīng)器和工藝是本領(lǐng)域中公知的，并且在商業(yè)上用于各種目的(a.kohl和r.nielsen,gaspurification,第5版,gulfprofessionalpublishing,houston,tx,1997)。存在著幾種類型的反應(yīng)器，其可以與本發(fā)明的碳酸酐酶組合以產(chǎn)生生物反應(yīng)器(包含生物學(xué)材料如酶的反應(yīng)器)，用于從氣體，如燃燒氣體或呼吸氣體提取co2。因為碳酸酐酶改善co2提取速率，所以與常規(guī)辦法相比，組合碳酸酐酶與co2提取反應(yīng)器實現(xiàn)反應(yīng)器和工藝改善，如較小的尺寸和較廉價的吸收模塊(例如，較短的吸收柱)及使用低能量消耗和低揮發(fā)性載體液體以及總體較低的運行溫度。

一類反應(yīng)器使用液膜。例如，這可以是包含含有液膜的中空纖維膜的反應(yīng)器，如記載于majumdar等,1988,aiche34:1135-1145；us4,750,918；us6,156,096；wo04/104160的。此類基于中空纖維膜的設(shè)計有時又稱作中空纖維液膜(hflm)，并且基于這些的co2分離裝置已經(jīng)稱作中空纖維納入式液膜(hfclm)滲透器。hfclm滲透器的共同特征在于密封喂入和吹掃氣流的中空纖維彼此接近(即，“緊密包裝”或“直接相鄰”)，并且它們在單一剛性處理室中密封以形成一個完整的滲透器。在此類設(shè)計中，液體圍繞緊密包裝的喂入和吹掃中空纖維的殼側(cè)。因為一個中空纖維的外側(cè)壁間的距離與相鄰中空纖維是非常接近的，所以它們間的液體層的厚度是與膜一樣薄的，并且液體的組成僅容許某些組分通過，因此術(shù)語“液膜”已經(jīng)用于描述中空纖維周圍的液體。在本領(lǐng)域中也已經(jīng)描述了納入式液膜滲透器，其中液膜夾入兩個結(jié)構(gòu)支持膜間(cowan等,2003,ann.nyacad.sci.984:453-469)；此設(shè)計基本上以與hfclm相同的方式發(fā)揮功能。納入式液膜滲透器也已經(jīng)與碳酸酐酶組合使用，如記載于us6,143,556,wo2004/104160,cowan等,2003,ann.nyacad.sci.984:453-469；及trachtenberg等,2003,saeinternationalconferenceonenvironmentalsystemsdocketnumber2003-01-2499的。在這些情況中，co2解吸步驟在與吸收步驟相同的密封處理室中發(fā)生。另一個例子描述了一種基于吸收塔/解吸塔(解吸塔)中空纖維膜模塊的基于胺的co2捕捉反應(yīng)器(kosaraju等,2005,ind.eng.chem.res.44:1250-1258)。

另一類反應(yīng)器使用直接氣體-液體接觸。例如，這可以是常規(guī)的基于溶劑的co2捕捉反應(yīng)器，其基于吸收塔/解吸塔柱反應(yīng)器(us2008/0056972,reddy等,secondnationalconferenceoncarbonsequestration,netl/doe,alexandria,va,2003年5月5-8日)。在a.kohl和r.nielsen,gaspurification,第5版,gulfprofessionalpublishing,houston,tx,1997:57-62中顯示了用于商業(yè)直接氣體-流體接觸器反應(yīng)器的典型流程圖，其使用鏈烷醇胺(如單乙醇胺、二乙醇胺、和甲基二乙醇胺)進行co2提取。在a.kohl和r.nielsen,gaspurification,第5版,gulfprofessionalpublishing,houston,tx,1997:334-340中顯示了用于商業(yè)直接氣體-流體接觸器反應(yīng)器的典型流程圖，其使用堿性鹽溶液(如碳酸鉀)進行co2提取。使用碳酸酐酶的直接氣體-液體接觸反應(yīng)器已經(jīng)記載于us6,524,843；wo2004/007058,wo2004/056455,us7,176,017,及us2004/0059231。在此類反應(yīng)器中，在如下的條件中使氣相或多相混合物與液相接觸，其中氣相中的co2被液相吸收，在那里通過碳酸酐酶將其轉(zhuǎn)化成碳酸氫鹽。通過連續(xù)流動從反應(yīng)器取出富含碳酸氫鹽的液體，以確保co2和碳酸氫鹽之間的平衡向co2的連續(xù)轉(zhuǎn)化轉(zhuǎn)變。氣相溶解于液相取決于氣體與液體之間的表面接觸面積。例如，可以通過將液體和含有co2的氣體通到高表面積填充的盤式或板式柱或塔，通過將液體小滴噴霧到含有co2的氣體(即，噴霧接觸器)，或者通過將含有co2的氣體鼓泡到液體(即，氣泡罐或池)，或者通過組合這些技術(shù)來實現(xiàn)大接觸面積。填充柱可以包含填料如拉西環(huán)、弧鞍填料、勒辛(lessing)環(huán)、英特洛克斯(intalox)金屬、矩鞍填料、鮑爾環(huán)或工程填料如q-pac(lantecproducts,inc.,agourahills,ca91301)。填料材料可以由聚合物如尼龍、聚酯、聚乙烯、聚醚醚酮、聚丙烯、聚苯乙烯或含氟聚合物(例如聚四氟乙烯)、陶瓷如硅土、或金屬如鋁、碳鋼、或不銹鋼、或基于纖維素的材料如木纖維和棉纖維構(gòu)成。在液體不斷更換的反應(yīng)器類型中或在期望阻止碳酸酐酶到反應(yīng)器中的一個或多個位置時，可以通過各種手段將碳酸酐酶在反應(yīng)器中保留。在填充柱中，碳酸酐酶可以在填料材料上固定化(用于固定化ca的方法，參見例如wo2005/114417)。在“鼓泡”反應(yīng)器中，碳酸酐酶可以在多孔基質(zhì)，例如，不溶性凝膠顆粒如硅土、藻酸鹽、藻酸鹽/殼聚糖、藻酸鹽/羧甲基纖維素中包埋，或碳酸酐酶可以在液體中在懸浮液中的固體填料(如在填充柱中)上固定化(通過共價鍵、離子電荷、包埋或包囊)，或者碳酸酐酶可以在清蛋白或peg網(wǎng)絡(luò)中化學(xué)連接。也可以通過在聚合固定化材料中包埋來阻止碳酸酐酶到反應(yīng)器中的特定位置，所述聚合固定化材料可以包含膠束或反膠束材料，如記載于wo2010/037109。噴霧接觸器可以包含垂直或水平噴霧室、逆流噴霧柱、文丘里洗滌器、噴射器或噴射洗滌器、旋風(fēng)洗滌器、和噴霧干燥器(a.kohl和r.nielsen,gaspurification,第5版,gulfprofessionalpublishing,houston,tx,1997:418-427和604-616)。在避免壓力下降和對氣體(如在大氣壓的情況下，燃燒后排出氣體)中固體微粒的耐受性是重要的時，使用噴霧接觸器是期望的。然而，為了最有效，噴霧接觸器中的co2吸收速率必須是快速的，并且碳酸酐酶可以提供需要的催化來實現(xiàn)這些快速的速率。

直接氣體-液體接觸反應(yīng)器中的co2提取可以牽涉第一吸收階段，接著是任選地隨后的解吸、沉淀、利用、收集、再生或釋放階段。吸收階段的一般性描述如下。在吸收反應(yīng)器運行時，含水液體在一端，優(yōu)選地頂部進入反應(yīng)器，并且流到另一端，優(yōu)選地底部，而含有co2的氣體流(進料氣)在一端，優(yōu)選在與液體相反的末端(底部)(“逆流”)進入反應(yīng)器，并且氣體通到液體并離開，減去提取入液體中的co2，到相反端(優(yōu)選反應(yīng)器頂部)的氣體出口。離開吸收反應(yīng)器的液體富含碳酸氫鹽/碳酸鹽(富含co2的液體)，并且與進料氣相比，離開氣體在co2含量上降低。富含co2的液體可以在隨后的反應(yīng)中加工，例如以通過通到解吸反應(yīng)器來生成純co2，或者以生成碳酸鹽沉淀物如caco3。來自吸收反應(yīng)器的富含co2的液體也可以利用(例如，以增強藻類生成)，收集(例如，通過將富含co2的液體泵入納入性地質(zhì)學(xué)形成中進行)，釋放(例如，通過將富含co2的液體泵入環(huán)境中，如從潛水艇生命支持系統(tǒng)將碳酸氫鹽液體釋放入海水中)，蒸發(fā)或脫鹽。含有碳酸氫鹽陰離子的富含co2的液體可以在工業(yè)方法中，如在碳酸銨和碳酸氫銨(其作為肥料是有用的)的制造方法中，或者在用于除去及中和酸性氣體如二氧化硫的方法中使用。

上文所描述的反應(yīng)器可以僅牽涉吸收階段、僅解吸階段或吸收和接著的解吸階段，其中碳酸酐酶可以催化co2水合成碳酸氫鹽或碳酸氫鹽脫水成co2或這兩者。反應(yīng)器可以彼此組合，其中每個反應(yīng)器構(gòu)成模塊。例如液膜反應(yīng)器可以發(fā)揮吸收模塊功能，而直接氣體-液體接觸反應(yīng)器發(fā)揮解吸模塊功能，或者反之亦然。

不限制本發(fā)明的范圍，提供圖2以顯示包含吸收和解吸模塊兩者的co2提取反應(yīng)器的一般性示意圖，co2吸收載體液體遍及所述co2提取反應(yīng)器循環(huán)，期間它在吸收塔中從含有co2的氣相(進料氣)除去co2，在解吸塔中釋放純化的co2氣體，然后再循環(huán)回到吸收塔。術(shù)語“進料氣”經(jīng)常與co2提取反應(yīng)器關(guān)聯(lián)使用，其中它暗示通過與反應(yīng)器中co2貧乏的載體液體接觸從含有co2的氣相除去co2。進料氣可以處于大氣壓，或者處于高于或低于大氣壓的壓力。co2在載體液體中的選擇性溶解度引起co2從進料氣提取入吸收塔中的載體液體中。在解吸塔中，通過引入降低載體液體中co2溶解度的壓力差(例如與進料氣中的分壓力相比解吸塔氣相中co2的分壓力更低，如可以通過在解吸塔中應(yīng)用真空來實現(xiàn))和/或應(yīng)用熱(例如經(jīng)由再沸器)、蒸汽或吹掃氣體驅(qū)動co2進入解吸塔中的氣相中從載體液體釋放co2。可以僅使用熱能來驅(qū)動解吸，如在基于單乙醇胺的co2提取過程中通常使用。例如，典型的基于單乙醇胺的co2提取的解吸塔中的溫度大于100℃(例如，120℃)。或者，可以組合熱能與壓力降低以驅(qū)動解吸，在此情況中，可以降低解吸塔中的溫度。例如，連同降低的壓力(例如，真空)，與吸收塔中的壓力(例如，大氣壓)相比，可以于70℃運行解吸塔。可以使用ph的差異來促進吸收和解吸，其中co2吸收入水性介質(zhì)中于更為堿性的ph是有利的，而自水性介質(zhì)的co2解吸于不太堿性的(更為酸性的)ph是有利的。吸收和解吸之間的相關(guān)ph差異(“擺動”)范圍取決于特定的過程。例如，為了例示，co2吸收入基于碳酸氫鹽的載體液體中可以于ph9或之上發(fā)生，導(dǎo)致所述載體液體的ph降低到低于ph9。然后，從所述載體液體解吸co2可以于低于ph9的ph發(fā)生。

在通到吸收塔的進料氣的壓力高于解吸塔中的氣相壓力時可以建立/發(fā)生吸收塔和解吸塔之間的壓力差。在一些情況中，如對于天然氣升級，吸收塔中的氣體壓力高于在解吸塔中，并且吸收塔和解吸塔兩者中的氣體壓力可以高于大氣壓。在其它情況中，吸收塔中的氣體壓力高于大氣壓，而解吸塔中的氣體壓力處于或低于大氣壓(即，等于或小于100kpa)?；蛘?，以在通到吸收塔的進料氣(如燒煤的燃燒后煙道氣體)的壓力近似處于大氣壓，而解吸塔中的氣相壓力低于大氣壓時建立/發(fā)生吸收塔和解吸塔之間的壓力差。在本發(fā)明的一個實施方案中，吸收塔和解吸塔之間的總氣體壓力差是至少約35kpa。

圖2中示意性顯示的吸收塔和解吸塔可以處于基本上相同(“等溫”)溫度或處于不同溫度。persephonella碳酸酐酶可以僅存在于吸收塔或解吸塔中或這兩者中。在存在高溫碳酸酐酶如persephonella碳酸酐酶的解吸塔中使用真空(低壓)于較低的溫度(例如70℃)再生co2是本發(fā)明的又一個實施方案。此類過程中的碳酸酐酶催化co2吸收到吸收溶劑及從吸收溶劑解吸co2兩者。在吸收塔和解吸塔處于不同溫度時，可以使用溫度調(diào)節(jié)器(例如，熱交換器)來保存過程中的能量。

在進一步的例示中，用于h2s吸收的真空碳酸鹽方法的修改(a.kohl和r.nielsen,gaspurification,第5版,gulfprofessionalpublishing,houston,tx,1997:383-388)已經(jīng)描述用于co2提取(us2007/0256559)，并且與碳酸酐酶組合披露(lu等,doeprojectno.de-fc26-08nt0005498,netlco2capturetechnologyforexistingplantsr&dmeeting,2009年3月24-26日,pittsburgh,pa)。在此例示中，大氣壓發(fā)電廠煙道氣體在吸收塔柱中于范圍40至60℃的溫度接觸水性碳酸鉀和碳酸酐酶，其中碳酸酐酶被說成改善co2水合載體液體中碳酸氫鹽的速率。將富含co2的載體液體泵到解吸塔柱(“汽提塔(stripper)”)，其中通過低壓(例如14-55kpa)和應(yīng)用熱(例如，50-70℃)的組合從載體液體釋放co2，所述組合通過直接注射來自發(fā)電廠低壓汽輪機的低壓、低質(zhì)量廢汽獲得。來自本發(fā)明persephonella的碳酸酐酶特別適合于用于所描述的改良真空碳酸鹽方法，因為persephonella碳酸酐酶可以耐受吸收塔和解吸塔兩者中的溫度，這意味著與會被解吸塔中的溫度滅活的其它已知碳酸酐酶不同，persephonella碳酸酐酶可以耐受解吸塔中的溫度，容許其與載體液體一起遍及方法的吸收和解吸階段兩者循環(huán)。persephonella碳酸酐酶遍及整個反應(yīng)器與載體液體一起遍及高和低溫區(qū)域不斷循環(huán)的能力給予添加的優(yōu)點，即，可以使用開發(fā)的噴霧塔/室反應(yīng)器構(gòu)造，其消除對填充材料的需要?？梢越M合物理攪拌(包括超聲攪拌)與真空和/或熱以增強co2從解吸塔中載體液體的釋放。

又一類反應(yīng)器使用與碳酸酐酶的co2水合催化及隨后的沉淀組合的膜。在一種情況中，通過將氣流通過氣體擴散膜進入溶液中從氣流除去co2，其中通過在含有碳酸酐酶的基質(zhì)上通過co2溶液，并添加礦物離子以引起碳酸鹽沉淀來加速轉(zhuǎn)化(us7,132,090)。已經(jīng)進一步顯示了碳酸酐酶不僅可以催化co2水合/脫水反應(yīng)，而且還可以促進碳酸鈣沉淀(mirjafari等,2007,ind.eng.che.res.,46:921-926)。

又一類反應(yīng)器從環(huán)境空氣除去co2。已經(jīng)報告了設(shè)計用于從環(huán)境空氣除去co2的反應(yīng)器(stolaroff等2008environ.sci.technol.,42:2728-2735)，然而，此反應(yīng)器并不利用碳酸酐酶。不限于報告的環(huán)境空氣反應(yīng)器的設(shè)計，如本發(fā)明中公開的與合適的載體液體組合的碳酸酐酶可以在此類反應(yīng)器中或在其它反應(yīng)器設(shè)計中使用，如本文中描述的。熱穩(wěn)定性碳酸酐酶是特別有用的，因為將反應(yīng)器暴露于環(huán)境條件(如陽光)可以提高液體溫度，超出已知碳酸酐酶的耐受性，而且避免對冷卻反應(yīng)器的需要。這例示了如下的情況，其中從含有co2的介質(zhì)提取co2的過程可能需要碳酸酐酶于如下的溫度發(fā)揮功能或耐受如下的溫度，所述溫度高于含有co2的介質(zhì)，如環(huán)境空氣的初始溫度，其可以是夜間冷(低于10℃)而白天期間熱的(高于45℃)。

上文所描述的不同膜反應(yīng)器和直接氣體-液體接觸反應(yīng)器及其它備選可以在二氧化碳提取過程中應(yīng)用，其中吸收過程和解吸過程在至少兩個步驟中發(fā)生。一般地，此類反應(yīng)器包含下列元件：a)至少一個吸收模塊，其可以包含氣體入口區(qū)和/或氣體出口區(qū)；b)至少一個解吸模塊，其包含氣體出口區(qū)；c)載體液體；和d)用于連接所述吸收模塊和所述解吸模塊，使得所述載體液體可以從所述吸收模塊通到所述解吸模塊的手段。任選地，用于連接吸收和解吸模塊的手段是回路，容許一旦載體液體已經(jīng)通過解吸模塊，其返回到吸收模塊。一種或者這兩種模塊可以包含至少一個分開氣相與液相的co2-滲透膜，如記載于wo2010/014773和wo2010/014774。此模塊類型也稱作氣體-液膜(glm)模塊。例如，glm模塊可以為中空纖維膜、平板膜或螺捲式膜形式。glm模塊可以發(fā)揮吸收塔模塊和/或解吸塔模塊功能?；蛘?，模塊之一可以是glm模塊，而另一模塊可以構(gòu)成為使得氣相和液相處于直接接觸中或者換言之氣體-液體界面未由膜分開。此模塊類型也稱作直接氣體-液體接觸(dglc)模塊或僅直接接觸(dc)模塊。例如，dglc模塊可以為用容許氣體-液體接觸的填充材料填充的柱，和/或裝備有用于將氣體暴露于液體的入口的含液體容器(如氣泡柱)、和/或液體-噴霧(如噴霧塔)和/或充氣器模塊和/或降膜形式。dglc模塊可以發(fā)揮吸收塔模塊或解吸塔模塊功能。泡罩系統(tǒng)、篩板系統(tǒng)、圓盤-圓環(huán)柱(disk-and-doughnutcolumn)和填充柱是直接氣體-液體接觸模塊(dglc)的例子。

上文所描述的反應(yīng)器類型可以于任何期望的溫度操作。在一個實施方案中，反應(yīng)器以0℃-120℃或5℃-110℃、更優(yōu)選地10℃-100℃、更優(yōu)選地20℃-95℃、更優(yōu)選地30℃-90℃、更優(yōu)選地40℃-85℃、更優(yōu)選地50℃-80℃、更優(yōu)選地55℃-75℃、且最優(yōu)選地60℃-70℃的與碳酸酐酶接觸和/或含有碳酸酐酶的液體的溫度操作。

co2的吸收和解吸速率依賴于載體液體中的ph。在就本發(fā)明而言描述的反應(yīng)器類型中，co2貧乏的載體液體的ph是ph4-12，優(yōu)選地高于ph7(如于室溫，例如，20-25℃測量的)，更優(yōu)選地高于ph8，更優(yōu)選地8-12，更優(yōu)選地8-10.5，更優(yōu)選地8.5-10，甚至更優(yōu)選地9-9.5。由于吸收期間co2水合為碳酸(其在水中立即解離成碳酸氫鹽)，載體液體的ph隨著富含co2的載體液體的碳含量增加而降低。ph的程度隨載體液體的緩沖容量和吸收的co2量而降低。在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，載體液體是碳酸氫鹽緩沖液，如碳酸氫鈉、碳酸氫鉀、碳酸氫銫、碳酸氫銨或碳酸氫鹽的另一種合適的鹽，其中根據(jù)ph，或多或少量的碳酸鹽和/或碳酸會與碳酸氫鹽一起存在。

在本發(fā)明的一個實施方案中，富含co2的載體液體通到解吸階段，其中富含co2的載體液體的ph會隨co2釋放而升高。為了將載體液體再循環(huán)到此類吸收-解吸系統(tǒng)，優(yōu)選的是載體液體的ph回到co2貧乏的載體液體的ph，之后再次通到吸收階段。

在本發(fā)明的一個優(yōu)選的實施方案中，給反應(yīng)器裝備用于調(diào)節(jié)載體液體中ph的手段。這可以以幾種方式實施。一種方式是使用自動ph調(diào)節(jié)設(shè)備如自動滴定器將堿性物質(zhì)添加至載體液體，例如，在圖2中標示的輔助組分添加點之一(13a)處。優(yōu)選堿性物質(zhì)與在系統(tǒng)中循環(huán)載體液體具有相似的組成(例如，溶劑濃度、離子強度、碳酸酐酶量等)，并且可以在吸收前的任何時間時添加以調(diào)節(jié)ph。類似地，可以在解吸前的任何時間將中性至酸性物質(zhì)添加至載體液體，例如，在圖2中標示的輔助組分添加點之一(13b)處。若需要的話，可以從系統(tǒng)除去額外的載體液體，例如，在圖2中標示的除去點之一(14)處。

在上文所描述的co2捕獲過程中，本發(fā)明的persephonella碳酸酐酶可以與一種或多種其它碳酸酐酶組合。整個co2捕獲過程中的不同工藝步驟可以需要不同運行條件，例如，溫度、ph、載體液體組成、壓力，等等。本發(fā)明的碳酸酐酶可以與其它碳酸酐酶組合，所述其它碳酸酐酶于co2捕獲過程中需要的不同最佳條件運行。例如，一種碳酸酐酶可以在載體液體中循環(huán)，而不同碳酸酐酶可以在反應(yīng)器中的一個或多個位置處固定化。

本發(fā)明的碳酸酐酶或包含本發(fā)明碳酸酐酶的上文所描述基于酶的生物反應(yīng)器如在飛行員座艙、潛水艇艦、水生設(shè)備、安全和消防設(shè)備及宇航員太空服和人工肺裝置中也得到更加非常規(guī)的應(yīng)用以保持不含毒性co2水平的呼吸用空氣。其它應(yīng)用是從有限空間除去co2，如從啤酒廠內(nèi)和實施發(fā)酵的密閉建筑，以及從co2敏感性環(huán)境如博物館和圖書館降低危險co2水平，阻止過多的co2引起對書和藝術(shù)品的酸損害。又一種備選的應(yīng)用是從熱的環(huán)境空氣(例如在沙漠中)除去co2。在此情況中，碳酸酐酶可以例如包含在適合于從環(huán)境空氣提取co2的反應(yīng)器中，如記載于stolaroff等2008environ.sci.technol.,42,2728-2735的，此類反應(yīng)器可以例如采取“人工樹”或風(fēng)車形式，如記載于wo2008/041920的。

persephonella碳酸酐酶可以作為獨立的co2提取催化劑使用或者它可以備選地與常規(guī)的co2提取技術(shù)如經(jīng)由基于胺的溶劑或氨水或物理溶劑如selexol^tm(unioncarbide)或聚乙二醇醚的化學(xué)吸收組合。在本發(fā)明的又一個實施方案中，persephonella碳酸酐酶iscombined與二氧化碳吸收化合物如基于胺的化合物例如水性鏈烷醇胺，包括單乙醇胺(mea)、二乙醇胺(dea)、甲基二乙醇胺(mdea)、2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇(tris)、二甘醇胺(dga)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇(amp)、2-氨基-2-羥甲基-1,3-丙二醇(ahpd)、二異丙醇胺(dipa)、n-甲基氨基丙酸或n,n-二甲基氨基乙酸的水性可溶性鹽(例如鈉或鉀鹽)或n-甲基丙氨酸、n-甲基甘氨酸、β-丙氨酸(3-氨基丙酸)或其它天然或經(jīng)修飾的氨基酸(例如n-取代的氨基酸衍生物)、2-(2-氨乙基氨基)乙醇(aee)、三乙醇胺(tea)或其它基于伯、仲、叔或受阻胺的溶劑，包括那些在us4,112,052(在此通過提述并入)的第7頁至第9頁上描述的，或甘氨酸的水性可溶性鹽(例如甘氨酸鈉或鉀)和?；撬峄蚱渌后w吸收塔如水性naoh、koh、lioh、不同離子強度、摩爾濃度(范圍為稀釋溶液至高度濃縮的溶液，高至鹽的溶解度限度，其可以隨溫度而變化)的鹽碳酸鹽(例如鈉、鉀、或銨)或碳酸氫鹽鹽溶液，或水性電解質(zhì)溶液和促進劑如哌嗪、或聚乙二醇醚、或它們的混合物或其類似物或混合物。水性可溶性鹽和溶劑可以與ph緩沖和礦物螯合化合物，如磷酸鹽鹽、多磷酸鹽鹽和硼酸鹽鹽組合，以提供混合的鹽溶液，如碳酸氫鉀與磷酸鉀。水性可溶性鹽和溶劑可以與簡單的電解質(zhì)(例如堿鹵化物，如nacl、kcl、和金屬鹵化物，如zncl組合)。組合可以在上文所描述的生物反應(yīng)器中應(yīng)用或者它可以基于常規(guī)技術(shù)應(yīng)用于已經(jīng)存在的co2洗滌設(shè)施。在常規(guī)的生物反應(yīng)器中，鏈烷醇胺的濃度通常是15-30重量百分比。在本發(fā)明的一個實施方案中，鏈烷醇胺的濃度可以在常規(guī)的范圍中或者優(yōu)選地處于較低的濃度如優(yōu)選地低于15％(v/v)，更優(yōu)選地低于12％,10％,8％,6％,5％,4％,3％,2％,1％,0.5％,0.2％且最優(yōu)選地低于0.1％(v/v)。

在常規(guī)方法中，添加腐蝕和氧化抑制劑(如fluordaniel的專有econaminefg溶劑中含有的)以提供增加胺濃度，同時降低腐蝕風(fēng)險。無機腐蝕抑制劑包括釩(例如，偏釩酸鈉)、銻、銅、鈷、錫、和硫化合物。有機腐蝕抑制劑包括硫脲和水楊酸。

其它輔助載體液體組分可以包括潤濕劑、螯合劑(例如乙二胺四乙酸、多磷酸鹽鹽)、和減粘劑、及能夠提高co2進入或離開載體液體的流量的其它化合物。

在常規(guī)方法中，通常采用降低和/或避免泡沫形成的技術(shù)。這些包括在co2提取前除去引起泡沫的雜質(zhì)，并使用消泡劑和抑泡劑如硅酮化合物或高沸醇如油醇或辛基苯氧乙醇(a.kohl和r.nielsen,gaspurification,第5版,gulfprofessionalpublishing,houston,tx,1997:224-230)。

本發(fā)明的另一方面涉及沼氣生成，其中在沼氣發(fā)酵液中直接實施co2提取，作為將沼氣通到如上文所描述的生物反應(yīng)器的備選。通過將persephonella碳酸酐酶添加至厭氧培養(yǎng)基，可以將更多來自氣相的co2轉(zhuǎn)化成碳酸氫鹽，其是產(chǎn)甲烷古細菌生成甲烷的底物。特別地，甲烷八疊球菌屬(methanosarcina)經(jīng)常存在于嗜熱沼氣池中(mladenovska和ahring,2000,femsmicrobiol.ecol.3:225-229)。已經(jīng)對嗜熱甲烷八疊球菌(methanosarcinathermophila)tm-1顯示了碳酸氫鹽可以是甲烷生成的一項限制因素，例如低碳酸氫鹽溶液(0.6mm)中培養(yǎng)的嗜熱甲烷八疊球菌tm-1培養(yǎng)物在與含有高10倍的碳酸氫鹽劑量(6mm)的培養(yǎng)物相比時顯示相當(dāng)長的延滯期(即，甲烷生成較晚開始)。另外，甲烷的總產(chǎn)量在較低碳酸氫鹽劑量時小25倍(murray和zinder,1985,appl.environ.microbiol.50:49-55)。因此，若使用一種或多種嗜熱微生物，例如產(chǎn)甲烷菌，如可以使用co2/碳酸氫鹽作為生長和產(chǎn)甲烷碳源的甲烷八疊球菌物種于升高的溫度實施沼氣生成，則熱穩(wěn)定性碳酸酐酶會是特別有用的。

本發(fā)明的又一個實施方案是本發(fā)明的persephonella碳酸酐酶作為添加劑在沼氣發(fā)酵液中的用途。

本發(fā)明的又一個實施方案是persephonella碳酸酐酶增強藻類和其它利用碳酸氫鹽作為碳源的其它水生植物生長的用途，其通過在水生植物環(huán)境中或者為了遞送至水生植物環(huán)境將co2轉(zhuǎn)化成碳酸氫鹽來進行。例如，可以使用此辦法來同時從燃燒排出氣，如煙道氣體除去co2，并為轉(zhuǎn)化成碳酸氫鹽提供co2，其通過使排出氣與來自養(yǎng)殖池的液體接觸來進行。培養(yǎng)藻類和水生植物的某些辦法牽涉使用密閉管或淺槽或池，其中來自陽光的熱提高水溫。因此，熱穩(wěn)定性碳酸酐酶于升高的培養(yǎng)溫度是特別有用的。

多核苷酸

本發(fā)明還涉及編碼具有碳酸酐酶活性的多肽的分離的或合成的多核苷酸。

用于分離或克隆編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，并且包括自基因組dna分離、自cdna制備、或其組合?？梢岳缛缦聦崿F(xiàn)自此類基因組dna克隆多核苷酸，即使用公知的聚合酶鏈式反應(yīng)(pcr)或者表達文庫的抗體篩選以檢測具有共享結(jié)構(gòu)特征的克隆dna片段。見例如innis等,1990,pcr:aguidetomethodsandapplication,academicpress,newyork。可以使用其它核酸擴增規(guī)程如連接酶鏈式反應(yīng)(lcr)、連接活化的轉(zhuǎn)錄(lat)和基于多核苷酸的擴增(nasba)?？梢詮膒ersephonella菌株，或另一種或相關(guān)生物體克隆多核苷酸，并且如此，例如其可以是多核苷酸的多肽編碼區(qū)的等位或物種變體。

在一個優(yōu)選的實施方案中，本發(fā)明的多核苷酸是合成的多核苷酸，其已經(jīng)經(jīng)過密碼子優(yōu)化以提高在選定宿主細胞中的表達。宿主細胞可以選自下文部分“宿主細胞”。在一個優(yōu)選的實施方案中，宿主細胞是芽孢桿菌屬的，更優(yōu)選地它是物種枯草芽孢桿菌的。

用于密碼子優(yōu)化編碼多肽的多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中已知的，并且記載于例如wo2006/066595及gustafsson等,2004,trendsinbiotechnology22:346-353。

本發(fā)明還涉及編碼具有碳酸酐酶活性的多肽的分離的或合成的多核苷酸，其中多核苷酸選自下組：a)通過seqidno:1密碼子優(yōu)化獲得的多核苷酸，其中經(jīng)密碼子優(yōu)化的多核苷酸的核苷酸序列與seqidno:1是至少60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％相同的；或b)具有與seqidno:3的核酸殘基88至653對應(yīng)的核苷酸序列的多核苷酸；或c)與seqidno:3的核酸殘基88至653至少85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％,99％或100％相同的多核苷酸；或d)(a)或(b)中編碼具有碳酸酐酶活性的多肽的片段。

在一方面，多核苷酸包含seqidno:3或seqidno:3的核酸殘基88至653或seqidno:3中編碼具有碳酸酐酶活性的seqidno:4片段的亞序列或由其組成。

核酸構(gòu)建體

本發(fā)明還涉及包含與一個或多個(幾個)控制序列可操作連接的本發(fā)明多核苷酸的核酸構(gòu)建體，所述控制序列在與控制序列相容的條件下在適合的宿主細胞中指導(dǎo)編碼序列的表達。

可以以多種方式操作多核苷酸以提供多肽的表達。根據(jù)表達載體，多核苷酸在其插入載體中前的操作可以是期望的或必需的。利用重組dna方法修飾多核苷酸的技術(shù)是本領(lǐng)域中公知的。

控制序列可以是啟動子序列，即由宿主細胞識別以表達編碼本發(fā)明多肽的多核苷酸的多核苷酸。啟動子序列含有介導(dǎo)多肽表達的轉(zhuǎn)錄控制序列。啟動子可以是在選擇的宿主細胞中顯示轉(zhuǎn)錄活性的任何多核苷酸，包括突變體、截短的、和雜合啟動子，并且可以獲自編碼對于宿主細胞同源或異源的胞外或胞內(nèi)多肽的基因。

適合于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在細菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子的例子是獲自解淀粉芽孢桿菌(bacillusamyloliquefaciens)α-淀粉酶基因(amyq)、地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)α-淀粉酶基因(amyl)、地衣芽孢桿菌青霉素酶基因(penp)、嗜熱脂肪芽孢桿菌(bacillusstearothermophilus)麥芽糖源性淀粉酶基因(amym)、枯草芽孢桿菌果聚糖蔗糖酶基因(sacb)、枯草芽孢桿菌xyla和xylb基因、大腸桿菌lac操縱子、天藍色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)瓊脂糖酶基因(daga)、和原核β-內(nèi)酰胺酶基因(villa-kamaroff等,1978,proc.natl.acad.sci.usa75:3727-3731)，及tac啟動子(deboer等,1983,proc.natl.acad.sci.usa80:21-25)的啟動子。其它啟動子記載于“usefulproteinsfromrecombinantbacteria”于gilbert等,1980,scientificamerican,242:74-94；及于sambrook等,1989,見上文。

適合于指導(dǎo)本發(fā)明的核酸構(gòu)建體在絲狀真菌宿主細胞中轉(zhuǎn)錄的啟動子的例子是獲自構(gòu)巢曲霉(aspergillusnidulans)乙酰胺酶、黑曲霉(aspergillusniger)中性α-淀粉酶、黑曲霉酸穩(wěn)定性α-淀粉酶、黑曲霉或泡盛曲霉(aspergillusawamori)葡糖淀粉酶(glaa)、米曲霉(aspergillusoryzae)taka淀粉酶、米曲霉堿性蛋白酶、米曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶、尖鐮孢(fusariumoxysporum)胰蛋白酶樣蛋白酶(wo96/00787)、鑲片鐮孢(fusariumvenenatum)淀粉葡萄糖苷酶(wo00/56900)、鑲片鐮孢daria(wo00/56900)、鑲片鐮孢quinn(wo00/56900)、曼赫根毛霉(rhizomucormiehei)脂肪酶、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、里氏木霉(trichodermareesei)β-糖苷酶、里氏木霉纖維素生物水解酶i、里氏木霉纖維素生物水解酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶i、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶ii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iii、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶iv、里氏木霉內(nèi)切葡聚糖酶v、里氏木霉木聚糖酶i、里氏木霉木聚糖酶ii、里氏木霉β-木糖苷酶基因的啟動子、及na2-tpi啟動子(一種經(jīng)修飾的啟動子，其包含編碼曲霉中的中性α-淀粉酶的基因，其中非翻譯前導(dǎo)物已經(jīng)用來自編碼曲霉中丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的非翻譯前導(dǎo)物替換；非限制性例子包括包含黑曲霉中中性α-淀粉酶的基因的經(jīng)修飾的啟動子，其中非翻譯前導(dǎo)物已經(jīng)用來自編碼構(gòu)巢曲霉或米曲霉中丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因的非翻譯前導(dǎo)物替換)；及其突變體、截短的、和雜合啟動子。

在酵母宿主中，有用的啟動子獲自釀酒酵母(saccharomycescerevisiae)烯醇化酶(eno-1)、釀酒酵母半乳糖激酶(gal1)、釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(adh1,adh2/gap)、釀酒酵母丙糖磷酸異構(gòu)酶(tpi)、釀酒酵母金屬硫蛋白(cup1)、和釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶的基因。其它對于酵母宿主細胞有用的啟動子由romanos等,1992,yeast8:423-488描述。

控制序列也可以是合適的轉(zhuǎn)錄終止子序列，其由宿主細胞識別以終止轉(zhuǎn)錄。終止子序列與編碼多肽的多核苷酸的3端可操作連接。在選擇的宿主細胞中功能性的任何終止子可以在本發(fā)明中使用。

絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選終止子獲自構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、黑曲霉α-糖苷酶、米曲霉taka淀粉酶、和尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶基因。

用于酵母宿主細胞的優(yōu)選終止子獲自釀酒酵母烯醇化酶、釀酒酵母細胞色素c(cyc1)、和釀酒酵母甘油醛-3-磷酸脫氫酶的基因。其它對于酵母宿主細胞有用的終止子由romanos等,1992,見上文描述。

控制序列也可以是合適的前導(dǎo)序列，其在轉(zhuǎn)錄時是對于宿主細胞翻譯重要的mrna非翻譯區(qū)。前導(dǎo)序列與編碼多肽的多核苷酸的5’端可操作連接?？梢允褂迷谶x擇的宿主細胞中功能性的任何前導(dǎo)序列。

用于絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選前導(dǎo)物獲自米曲霉taka淀粉酶和構(gòu)巢曲霉丙糖磷酸異構(gòu)酶的基因。

適合于酵母宿主細胞的前導(dǎo)物獲自釀酒酵母烯醇化酶(eno-1)、釀酒酵母3-磷酸甘油酸激酶、釀酒酵母α-因子、和釀酒酵母醇脫氫酶/甘油醛-3-磷酸脫氫酶(adh2/gap)的基因。

控制序列也可以是多聚腺苷酸化序列，即與多核苷酸的3’端可操作連接的序列，并且在轉(zhuǎn)錄時被宿主細胞識別為對轉(zhuǎn)錄的mrna添加多聚腺苷酸殘基的信號?？梢允褂迷谶x擇的宿主細胞中功能性的任何多聚腺苷酸化序列。

用于絲狀真菌宿主細胞的優(yōu)選多聚腺苷酸化序列獲自米曲霉taka淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、構(gòu)巢曲霉鄰氨基苯甲酸合酶、尖孢鐮孢胰蛋白酶樣蛋白酶、和黑曲霉α-葡萄糖苷酶的基因。

對于酵母宿主細胞有用的多聚腺苷酸化序列由guo和sherman,1995,mol.cellularbiol.15:5983-5990描述。

控制序列也可以是信號肽編碼區(qū)，其編碼與多肽的n端連接的信號肽，并且指導(dǎo)多肽進入細胞分泌途徑。多核苷酸編碼序列的5’端可以固有含有在翻譯閱讀框中與編碼多肽的編碼序列段天然連接的信號肽編碼序列。或者，編碼序列的5’端可以含有對于編碼序列而言外來的信號肽編碼序列。在編碼序列不天然含有信號肽編碼序列的情況中可能需要外來的信號肽編碼序列?；蛘撸鈦淼男盘栯木幋a序列可以簡單替換天然的信號肽編碼序列以增強多肽的分泌。然而，可以使用指導(dǎo)表達的多肽進入選擇的宿主細胞的分泌途徑中的任何信號肽編碼序列。

對于細菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是獲自芽孢桿菌ncib11837麥芽糖源性淀粉酶、地衣芽孢桿菌枯草桿菌蛋白酶、地衣芽孢桿菌β-內(nèi)酰胺酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌α-淀粉酶、嗜熱脂肪芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt,nprs,nprm)、和枯草芽孢桿菌prsa基因的信號肽編碼序列。其它信號肽由simonen和palva,1993,microbiologicalreviews57:109-137描述。

對于絲狀真菌宿主細胞有效的信號肽編碼序列是獲自黑曲霉中性淀粉酶、黑曲霉葡糖淀粉酶、米曲霉taka淀粉酶、特異腐質(zhì)霉(humicolainsolens)纖維素酶、特異腐質(zhì)霉內(nèi)切葡聚糖酶v、疏棉狀腐質(zhì)霉(humicolalanuginosa)脂肪酶、和曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶基因的信號肽編碼序列。

對于酵母宿主細胞有用的信號肽獲自釀酒酵母α-因子和釀酒酵母轉(zhuǎn)化酶的基因。其它有用的信號肽編碼序列由romanos等,1992,見上文描述。

控制序列也可以是前肽編碼序列，其編碼位于多肽n段的前肽。所得的多肽稱為酶原或多肽原(或在一些情況中為酶原)。多肽原一般是無活性的，并且可以通過從多肽原催化或自身催化切割前肽而轉(zhuǎn)化成活性多肽。前肽編碼序列可以獲自枯草芽孢桿菌堿性蛋白酶(apre)、枯草芽孢桿菌中性蛋白酶(nprt)、嗜熱毀絲霉(myceliophthorathermophila)漆酶(wo95/33836)、曼赫根毛霉天冬氨酸蛋白酶、和釀酒酵母α-因子的基因。

在信號肽和前肽序列兩者都存在于多肽n端的情況中，前肽序列緊鄰多肽n端定位，而信號肽序列緊鄰前肽序列n端定位。

也可以期望添加調(diào)節(jié)序列，其容許調(diào)節(jié)相對于宿主細胞生長的多肽表達。調(diào)節(jié)系統(tǒng)的例子是那些引起基因表達響應(yīng)化學(xué)或物理刺激(包括調(diào)節(jié)化合物的存在)而開啟或關(guān)閉的。原核系統(tǒng)中的調(diào)節(jié)系統(tǒng)包括lac、tac、和trp操縱基因系統(tǒng)。在酵母中，可以使用adh2系統(tǒng)或gal1系統(tǒng)。在絲狀真菌中，可以使用黑曲霉葡糖淀粉酶啟動子、米曲霉takaα-淀粉酶啟動子、和米曲霉葡糖淀粉酶啟動子。調(diào)節(jié)序列的其它例子是那些容許基因擴增的。在真核系統(tǒng)中，這些調(diào)節(jié)序列包括在存在甲氨蝶呤的情況中擴增的二氫葉酸還原酶基因，和在重金屬情況下擴增的金屬硫蛋白基因。在這些情況中，編碼多肽的多核苷酸會與調(diào)節(jié)序列可操作連接。

表達載體

本發(fā)明還涉及重組表達載體，其包含本發(fā)明的多核苷酸、啟動子、和轉(zhuǎn)錄和翻譯終止信號?？梢詫⒏鞣N核苷酸和控制序列連接在一起以生成重組表達載體，其可以包含一個或多個(幾個)方便的限制性位點以容許在此類位點處插入或取代編碼多肽的多核苷酸。

或者，可以通過將多核苷酸或包含該序列的核酸構(gòu)建體插入適合于表達的載體中來表達多核苷酸。在創(chuàng)建表達載體中，編碼序列位于載體中，使得編碼序列與適合于表達的控制序列可操作連接。

重組表達載體可以是任何載體(例如，質(zhì)粒或病毒)，其可以方便地進行重組dna規(guī)程，而且可以引起多核苷酸的表達。載體的選擇通常會依賴于載體與要接受載體導(dǎo)入的宿主細胞的相容性。載體可以是線性或閉合環(huán)狀質(zhì)粒。

載體可以是其復(fù)制不依賴于染色體復(fù)制的自主復(fù)制型載體，即以染色體外實體存在的載體，例如，質(zhì)粒、染色體外元件、微型染色體、或人工染色體。載體可以含有用于確保自身復(fù)制的任何手段?；蛘?，載體可以是在導(dǎo)入宿主細胞中時整合入基因組中，并且與已經(jīng)接受其整合的染色體一起復(fù)制的載體。此外，可以使用單一載體或質(zhì)?；蚬餐幸胨拗骷毎蚪M中的總dna的兩個以上載體或質(zhì)粒，或轉(zhuǎn)座子。

優(yōu)選載體含有一個或多個(幾個)選擇標志，其容許容易地選擇經(jīng)轉(zhuǎn)化的、經(jīng)轉(zhuǎn)染的、經(jīng)轉(zhuǎn)導(dǎo)的細胞，等等。選擇標志是一種如下的基因，其產(chǎn)物提供殺生物劑或病毒抗性、對重金屬的抗性、對營養(yǎng)缺陷型的原養(yǎng)性，等等。

細菌選擇標志的例子是來自枯草芽孢桿菌或地衣芽孢桿菌的dal基因、或賦予抗生素抗性如氨芐青霉素、氯霉素、卡那霉素、或四環(huán)素抗性的標志物。適合于酵母宿主細胞的標志物是ade2、his3、leu2、lys2、met3、trp1、和ura3。在絲狀真菌宿主細胞中使用的選擇標志包括但不限于amds(乙酰胺酶)、argb(鳥氨酸氨甲酰轉(zhuǎn)移酶)、bar(膦絲菌素乙酰轉(zhuǎn)移酶)、hph(潮霉素磷酸轉(zhuǎn)移酶)、niad(硝酸還原酶)、pyrg(乳清苷-5’-磷酸脫羧酶)、sc(硫酸腺嘌呤轉(zhuǎn)移酶)、trpc(鄰氨基苯甲酸合酶)、及其等同物。優(yōu)選用于曲霉細胞的是構(gòu)巢曲霉或米曲霉的amds和pyrg基因和吸水鏈霉菌(streptomyceshygroscopicus)的bar基因。

優(yōu)選載體含有容許載體整合入宿主細胞基因組中或載體在細胞中不依賴于基因組的自主復(fù)制的元件。

對于整合入宿主細胞基因組中，載體可以依賴于編碼多肽的核苷酸序列或載體中通過同源或非同源重組來整合入基因組中的任何其它元件?；蛘撸d體可以含有用于指導(dǎo)通過同源重組在染色體中的精確位置處整合入宿主細胞基因組中的其它核苷酸序列。其它核苷酸序列使載體能夠在染色體中的精確位置處整合入宿主細胞基因組中。為了增加在精確位置處整合的可能性，整合元件應(yīng)當(dāng)含有足夠數(shù)目的核酸，如100至10,000個堿基對、400至10,000個堿基對和800至10,000個堿基對，其與相應(yīng)的靶序列具有高度序列同一性，以增強同源重組的可能性。整合元件可以是與宿主細胞基因組中的靶序列同源的任何序列。此外，整合元件可以是非編碼或編碼多核苷酸。另一方面，可以通過非同源重組將載體整合入宿主細胞基因組中。

為了自主復(fù)制，載體可以進一步包含復(fù)制起點，其使載體能夠在所討論的宿主細胞中自主復(fù)制。復(fù)制起點可以是在細胞中發(fā)揮功能的介導(dǎo)自主復(fù)制的任何質(zhì)粒復(fù)制子。術(shù)語“復(fù)制起點”或“質(zhì)粒復(fù)制子”意指使質(zhì)?；蜉d體能夠在體內(nèi)復(fù)制的多核苷酸。

細菌復(fù)制起點的例子是質(zhì)粒pbr322、puc19、pacyc177、和pacyc184(容許在大腸桿菌中復(fù)制)，和pub110、pe194、pta1060、和pamβ1(容許在芽孢桿菌中復(fù)制)的復(fù)制起點。

用于酵母宿主細胞的復(fù)制起點的例子是2微米復(fù)制起點、ars1、ars4、ars1和cen3的組合、以及ars4和cen6的組合。

可用于絲狀真菌細胞的復(fù)制起點的例子是ama1和ans1(gems等,1991,gene98:61-67；cullen等,1987,nucleicacidsres.15:9163-9175；wo00/24883)?？梢砸勒誻o00/24883中披露的方法來實現(xiàn)ama1基因的分離和包含該基因的質(zhì)?；蜉d體的構(gòu)建。

可以將超過一個拷貝的本發(fā)明多核苷酸插入宿主細胞中以提高多肽的生成?？梢匀缦芦@得多核苷酸的拷貝數(shù)目增加，即將至少一個額外拷貝的序列整合入宿主細胞基因組中或者與核苷酸序列一起納入可擴增選擇標志基因，其中可以通過在存在合適的選擇劑的情況中培養(yǎng)細胞來選擇含有選擇標志基因的擴增拷貝，及由此額外拷貝的多核苷酸的細胞。

用于連接上文所描述的元件以構(gòu)建本發(fā)明的重組表達載體的規(guī)程是本領(lǐng)域技術(shù)人員公知的(見例如sambrook等,1989,見上文)。

宿主細胞

本發(fā)明還涉及重組宿主細胞，其包含與一個或多個(幾個)控制序列可操作連接的本發(fā)明的多核苷酸，所述控制序列指導(dǎo)本發(fā)明的多肽生成?？梢詫嗪塑账岬臉?gòu)建體或載體導(dǎo)入宿主細胞中，使得將構(gòu)建體或載體作為染色體整合物或作為自身復(fù)制型染色體外載體維持，如較早描述的。術(shù)語“宿主細胞”涵蓋由于復(fù)制期間發(fā)生的突變而與親本細胞不同的任何親本細胞后代。宿主細胞的選擇在很大程度上會取決于編碼多肽的基因及其來源。

宿主細胞可以是可用于重組生成本發(fā)明多肽的任何細胞，例如，原核生物或真核生物。

原核宿主細胞可以是任何革蘭氏陽性或革蘭氏陰性細菌。革蘭氏陽性細菌包括但不限于芽孢桿菌屬、梭菌屬(clostridium)、腸球菌屬(enterococcus)、地芽孢桿菌屬(geobacillus)、乳桿菌屬(lactobacillus)、乳球菌屬(lactococcus)、海洋芽孢桿菌屬(oceanobacillus)、葡萄球菌屬(staphylococcus)、鏈球菌屬(streptococcus)、和鏈霉菌屬(streptomyces)。革蘭氏陰性細菌包括但不限于彎曲桿菌屬(campylobacter)、大腸桿菌、黃桿菌屬(flavobacterium)、梭桿菌屬(fusobacterium)、螺桿菌屬(helicobacter)、泥桿菌屬(ilyobacter)、奈瑟氏球菌屬(neisseria)、假單胞菌屬(pseudomonas)、沙門氏菌屬(salmonella)、和脲原體屬(ureaplasma)。

細菌宿主細胞可以是任何芽孢桿菌細胞，包括但不限于堿性桿菌(bacillusalkalophilus)、解淀粉芽孢桿菌、短芽孢桿菌(bacillusbrevis)、環(huán)狀芽孢桿菌(bacilluscirculans)、克勞氏芽孢桿菌、凝結(jié)芽孢桿菌(bacilluscoagulans)、堅強芽孢桿菌(bacillusfirmus)、燦爛芽孢桿菌(bacilluslautus)、遲緩芽孢桿菌(bacilluslentus)、地衣芽孢桿菌、巨大芽孢桿菌(bacillusmegaterium)、短小芽孢桿菌(bacilluspumilus)、嗜熱脂肪芽孢桿菌、枯草芽孢桿菌、和蘇云金芽孢桿菌(bacillusthuringiensis)細胞。

細菌宿主細胞也可以是任何鏈球菌細胞，包括但不限于似馬鏈球菌(streptococcusequisimilis)、釀膿鏈球菌(streptococcuspyogenes)、乳房鏈球菌(streptococcusuberis)、和馬鏈球菌獸瘟亞種(streptococcusequisubsp.zooepidemicus)細胞。

細菌宿主細胞也可以是任何鏈霉菌細胞，包括但不限于不產(chǎn)色鏈霉菌(streptomycesachromogenes)、除蟲鏈霉菌(streptomycesavermitilis)、天藍色鏈霉菌(streptomycescoelicolor)、灰色鏈霉菌(streptomycesgriseus)、和淺青紫鏈霉菌(streptomyceslividans)細胞。

可以例如通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(見例如chang和cohen,1979,mol.gen.genet.168:111-115)、通過使用感受態(tài)細胞(見例如young和spizizen,1961,j.bacteriol.81:823-829,或dubnau和davidoff-abelson,1971,j.mol.biol.56:209-221)、通過電穿孔(見例如shigekawa和dower,1988,biotechniques6:742-751)、或通過接合(見例如koehler和thorne,1987,j.bacteriol.169:5271-5278)實現(xiàn)dna對芽孢桿菌細胞的導(dǎo)入。例如，可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(見例如hanahan,1983,j.mol.biol.166:557-580)或電穿孔(見例如dower等,1988,nucleicacidsres.16:6127-6145)實現(xiàn)dna對大腸桿菌細胞的導(dǎo)入。例如，可以通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化和電穿孔(見例如gong等,2004,foliamicrobiol.(praha)49:399-405)，通過接合(見例如mazodier等,1989,j.bacteriol.171:3583-3585)，或者通過轉(zhuǎn)導(dǎo)(見例如burke等,2001,proc.natl.acad.sci.usa98:6289-6294)實現(xiàn)dna對鏈霉菌細胞的導(dǎo)入。例如，可以通過電穿孔(見例如choi等,2006,j.microbiol.methods64:391-397)或通過接合(見例如pinedo和smets,2005,appl.environ.microbiol.71:51-57)實現(xiàn)dna對假單胞菌細胞的導(dǎo)入。例如，可以通過天然感受態(tài)(見例如perryandkuramitsu,1981,infect.immun.32:1295-1297)，通過原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化(見例如cattandjollick,1991,microbios68:189-207，通過電穿孔(見例如buckley等,1999,appl.environ.microbiol.65:3800-3804)或通過接合(見例如clewell,1981,microbiol.rev.45:409-436)實現(xiàn)dna對鏈球菌細胞的導(dǎo)入。然而，可以使用本領(lǐng)域中已知的用于將dna導(dǎo)入宿主細胞中的任何方法。

生成方法

本發(fā)明還涉及生成本發(fā)明多肽的方法，包括：(a)在有益于多肽生成的條件下培養(yǎng)細胞，其在其野生型形式中生成多肽；并(b)回收多肽。在一個優(yōu)選的方面，細胞是persephonella屬的。在一個更優(yōu)選的方面，細胞是persephonellamarina、persephonellahydrogeniphila或persephonellaguaymasensis。在一個最優(yōu)選的方面，細胞是persephonellamarinadsm14350、persephonellahydrogeniphiladsm15103或persephonellaguaymasensisdsm14351。

本發(fā)明還涉及生成本發(fā)明多肽的方法，包括：(a)在有益于多肽生成的條件下培養(yǎng)本發(fā)明的重組宿主細胞；并(b)回收多肽。

使用本領(lǐng)域中公知的方法在適合于多肽生成的營養(yǎng)培養(yǎng)基中培養(yǎng)宿主細胞。例如，可以通過搖瓶培養(yǎng)培養(yǎng)細胞，并在合適培養(yǎng)基中且在容許多肽表達和/或分離的條件下實施實驗室或工業(yè)發(fā)酵罐中的小規(guī)?；虼笠?guī)模發(fā)酵(包括連續(xù)、分批、補料-分批、或固態(tài)發(fā)酵)。使用本領(lǐng)域中已知的規(guī)程在包含碳源和氮源及無機鹽的合適營養(yǎng)培養(yǎng)基中發(fā)生培養(yǎng)。合適的培養(yǎng)基可購自商業(yè)供應(yīng)商或者可以依照公開的組成制備(例如，在美國典型培養(yǎng)物保藏中心(americantypeculturecollection)的目錄中)。若多肽分泌到營養(yǎng)培養(yǎng)基中，則可以自培養(yǎng)基直接回收多肽。若多肽不是分泌性的，則可以自細胞裂解物將其回收。

使用本領(lǐng)域中已知的對多肽特異性的方法來檢測多肽。這些檢測方法可以包括使用特異性抗體、形成酶產(chǎn)物、或者酶底物消失。例如，可以使用酶測定法來測定多肽的活性。

可以使用本領(lǐng)域中已知的方法來回收多肽。例如，可以通過常規(guī)的規(guī)程，包括但不限于離心、過濾、提取、噴霧-干燥、蒸發(fā)、或沉淀自營養(yǎng)培養(yǎng)基回收多肽。

可以通過本領(lǐng)域中已知的多種規(guī)程純化多肽，所述規(guī)程包括但不限于層析(例如，離子交換、親和、疏水性、色譜聚焦、和大小排阻)、電泳規(guī)程(例如，制備用等電聚焦)、差別溶解度(例如，硫酸銨沉淀)、sds-page、或提取(見例如proteinpurification,j.-c.janson和larsryden編,vchpublishers,newyork,1989)以獲得基本上純的多肽。

在一個備選的方面，可以自宿主細胞與其它多肽和/或發(fā)酵產(chǎn)物一起生成本發(fā)明的多肽以提供非純化的或最小程度純化的混合物，其生成可能沒有基本上純的多肽昂貴，同時仍提供期望的碳酸酐酶性能。

在一個備選的方面，不回收多肽，而是使用表達多肽的本發(fā)明宿主細胞作為多肽的來源。

包含多肽的組合物及其制備方法

本發(fā)明提供了包含本發(fā)明persephonella碳酸酐酶和優(yōu)選地賦形劑的組合物及用于制備所述組合物的方法，所述方法包括混合本發(fā)明的多肽與賦形劑。

在一個具體的實施方案中，本發(fā)明的persephonella碳酸酐酶是組合物的主要(多肽)組分，例如，單組分組合物。在一種單組分組合物中，本發(fā)明的persephonella碳酸酐酶優(yōu)選地構(gòu)成至少80％的碳酸酐酶活性，更優(yōu)選至少90％，甚至更優(yōu)選至少95％，且最優(yōu)選地100％碳酸酐酶活性。此背景中的賦形劑應(yīng)當(dāng)理解為用于配制組合物的任何輔助劑或化合物，并且包括溶劑(例如，水、無機鹽、填充劑、色素、蠟)、載體、穩(wěn)定劑、交聯(lián)劑、粘合劑、防腐劑、緩沖劑，等等。

組合物可以進一步包含一種或多種其它酶，如一種或多種其它碳酸酐酶、脫羧酶、漆酶、或氧化酶。

組合物可以依照本領(lǐng)域中已知的方法來制備，并且可以為液體或固體組合物形式。例如，可以使用本領(lǐng)域已知的將技術(shù)酶和/或藥用產(chǎn)品例如配制成包被或未包被的顆粒劑或微顆粒劑的方法來配制酶組合物。如此，本發(fā)明的多肽可以以顆粒劑，優(yōu)選地非粉化顆粒劑、液體，特別是固定化液體、漿體或受保護的多肽形式提供。

對于某些應(yīng)用，多肽的固定化可以是優(yōu)選的。固定化酶包含兩種基本功能，即設(shè)計為幫助分離(例如自應(yīng)用環(huán)境分離催化劑、再使用催化劑及控制過程)的非催化功能和設(shè)計為在期望的時間和空間里催化靶化合物(或底物)的催化功能(cao,carrier-boundimmobilizedenzymes:principles,applicationsanddesign,wiley-vchverlaggmbh&co.kgaa,weinheim,germany,2005)。在酶被固定化時，使得它對于其幫助轉(zhuǎn)化的靶化合物(例如，底物)及對于使用的溶劑不可溶?？梢苑珠_固定化酶產(chǎn)物與應(yīng)用環(huán)境以便于其再使用，或者以降低需要的酶量，或者以在底物連續(xù)遞送并自酶附近不斷取出產(chǎn)物的過程中使用酶，這例如降低酶成本。此外，經(jīng)常通過固定化來使酶穩(wěn)定化。牽涉固定化酶的方法經(jīng)常是連續(xù)的，其便于容易的過程控制?？梢酝ㄟ^機械手段作為異質(zhì)催化劑，或者通過在明確空間中納入保留固定化酶。后者可以通過微囊化(例如，在半透膜中)或者通過使用例如中空纖維模塊等在uf系統(tǒng)中納入來完成。通常也使用多孔載體上的固定化。這包括例如通過吸附、復(fù)合物/離子/共價結(jié)合來使酶結(jié)合至載體，或者僅將可溶性酶在載體上簡單吸附及隨后除去溶劑。也可以使用酶交聯(lián)作為固定化的手段。在工業(yè)上也應(yīng)用通過納入載體中使酶固定化(buchholz等,biocatalystsandenzymetechnology,wiley-vchverlaggmbh&co.kgaa,weinheim,germany,2005)。使酶如碳酸酐酶固定化的具體方法包括但不限于與包含多功能性胺的液體介質(zhì)和包含交聯(lián)劑的液體介質(zhì)一起將酶噴霧到微粒多孔載體上，如記載于wo2007/036235(在此通過提述并入)的，將碳酸酐酶及交聯(lián)劑(例如，戊二醛)與卵清蛋白層連接，其繼而粘附于聚合支持物上的粘著層，如記載于wo2005/114417(在此通過提述并入)的，或者將碳酸酐酶與硅土載體(如記載于美國專利no.5,776,741的)或者與硅烷，或者cnbr活化的載體表面如玻璃偶聯(lián)，碳酸酐酶與聚合物珠上的甲基丙烯酸酯的共聚合，如記載于bhattacharya等,2003,biotechnol.appl.biochem.38:111-117(在此通過提述并入)的，或者使用球狀蛋白和粘合劑，如記載于us2010/068784的。也可以使用標簽如組氨酸樣標簽(例如，6xhis標簽或hq標簽)或纖維素結(jié)合模塊(cbm)來固定化碳酸酐酶(liu等,2008,biotechnol.prog.25:68-74)。

本發(fā)明的一個實施方案是包含適合于固定化的基質(zhì)和選自下組的碳酸酐酶的組合物：

a)源自persephonellamarinadsm14350或可由persephonellamarinadsm14350生成；或

b)具有與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251對應(yīng)的氨基酸序列的多肽；或

c)與seqidno:2的氨基酸殘基20至243或seqidno:4的氨基酸殘基29至251至少60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％相同的多肽；或

d)(a)、(b)或(c)中具有碳酸酐酶活性的片段；或

e)由在非常低的、低的、中等的、中等-高的或高的嚴格性條件下與下列多核苷酸序列雜交的核酸序列編碼的多肽：

i)編碼seqidno:2或seqidno:4的成熟多肽的多核苷酸序列；或

ii)seqidno:1或seqidno:3的多核苷酸序列；或

iii)(i)或(ii)中至少100個連續(xù)核苷酸的亞序列；或

iv)(i)或(ii)的互補鏈；或

f)由如下的核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列由于遺傳密碼簡并性不與seqidno:1或seqidno:3的多核苷酸序列雜交，但其編碼具有依照b)或c)的氨基酸序列的多肽；或

g)由如下的核酸序列編碼的多肽，所述核酸序列與seqidno:1或seqidno:3至少60％,65％,70％,75％,80％,85％,90％,91％,92％,93％,94％,95％,96％,97％,98％或99％相同。

在本發(fā)明的又一個實施方案中，在基質(zhì)上固定化碳酸酐酶?；|(zhì)可以例如選自下組：珠、織物、纖維、中空纖維、膜、微粒、多孔表面、棒、整裝填料和管。合適基質(zhì)的具體例子包括氧化鋁、膨潤土、生物聚合體、碳酸鈣、磷酸鈣凝膠、碳、纖維素、陶器支持物、粘土、膠原、玻璃、羥磷灰石、離子交換樹脂、高嶺土、尼龍、酚聚合物、聚氨苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚合物水凝膠、sephadex、sepharose、硅土凝膠、沉淀的硅土、和teflon牌ptfe。在本發(fā)明的一個實施方案中，依照methodsinenzymologyvolumexliv(章節(jié)：immobilizedenzymes,第118頁-第134頁,klausmosbach編,academicpress,newyork,1976)(在此通過提述并入)中描述的技術(shù)將碳酸酐酶在尼龍基質(zhì)上固定化。

可以依照本領(lǐng)域中已知的方法來穩(wěn)定化要在組合物中包含的多肽，例如，通過添加抗氧化劑或還原劑以限制多肽的氧化來穩(wěn)定化組合物中的多肽，或者可以通過添加聚合物如pvp、pva、peg、糖、寡聚物、多糖或已知對于固體或液體組合物中的多肽穩(wěn)定性有益的其它合適的聚合物來使其穩(wěn)定化或者可以通過添加酶活性位點中存在的穩(wěn)定化離子，例如鋅(例如氯化鋅或硫酸鋅)來使其穩(wěn)定化。可以添加防腐劑，如proxel或青霉素以延長貨架期或應(yīng)用中的性能。

在本發(fā)明的實施方案中，通過吸附到基質(zhì)、表面或基片上固定化碳酸酐酶?；|(zhì)、表面或基片的非限制性例子包括那些來自下組的：珠、織物、纖維、中空纖維、膜、微粒、多孔表面、棒、整裝填料和管。合適的基質(zhì)、表面或基片的具體例子包括氧化鋁、膨潤土、生物聚合體、碳酸鈣、磷酸鈣凝膠、碳、纖維素、陶器支持物、粘土、膠原、玻璃、羥磷灰石、離子交換樹脂、高嶺土、尼龍、酚聚合物、聚氨苯乙烯、聚丙烯酰胺、聚丙烯、聚丙烯腈(丙烯酸樹脂)、聚乙烯、聚丙烯、聚酯、聚氨基甲酸酯、聚合物水凝膠、sephadex、sepharose、硅土凝膠、沉淀的硅土、和teflon牌ptfe。在實施方案中，可以在吸附酶后干燥基質(zhì)、表面或基片。

在又一個實施方案中，本發(fā)明的組合物是在二氧化碳捕獲中可適用的組合物。

實施例

實施例1

在枯草芽孢桿菌中克隆并表達persephonellamarinadsm14350碳酸酐酶

persephonellamarina是一種于80℃左右生長的海洋細菌(等,2002,internationaljournalofsystematicandevolutionarymicrobiology,52,1349-1359)。

設(shè)計基于persephonellamarinadsm14350碳酸酐酶蛋白質(zhì)序列(uniprot登錄號c0qrb5)的合成基因，并針對枯草芽孢桿菌優(yōu)化基因密碼子選擇。

密碼子優(yōu)化方法使用與下文表1中的密碼子表中頻率成比例的同義密碼子來設(shè)計基因。此方法是本領(lǐng)域中已知的，見例如gustafsson等,2004,trendsinbiotechnology22:346-353。

表1：枯草芽孢桿菌密碼子頻率

將來自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶信號肽(其由以下核苷酸序列編碼：atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttcttgctgcctcattctgcagcagcggcg(seqidno:5)與編碼經(jīng)優(yōu)化的碳酸酐酶基因的dna以符合讀碼框的方式克隆。融合產(chǎn)物的核苷酸序列對應(yīng)于seqidno:3。

合成的ca基因seqidno:3在大腸桿菌載體(由合成基因供方選擇)中購買，并且將ca基因再克隆入合適的載體中，產(chǎn)生質(zhì)粒c6221。

圖3中顯示了含有經(jīng)優(yōu)化的ca基因persephonellamarina(表示為ca)的c6221的質(zhì)粒圖。通過三重啟動子系統(tǒng)的控制表達ca基因，所述三重啟動子系統(tǒng)由來自地衣芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyl)、解淀粉芽孢桿菌α-淀粉酶基因(amyq)的啟動子、和包含穩(wěn)定化序列的蘇云金芽孢桿菌cryiiia啟動子(在圖3中表示為cryiiia)組成。表達盒也已經(jīng)記載于wo99/43835。此外，質(zhì)粒c6221含有終止子(term)序列、編碼氯霉素乙酰轉(zhuǎn)移酶(cam)的基因，其作為枯草芽孢桿菌的選擇標志使用(如記載于(diderichsen等,1993,plasmid30:312-315的)。使用給予氨芐青霉素抗性的β-內(nèi)酰胺酶基因(amp)及卡那霉素抗性基因(neo)作為大腸桿菌生長的克隆選擇標志基因。質(zhì)粒還含有大腸桿菌復(fù)制起點。

用質(zhì)粒c6221轉(zhuǎn)化大腸桿菌top10細胞，并使用本領(lǐng)域中已知的方法來選擇一個正確的克隆。用自選定的大腸桿菌克隆分離的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化感受態(tài)枯草芽孢桿菌細胞，質(zhì)粒中的ca基因構(gòu)建體通過同源重組整合入枯草芽孢桿菌染色體中，進入果膠酸裂合酶基因基因座中(在圖3中表示為pel)。

通過dna測序分析氯霉素抗性枯草芽孢桿菌克隆以證實構(gòu)建體的正確dna序列。翻譯的蛋白質(zhì)序列對應(yīng)于seqidno:4，其中氨基酸1-28對應(yīng)于來自地衣芽孢桿菌的α-淀粉酶信號肽，添加第29位的氨基酸丙氨酸以優(yōu)化信號肽切割位點，而氨基酸29至251對應(yīng)于預(yù)測的成熟碳酸酐酶。

選擇一個表達克隆，并在旋轉(zhuǎn)式搖床上在500ml帶擋板的erlenmeyer燒瓶中培養(yǎng)，所述帶擋板的erlenmeyer燒瓶各含有補充有34mg/l氯霉素的100ml基于酪蛋白的培養(yǎng)基。將克隆于37℃培養(yǎng)5天。依照wilbur,1948,j.biol.chem.176:147-154(基本上如記載于實施例2的)測定培養(yǎng)液中存在著非常高的碳酸酐酶活性。

為了從培養(yǎng)液中的內(nèi)源枯草芽孢桿菌酶中半純化熱穩(wěn)定性ca，將無細胞培養(yǎng)液于80℃溫育15分鐘，并將溶液以15,000xg離心30分鐘。無菌過濾上清液(0.2μm濾器,whatman)具有測定的166000wau/ml的ca活性，如實施例2中描述的。

實施例2

碳酸酐酶活性的檢測

用于檢測碳酸酐酶的測試由wilbur,1948,j.biol.chem.176:147-154描述。設(shè)置基于由于自二氧化碳形成碳酸氫鹽的測定混合物ph變化，如反應(yīng)式1中給出的：

[co2+h2o→hco3^-+h⁺]。

此研究中使用的活性測定法源自chirica等,2001,biochim.biophys.acta1544(1-2):55-63的規(guī)程。在測定法前約30分鐘，通過使用注射器尖端以100ml/min的流速將co2鼓泡到100ml蒸餾水中來制備含有約60至70mmco2的溶液。將co2溶液在冰水浴中于0-4℃冷卻。為了測試碳酸酐酶的存在，將2ml25mm用25mmhcl調(diào)節(jié)至ph8.3的tris-hcl溶液(含有足以給出獨特的且可見的藍色的溴百里酚藍)添加至兩個在4℃水浴中冷卻的13x100mm試管。向一個管添加10微升含有酶的溶液，并將等量的去離子水添加至第二個管以充當(dāng)對照。將2mlco2溶液非常快速且平穩(wěn)地添加至每管的底部。與添加co2溶液同時，開啟秒表。記錄溶液從藍色變?yōu)辄S色需要的時間(溴百里酚藍的轉(zhuǎn)變點是ph6-7.6)。co2水合反應(yīng)期間的氫離子生成降低溶液的ph，直至達到溴百里酚藍的顏色轉(zhuǎn)變點。顏色變化需要的時間與樣品中存在的碳酸酐酶量成反比。為了使結(jié)果可再現(xiàn)，管必須保持浸沒于冰浴中，持續(xù)整個測定法。通常，未催化的反應(yīng)(對照)花費40至150秒發(fā)生顏色變化，而酶催化的反應(yīng)在5-20秒完成，這取決于添加的酶溶液中酶蛋白質(zhì)的量及取決于熱處理后的殘余活性(見實施例1)。檢測顏色變化是有些主觀的，但是一式三份測量的誤差對于催化反應(yīng)在0至1秒差異的范圍中。一個單位根據(jù)wilbur[1u＝(1/tc)-(1/tu)x1000]定義，其中u是單位，而tc和tu分別代表催化的和未催化的反應(yīng)的時間(以秒計)(wilbur,1948,j.biol.chem.176:147-154)。這些單位也稱作wilbur-anderson單位(wau)。

實施例3

p.marina碳酸酐酶的熱穩(wěn)定性

評估重組碳酸酐酶在于升高的溫度處理后的活性。

如下測量獲自實施例1的ca酶的熱穩(wěn)定性：將實施例1中獲得的溶液在1mnahco3,ph8中稀釋以給出2500wau，并于期望的溫度溫育15分鐘。為了測量tu，于相同的溫度加熱1mnahco3。這對應(yīng)于未催化反應(yīng)的反應(yīng)時間，如實施例2中解釋的。將樣品在冰水浴中冷卻，并使用實施例2中描述的wilbur-anderson測定法來測量碳酸酐酶活性。

于升高的溫度溫育后的殘余活性以熱處理后的活性除以處理前于25℃的酶活性乘以100％計算。表2中呈現(xiàn)了結(jié)果。關(guān)于嗜熱甲烷八疊球菌ca的數(shù)據(jù)自wo2010/151787(申請?zhí)杙ct/us2010/040022)的表1取得。數(shù)據(jù)清楚顯示了p.marinaca就短期熱穩(wěn)定性而言優(yōu)于嗜熱甲烷八疊球菌ca。

表2：在1mnahco3中15分鐘熱處理后的溫度穩(wěn)定性

n.d.＝未測定

穩(wěn)定性作為延長溫育時間的函數(shù)

將獲自實施例1的碳酸酐酶溶液用1mnahco3ph8稀釋10倍，并于80℃加熱指定的時間。如上文所描述的，測量殘余活性。表3中呈現(xiàn)了結(jié)果。關(guān)于嗜熱甲烷八疊球菌ca的數(shù)據(jù)自wo2010/151787(申請?zhí)杙ct/us2010/040022)中的表1取得。數(shù)據(jù)清楚顯示了p.marina碳酸酐酶在1mnahco3緩沖液中于80℃于ph8溫育2小時后尚未喪失其活性。

表3：于80℃熱處理后的殘余活性

n.d.＝未測定

穩(wěn)定性作為ph的函數(shù)

將獲自實施例1的碳酸酐酶溶液用0.1mbritton-robinson緩沖液稀釋10倍，調(diào)節(jié)至表4中指示的ph，并于50℃加熱指定的時間。如上文所描述的，測量殘余活性。表4中呈現(xiàn)了結(jié)果。數(shù)據(jù)顯示了p.marina碳酸酐酶在于50℃在0.1mbritton-robinson緩沖液中在寬ph范圍4-11里加熱1天時保留大于80％活性，而且在ph范圍6-11里維持完全活性。在于50℃加熱10天后，p.marina碳酸酐酶在ph范圍5-11里保持大于50％活性。

表4：于50℃熱處理后于不同ph的殘余活性

實施例4

在中空纖維膜生物反應(yīng)器中從混合的氣體流提取co2

設(shè)置實驗室規(guī)模中空纖維膜生物反應(yīng)器(hfmb)以從從可類似煙道氣體的氣體流選擇性捕獲co2。

中空纖維膜生物反應(yīng)器設(shè)置

多孔疏水性中空纖維膜在氣體流與載體液體間提供高的接觸表面積。因此，它們促進液體的碳化作用或自液體除去co2。選擇的模塊由2300個平行的具有0.18m²活性表面積和平均孔徑0.01×0.04微米的中空纖維(購自membrana,northcarolina,usa的liqui-1x5.5)組成。這些膜易于按比例放大到工業(yè)規(guī)模，并且已經(jīng)在工業(yè)中用于污水處理和飲料碳化作用。圖1中顯示了生物反應(yīng)器設(shè)置的示意圖。在該設(shè)置中，使用容積式泵將載體液體通過中空纖維腔。將液體流速設(shè)置為約4ml/分鐘。含有15％co2(9ccm)和85％n2(51ccm)混合物的氣體流(進料氣)與載體液體流逆流地進入中空纖維的進料側(cè)，并且經(jīng)處理的氣流(洗滌氣)在中空纖維的清掃側(cè)離開模塊。使用兩個質(zhì)量流控制器來貫穿整個實驗以一致的濃度混合氮氣和二氧化碳。使用質(zhì)量流動表來監(jiān)測洗滌氣在其離開反應(yīng)器時的流動。調(diào)節(jié)氣體和液體流動和壓力以在模塊的液相中避免進入液體至氣相和氣泡。

此設(shè)置的目的是證明co2吸收到載體液體中，這導(dǎo)致co2水合成碳酸氫鹽。通過使用氣相色譜儀(gc)分析進料氣和洗滌氣中的co2濃度來測量吸收。

載體液體

使用用0.5m氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)至ph9的0.5m碳酸氫鈉鹽作為載體液體對照。然后，將實施例1中獲得的2500wau/ml碳酸酐酶(ca)酶蛋白添加至貯液器。于室溫維持溫度。

氣相層析方法(gc-tcd)

使用具有導(dǎo)熱性檢測器和氣體取樣閥的shimadzu2010氣相色譜儀進行co2濃度測量。使用毛細管carboxenplot1010柱來檢測氮氣和二氧化碳。將柱于35℃等溫加熱7分鐘，將溫度以20℃/分鐘速率提高到200℃，并且將其于200℃維持2分鐘。將注射器和檢測器溫度于230℃維持。柱流動是1ml/分鐘，分流比10至1，而載體氣體是氦氣。分別在保留時間6.4和15.3分鐘處檢出氮氣和二氧化碳峰。使用購自scott特種氣體(pennsylvania,usa)的在氮氣中具有0.1％、1％和10％(按重量計)二氧化碳的三種二氧化碳標準品校正co2峰。

結(jié)果

表5顯示了使用具有或沒有碳酸酐酶的載體液體自gc收集的數(shù)據(jù)。每個數(shù)據(jù)點是于室溫在運行時間期間自每次注射的測量。忽視來自每組測量(具有或沒有碳酸酐酶的載體液體)第一次注射的數(shù)據(jù)以消除對管道或柱中保留的殘余氣體的懷疑。結(jié)果指示與在沒有酶的情況中在相同條件運行的對照(約25.1％)相比，來自p.marina的2500wau碳酸酐酶酶蛋白將co2除去效率增加至約61.9％。進料氣中的百分比co2平均值為15.8％。

表5：載體液體對離開中空纖維膜生物反應(yīng)器的氣體流的co2濃度的影響

實施例5

p.marina碳酸酐酶在3m碳酸(氫)鉀中的熱穩(wěn)定性

在高離子強度碳酸(氫)鉀鹽水溶液中于環(huán)境的和升高的溫度處理延長的時間后測量重組碳酸酐酶的活性。將如實施例1中獲得的碳酸酐酶酶溶液在3m含水碳酸氫鉀鹽(khco3)(ph8.5)中，或在3m含水碳酸鉀鹽(k2co3)(使用約一份3mkhco3與兩份3mk2co3調(diào)節(jié)至ph11)中稀釋10倍，以給出表6中顯示的初始酶溶液活性。如實施例2中所描述的，在時間0小時時測量初始酶活性(wau)。使用在3mkhco3或3mk2co3中稀釋10倍的去離子水來測量相應(yīng)未催化反應(yīng)(tu)的時間，如實施例2中解釋的，隨后，將這些溶液在與含有酶的溶液相同的條件處理。將密封小瓶中的溶液在80℃的水浴中放置或者容許于室溫(23℃)放置。在0、6和24小時時(對于80℃浴樣品)及在0和72小時時(對于室溫樣品)采集wau分析的樣品。使用實施例2中描述的wilbur-anderson測定法測量碳酸酐酶活性。在本實施例的wau測量中，為了將tu時間縮短到40-60秒內(nèi)，對測定管添加以分析基于3mkhco3的樣品的co2溶液量是3ml，而對測定管添加以分析基于3mk2co3的樣品的co2溶液量是4ml。在實驗結(jié)束時使用ph紙測量測試溶液的最終ph。如預(yù)期的，處理的最終ph高于初始ph，這是由于基于碳酸氫鹽的溶液隨時間將co2釋放到空氣，這是一種公知的現(xiàn)象。因此，不限于任何具體理論，除高溫外，酶活性在較長時間的喪失的一個貢獻因素可以是高的ph。p.marinaca在此測試的苛求條件后保持活性的事實表明p.marinaca是一種特別穩(wěn)定的碳酸酐酶。

溫育后的百分比保留活性以處理后的活性除以溫育前0小時時的活性乘以100％計算。表6中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示了p.marinaca在高ph、高離子強度、和升高溫度的條件中在延長的時間里保留相當(dāng)大的酶活性。

表6：在3m碳酸(氫)鹽溶劑中于23℃和80℃處理后的殘余活性。

n.d.＝未測定

實施例6

酶對超聲攪拌的穩(wěn)定性

超聲攪拌對于某些co2氣體分離方法可以是有用的。在暴露于超聲攪拌之前及之后測量兩種不同碳酸酐酶(ca)的活性。如實施例1中所描述的，獲得p.marinaca酶溶液。將凍干的牛ca(sigma-aldrich,產(chǎn)品目錄編號c3934)在使用前在去離子水中溶解。將每種酶溶液在1m含水碳酸氫鈉鹽(nahco3),ph8.5中稀釋10倍。使用在1mnahco3中稀釋10倍的去離子水來測量未催化反應(yīng)(tu)的時間，如實施例2中解釋的，并且在與含有酶的溶液相同的條件處理此溶液。將樣品在密封小瓶中在超聲水浴(branson8510,40khz頻率,320w)于50℃放置。在0、2和6小時時采集樣品，并且使用實施例2中描述的wilbur-anderson測定法測試活性。

溫育后的百分比殘余活性以處理后的活性除以時間0小時時的活性乘以100％計算。表7中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示了p.marinaca在處理后保留高活性，而牛ca在6小時處理(不管溫度如何)后失活。

表7：在用和不用超聲處理的情況中處理后的殘余酶活性

實施例7

碳酸酐酶在不同溶劑中于延長的時間的熱穩(wěn)定性

在可以用于co2氣體分離方法的水溶液中于升高的溫度處理延長的時間后測量兩種重組碳酸酐酶(ca)的活性。獲得并純化克勞氏芽孢桿菌ca，如記載于wo2008/095057(通過提述并入本文)的實施例1和3的。于ph6使用陽離子交換柱進一步純化如實施例1中獲得的p.marinaca酶溶液(純化的p.marinaca)。將每個純化的酶溶液在如下三種溶劑之每種中進一步稀釋10倍：1.5mph8.6的含水碳酸氫鉀鹽(khco3)；1.5mph10.7的含水n-甲基二乙醇胺(mdea)；或含有1.5mkhco3/1.5mmdea的溶液(ph9.8)，其通過混合等體積3mkhco3和3mmdea制備。在容許酶-溶劑混合物于室溫(23℃)放置5小時后測量每種溶液的初始酶活性(wau)，如實施例2中所描述的。使用在每種溶劑中稀釋10倍的去離子水來測量相應(yīng)的未催化反應(yīng)(tu)的時間，如實施例2中解釋的，隨后，在與含有酶的溶液相同的條件處理這些溶液。將密封小瓶中的溶液在80℃的水浴中放置13小時。將樣品取出，并在冰上冷卻，直至活性分析。使用實施例2中描述的wilbur-anderson測定法測量碳酸酐酶活性，只是對每個測試管添加的co2溶液量是4.8ml，其導(dǎo)致20-40秒的tu時間。使用ph紙測量每個測試溶液的最終ph(+/-0.5ph單位準確性)。表8中顯示了ph結(jié)果。

溫育后百分比保留活性以處理后的活性除以初始活性乘以100％計算。表8中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示p.marinaca在高ph、高離子強度、和升高的溫度的條件中在延長的時間里比克勞氏芽孢桿菌ca保留更高的活性。測量的初始活性證明這兩種酶在所有三種溶劑中于室溫持續(xù)幾小時都保留活性。觀察到p.marinaca在khco3/mdea的組合中比在單獨的mdea中保留更高的活性，即使khco3/mdea組合的最終ph更高。與khco3溶劑中更高活性組合，這提示了碳酸酐酶在存在碳酸氫鹽的情況中是穩(wěn)定化的，而且在含有碳酸酐酶的co2分離溶劑中包含碳酸氫鹽是有益的。

表8：在三種溶劑中于80℃處理13小時后的殘余活性。

n.d.＝未測定

實施例8

碳酸酐酶在不同溶劑中的熱穩(wěn)定性

在可以用于co2氣體分離方法的水溶液中于升高的溫度處理后測量如實施例1中獲得的重組p.marina碳酸酐酶(ca)活性。將酶溶液在如下的每種溶劑中進一步稀釋10倍：1.5mph8.6的含水碳酸氫鉀鹽(khco3)；1.5mph10.7的含水n-甲基二乙醇胺(mdea)；含有1.5mkhco3/1.5mmdea的溶液(ph9.8)，其通過混合等體積的3mkhco3和3mmdea制備；1.5mph10.3的k2hpo4；含有1.5mkhco3/1.5mk2hpo4的溶液(ph9)，其通過混合等體積的3mkhco3和3mk2hpo4制備；1.5m三(羥甲基)氨基甲烷(tris)(ph10.5)；及1.5mkhco3/1.5mtris(ph9.6)，其通過混合等體積的3mkhco3和3mtris制備。如實施例2中所描述的，測量每種溶液的初始酶活性(wau)。使用在每種溶劑中稀釋10倍的去離子水來測量相應(yīng)的未催化的反應(yīng)(tu)的時間，如實施例2中解釋的，隨后在與含有酶的溶液相同的條件處理這些溶液。將密封小瓶中的溶液在50℃的水浴中放置1小時。將樣品取出，并在冰上冷卻，直至活性分析。使用實施例2中所描述的wilbur-anderson測定法測量碳酸酐酶活性，只是調(diào)節(jié)對每個測試管添加的co2溶液量以確保30-60秒的tu時間。對于溶劑1.5mkhco3,1.5mkhco3/1.5mmdea和1.5mmdea，添加3.5mlco2溶液。對于溶劑1.5mtris,1.5mkhco3/1.5mtris,1.5mk2hpo4和1.5mkhco3/1.5mk2hpo4，添加4mlco2溶液。觀察到測定ph指示劑的顏色轉(zhuǎn)變在含有k2hpo4的溶劑的情況中較寬(藍色至淺綠色-黃色(greenish-yellow)至黃色)。這是由于基于磷酸鹽的溶液的高緩沖性能，其在某些co2氣體分離方法中可以是有益的。在活性分析后，將樣品在80℃的水浴中放置1小時，然后取出，并在冰上冷卻，直至活性分析，其如上文所描述的那樣實施。使用ph紙測量每種測試溶液的最終ph。表9中顯示了ph結(jié)果。

溫育后的百分比保留活性以處理后的活性除以初始活性乘以100％計算。表9中呈現(xiàn)的結(jié)果顯示了p.marinaca在所有溶劑中在于50℃處理1小時后幾乎保留完全活性，并且在1.5mkhco3和1.5mkhco3/1.5mmdea中于80℃再1小時后保留較高的活性。p.marinaca在1.5mkhco3/1.5mk2hpo4、1.5mk2hpo4、和1.5mkhco3/1.5mtris中在于80℃再1小時后保留較高的活性。然而，p.marinaca通過于80℃在1.5mmdea和1.5mtris中處理滅活。觀察到對于1.5mkhco3/1.5mmdea組合、1.5mkhco3/1.5mk2hpo4組合、和1.5mkhco3/1.5mtris組合發(fā)生溶劑ph的最大變化，提示了co2最容易從這些溶劑釋放，這對于co2氣體分離方法的解吸階段可以是有益的。p.marinaca在khco3/mdea的組合中比在單獨的mdea中及在1.5mk2hpo4,1.5mkhco3/1.5mk2hpo4和1.5mkhco3/1.5mtris中保留更高的活性，即使這些組合的最終ph更高。

表9：在水性溶劑中于50℃，然后80℃處理后的殘余活性。

序列表

<110>諾維信公司(novozymesa/s)

<120>熱穩(wěn)定性persephonella碳酸酐酶及其用途

<130>11766-wo-pcd

<160>5

<170>patentinversion3.5

<210>1

<211>732

<212>dna

<213>persephonellamarina

<400>1

atgaaaaaatttgtagtcgggctttcatctcttgtacttgcaacatcttcatttgcaggt60

ggtggctggagttatcacggggaacacggaccggaacattggggcgatctaaaagatgaa120

tacataatgtgtaagatcggtaaaaatcagtctccggtagatataaacagaatagttgat180

gcgaaattaaaacctataaagatagaatacagagcaggtgcaacaaaggtattaaataat240

ggacacacaataaaagtttcttacgaaccgggaagttatatagttgttgatgggataaaa300

tttgagctgaagcagtttcatttccacgcaccaagtgagcataaattaaaaggacagcat360

tacccgtttgaggctcattttgttcatgcagataagcatggtaaccttgctgttataggt420

gttttctttaaagaaggaagagaaaatcctatcttagaaaagatatggaaagttatgcct480

gaaaatgcaggcgaagaggttaaacttgcacacaagataaatgctgaagatttactgcca540

aaggatagagattactacagatacagcggttctttaactactccaccatgttctgaaggt600

gtaagatggatagttatggaagaggagatggagatgtcaaaggagcagattgagaagttc660

agaaagattatgggtggagatacaaacagaccggttcagcctttaaatgcaagaatgatt720

atggaaaaatag732

<210>2

<211>243

<212>prt

<213>persephonellamarina

<400>2

metlyslysphevalvalglyleuserserleuvalleualathrser

151015

serphealaglyglyglytrpsertyrhisglygluhisglyproglu

202530

histrpglyaspleulysaspglutyrilemetcyslysileglylys

354045

asnglnserprovalaspileasnargilevalaspalalysleulys

505560

proilelysileglutyrargalaglyalathrlysvalleuasnasn

65707580

glyhisthrilelysvalsertyrgluproglysertyrilevalval

859095

aspglyilelysphegluleulysglnphehisphehisalaproser

100105110

gluhislysleulysglyglnhistyrpropheglualahispheval

115120125

hisalaasplyshisglyasnleualavalileglyvalphephelys

130135140

gluglyarggluasnproileleuglulysiletrplysvalmetpro

145150155160

gluasnalaglyglugluvallysleualahislysileasnalaglu

165170175

aspleuleuprolysaspargasptyrtyrargtyrserglyserleu

180185190

thrthrproprocyssergluglyvalargtrpilevalmetgluglu

195200205

glumetglumetserlysgluglnileglulysphearglysilemet

210215220

glyglyaspthrasnargprovalglnproleuasnalaargmetile

225230235240

metglulys

<210>3

<211>756

<212>dna

<213>人工的

<220>

<223>合成的ca基因

<400>3

atgaaacaacaaaaacggctttacgcccgattgctgacgctgttatttgcgctcatcttc60

ttgctgcctcattctgcagcagcggcgggctggtcttatcacggcgagcatggccctgag120

cattggggtgaccttaaagacgagtacatcatgtgcaagatcggcaagaaccaatctcct180

gttgacatcaaccgcatcgttgacgctaaacttaaacctatcaaaatcgagtatcgcgca240

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catggcaaccttgctgttatcggcgttttcttcaaagaaggtcgcgagaacccaatcctt480

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<210>4

<211>251

<212>prt

<213>人工的

<220>

<223>具有地衣芽孢桿菌(b.licheniformis)alpha-淀粉酶信號肽的persephonellamarinaca

<400>4

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151015

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202530

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210215220

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<210>5

<211>87

<212>dna

<213>地衣芽孢桿菌(bacilluslicheniformis)

<400>5

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