本發(fā)明涉及農(nóng)用肥料領(lǐng)域，尤其涉及一種整體生物酶解法制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑的方法。

背景技術(shù)：

早在公元12世紀(jì)中葉海藻肥已被西歐等地的人們廣泛利用。17世紀(jì)法國政府大力推薦在沿海地區(qū)用海藻作為土壤肥料。1880年有學(xué)者第一次報道了施用海藻提取物的對比試驗結(jié)果，清楚地說明了海藻作為肥料的優(yōu)越性。大量應(yīng)用效果和研究表明，海藻提取物應(yīng)用于作物生產(chǎn)具有很多優(yōu)點：可提高種子發(fā)芽率，促進(jìn)幼苗生長，提高產(chǎn)量和品質(zhì)，增加作物抗逆性以及促進(jìn)作物收獲后土壤腐殖質(zhì)的形成。這些突出的肥效依賴于海藻中天然含有的豐富的植物生長調(diào)節(jié)劑如細(xì)胞激動素、植物生長素、赤霉素、脫落酸、乙烯、甜菜堿、多胺等，除此之外，海藻中還含有海洋生物所特有的海藻多糖、藻朊酸、高度不飽和脂肪酸和陸生植物稀有的鋅、溴、碘等礦物元素，以及大量的非含氮有機物和一定數(shù)量的氨基酸、蛋白質(zhì)及微量營養(yǎng)元素外。從上世紀(jì)90年代左右，國外海藻肥涌入國內(nèi)市場并帶動了中國本土海藻在農(nóng)業(yè)上的應(yīng)用和發(fā)展，海藻肥在農(nóng)業(yè)上的突出效果和作用一直被農(nóng)業(yè)人士所認(rèn)可。特別是2014年農(nóng)業(yè)部提出《到2020年化肥施用量零增長行動計劃》，環(huán)保高效的海藻肥作為新型肥料的一種越來越被行業(yè)所青睞和接受。

海藻肥生產(chǎn)中，需要通過細(xì)胞破碎或增溶技術(shù)提取海藻細(xì)胞內(nèi)含物，同時使大分子物質(zhì)降解為可溶且易被吸收的小分子物質(zhì)。常見方法有物理法如機械破碎、低溫爆破等，該方法環(huán)保，能最大程度保留海藻中的活性成分，但對設(shè)備要求高；化學(xué)方法如酸堿提取法是目前生產(chǎn)海藻酸的主要方法，但對海藻中的活性成分有一定破壞作用，高溫高壓強酸強堿工藝過程中控制不當(dāng)極易出現(xiàn)有機物的碳化現(xiàn)象；生物技術(shù)如微生物發(fā)酵、酶解法等，可以在保留海藻活性成分的同時，將其大分子轉(zhuǎn)化為能被作物直接吸收的小分子，如微生物直接發(fā)酵，還能生產(chǎn)其他海藻原料中不合有的對作物有益的活性成分，但技術(shù)要求高，生產(chǎn)周期長，產(chǎn)品穩(wěn)定性難控制；酶解法是最高效和溫和的方法，通過專一性酶制劑降解大分子物質(zhì)，破壞細(xì)胞釋放細(xì)胞內(nèi)含物，溫和的條件可最大程度的保留海藻本身的活性物質(zhì)。然而現(xiàn)有酶解技術(shù)工藝流程中，原材料海藻都需要經(jīng)過復(fù)雜的前處理過程，獲得海藻的細(xì)微顆粒以利于酶解的進(jìn)行。這些前處理包括海藻的浸泡、清洗、除雜、剪切、研磨等，海藻中大量的活性物質(zhì)如甘露醇、碘、巖藻聚糖及其他在這些前處理工藝中流失，造成最終產(chǎn)品的活性降低。

因此，市場上需要一種生物酶解法處理整體海藻制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑的方法。

技術(shù)實現(xiàn)要素：

為解決現(xiàn)有技術(shù)中存在的上述缺陷，本發(fā)明旨在提供一種利用商品復(fù)合酶對海藻進(jìn)行酶解，克服以往技術(shù)中酶解工藝前處理如海藻浸泡、清洗、除雜、剪切、研磨等的復(fù)雜性以及這些前處理帶來的活性物質(zhì)流失的弊端，直接對鮮海藻或干海藻整體進(jìn)行溫和高效的軟化并酶解，最大程度地保留了海藻中的活性物質(zhì)，保證了海藻肥的效果和品質(zhì)的生物酶解法處理整體海藻制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑的方法。

為了實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用以下技術(shù)方案：一種整體生物酶解法制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑的方法，包括以下步驟：

1)生產(chǎn)前準(zhǔn)備

①準(zhǔn)備原材料：準(zhǔn)備完整的鮮海藻或干海藻、纖維素酶、褐藻多糖酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶；

②準(zhǔn)備設(shè)備及工裝：準(zhǔn)備設(shè)置有溫控裝置的酶解罐、膠體磨或均質(zhì)機、超聲振蕩設(shè)備、臥式螺旋卸料沉降離心機；

③準(zhǔn)備工藝輔材：單羥乙基胺、5％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氫氧化鉀、一氯三嗪-β-環(huán)糊精；

2)原料的預(yù)處理：

若為鮮海藻則將新鮮海藻整體浸泡于1-2倍重量的水中裝入酶解罐，其中水中含有鮮海藻重量0.3％-0.8％的無機鹽并混合均勻，在溫度40-60℃與間歇性攪拌的條件下對海藻進(jìn)行軟化1-3h，得到一種ph6.5-ph7.5的海藻漿液；

若為干海藻則將干海藻整體浸泡于5-10倍重量的水中酶解罐，其中水中含有干海藻重量3％-8％的無機鹽并混合均勻，在溫度40-60℃與間歇性攪拌的條件下對海藻進(jìn)行軟化1-3h，得到一種ph6.5-ph7.5的海藻漿液。

3)一級酶解

將溫度控制在35-50℃，在海藻漿液中加入以海藻干重計1-4％的纖維素酶，0.1-0.3％的褐藻多糖酶，間歇式攪拌，酶解時間6-12h，至酶解液ph5-6時結(jié)束一級酶解；

4)酶解液除雜

在一級酶解過程中，待稠厚的海藻漿液粘度顯著下降，可自由攪拌后，伴隨酶解攪拌狀態(tài)，將酶解體系在2個酶解罐間多次轉(zhuǎn)換，借助沙石沉降進(jìn)行酶解體系雜質(zhì)的去除；

5)酶解液均質(zhì)

將完成步驟3)和步驟4)，已基本液化的酶解海藻漿液，通過膠體磨或均質(zhì)機進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)化處理，使未徹底酶解的海藻顆粒細(xì)化至100nm-10μm；

6)二級酶解

將步驟5)獲得的均質(zhì)酶解液調(diào)節(jié)至ph6.5-ph7.5，溫度調(diào)節(jié)至50-60℃，加入海藻干重0.1％-0.3％的蛋白酶，1-3％的果膠酶，0.1％-0.2％的淀粉酶，間歇式攪拌進(jìn)行二級酶解，酶解時間2-4h；

7)后處理

將步驟6)得到的酶解液通過臥式螺旋卸料沉降離心機進(jìn)行固液分離，可獲得固形物含量在3-10％的海藻酶法提取液；

8)促生長素的分離純化

①將單羥乙基胺投入7)獲得的海藻酶法提取液中，再將混合后的濃縮液置入超聲振蕩設(shè)備，以300w-350w的功率振蕩35min-40min，獲得終末漿料；

②將終末漿料靜置至水溶液和有機溶液自然分層，分離出有機溶液和水溶液；

③采用一氯三嗪-β-環(huán)糊精浸入有機溶液中，以每10s間隔攪拌10s，攪拌速率100r/min-150r/min的攪拌工藝攪拌1.5h-2h，即可吸附出所需植物生長調(diào)節(jié)劑；

④采用5％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氫氧化鉀對吸附有植物生長調(diào)節(jié)劑的一氯三嗪-β-環(huán)糊精進(jìn)行凈化處理，分離雜質(zhì)，即獲得被吸附的高純促生長素；

⑤采用去離子水浸泡吸附的高純植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行水解離，并在水解離容器外施加強度為330v/m-350v/m的直流電場，35min-40min后取出一氯三嗪-β-環(huán)糊精，留于去離子水中的即為分離出的高純促生長素；

9)肥料終配

①將8)中步驟⑤獲得的促生長素與8)中步驟②獲得的水溶液分開保存和使用，即獲得所需整體生物酶解法制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑。

與現(xiàn)有技術(shù)相比較，由于采用了上述技術(shù)方案，本發(fā)明具有以下優(yōu)點：采取的最主要原材料是完整的海藻，因此有效成份保有量高，環(huán)境友好，可實現(xiàn)更大程度上的可持續(xù)發(fā)展和資源的最優(yōu)化利用；生產(chǎn)過程科學(xué)而高效，先添加的纖維素酶和褐藻多糖酶在植物細(xì)胞水充盈的環(huán)境下快速、徹底地發(fā)揮其作用，破壞了植物細(xì)胞的細(xì)胞壁，釋放了植物細(xì)胞內(nèi)的各種物質(zhì)，后添加的蛋白酶、淀粉酶和果膠酶分別分解或裂解水化了這些物質(zhì)中各種大分子物質(zhì)，使所有成份分子量降低、體積減小、活性增高；合理利用水和有機溶劑可分別溶解不同極性物質(zhì)的特性及水和部分不溶于水的有機溶劑自然分離的特性，分離出水溶物和有機溶物，再利用植物中植物促生長素多溶于單羥乙基胺、其它有機物少溶于單羥乙基胺的特性，實現(xiàn)促生長素的精準(zhǔn)提取，采用一氯三嗪-β-環(huán)糊精把分子量適配的促生長素與少量雜質(zhì)吸附出來，進(jìn)一步凈化了提取物，由于促生長素分子量較為均一，與一氯三嗪-β-環(huán)糊精結(jié)合較好，而雜質(zhì)多通過氫鍵與一氯三嗪-β-環(huán)糊精簡單連接，通過氫氧化鉀進(jìn)行斷氫鍵處理后可以獲得最高純度的促生長素，由于獲得的促生長素純度更高，促進(jìn)植物生長的效果更為明顯。

具體實施方式

實施例1

一種整體生物酶解法制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑的方法，包括以下步驟：

1)生產(chǎn)前準(zhǔn)備

①準(zhǔn)備原材料：準(zhǔn)備完整的干海藻、纖維素酶、褐藻多糖酶、蛋白酶、果膠酶、淀粉酶；

②準(zhǔn)備設(shè)備及工裝：準(zhǔn)備設(shè)置有溫控裝置的酶解罐、膠體磨或均質(zhì)機、超聲振蕩設(shè)備、臥式螺旋卸料沉降離心機；

③準(zhǔn)備工藝輔材：單羥乙基胺、5％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氫氧化鉀、一氯三嗪-β-環(huán)糊精；

2)原料的預(yù)處理：

將干海藻整體浸泡于10倍重量的水中酶解罐，其中水中含有干海藻重量5％的亞硫酸鉀并混合均勻，在溫度50℃與間歇性攪拌的條件下對海藻進(jìn)行軟化2.5h，得到一種ph約為7的海藻漿液。

3)一級酶解

將溫度控制在38℃，在海藻漿液中加入以海藻干重計2％的纖維素酶，o.1％的褐藻多糖酶，間歇式攪拌，酶解時間9h，此時酶解液ph5.5，結(jié)束一級酶解；

4)酶解液除雜

在一級酶解過程中，待稠厚的海藻漿液粘度顯著下降，可自由攪拌后，伴隨酶解攪拌狀態(tài)，將酶解體系在2個酶解罐間多次轉(zhuǎn)換，借助沙石沉降進(jìn)行酶解體系雜質(zhì)的去除；

5)酶解液均質(zhì)

將完成步驟3)和步驟4)，已基本液化的酶解海藻漿液，通過膠體磨或均質(zhì)機進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)化處理，使未徹底酶解的海藻顆粒細(xì)化至1μm；

6)二級酶解

將步驟5)獲得的均質(zhì)酶解液調(diào)節(jié)至ph7，溫度調(diào)節(jié)至60℃，加入海藻干重0.1％的蛋白酶，1的果膠酶，0.1％的淀粉酶，間歇式攪拌進(jìn)行二級酶解，酶解時間2h；

7)后處理

將步驟6)得到的酶解液通過臥式螺旋卸料沉降離心機進(jìn)行固液分離，可獲得固形物含量在7％的海藻酶法提取液；

8)促生長素的分離純化

①將單羥乙基胺投入7)獲得的海藻酶法提取液中，再將混合后的濃縮液置入超聲振蕩設(shè)備，以350w的功率振蕩40min，獲得終末漿料；

②將終末漿料靜置至水溶液和有機溶液自然分層，分離出有機溶液和水溶液；

③采用一氯三嗪-β-環(huán)糊精浸入有機溶液中，以每10s間隔攪拌10s，攪拌速率100r/min的攪拌工藝攪拌1.5h，即可吸附出所需植物生長調(diào)節(jié)劑；

④采用5％質(zhì)量分?jǐn)?shù)的氫氧化鉀對吸附有植物生長調(diào)節(jié)劑的一氯三嗪-β-環(huán)糊精進(jìn)行凈化處理，分離雜質(zhì)，即獲得被吸附的高純促生長素；

⑤采用去離子水浸泡吸附的高純植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行水解離，并在水解離容器外施加強度為330v/m的直流電場，35min后取出一氯三嗪-β-環(huán)糊精，留于去離子水中的即為分離出的高純促生長素；

9)肥料終配

①將8)中步驟⑤獲得的促生長素與8)中步驟②獲得的水溶液分開保存和使用，即獲得所需整體生物酶解法制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑。

根據(jù)本實施例生產(chǎn)的整體生物酶解法制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑，田間肥效實驗情況為：海藻植物生長調(diào)節(jié)劑在草莓上的實驗效果：

實驗地點：山東省青島市城陽區(qū)夏莊

實驗時間：2016年2月-2016年4月

實驗品種：大棚甜寶草莓

實驗設(shè)計：采用小區(qū)對比法，選擇生態(tài)環(huán)境條件良好、肥水和病蟲防治等田間管理一致的地塊。

實驗設(shè)2個處理：(1)實施例1工藝生產(chǎn)獲得的海藻植物生長調(diào)節(jié)劑，兩種組份分別用水稀釋1000倍，同時正反葉面噴施；(2)清水對照，對照區(qū)施用等量的清水。每個處理組3個重復(fù)，各小區(qū)隨機排列。

施肥方式：從第二茬果膨果期開始每隔7天正反葉面噴施一次，共施用4次。

實驗效果

海藻植物生長調(diào)節(jié)劑對草莓果實重量及甜度的影響

表1收獲期不同處理組的草莓果實重量和果實甜度

各實驗組依據(jù)實驗方案處理完畢后，在各實驗重復(fù)組分別隨機選取10個草莓進(jìn)行稱重及糖度的測定，取平均值為各小區(qū)指標(biāo)。各重復(fù)小區(qū)指標(biāo)再取均值為各處理組指標(biāo)。從數(shù)據(jù)中可以看到，施用酶解海藻植物生長調(diào)節(jié)劑后，草莓的果實大小明顯比清水對照組大，平均增重22.18％；草莓的甜度相比清水對照組，增加更大，平均甜度增大35.7％。

實施例2

一種整體生物酶解法制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑的方法，整體與實施例1一致，差異之處在于：

2)原料的預(yù)處理：

將新鮮海藻整體浸泡于2倍重量的水中裝入酶解罐，其中水中含有鮮海藻重量0.3％的無機鹽并混合均勻，在溫度40與間歇性攪拌的條件下對海藻進(jìn)行軟化1h，得到一種ph6.5的海藻漿液；

3)一級酶解

將溫度控制在35℃，在海藻漿液中加入以海藻干重計4％的纖維素酶，0.3％的褐藻多糖酶，間歇式攪拌，酶解時間6h，至酶解液ph5時結(jié)束一級酶解；

5)酶解液均質(zhì)

將完成步驟3)和步驟4)，已基本液化的酶解海藻漿液，通過膠體磨或均質(zhì)機進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)化處理，使未徹底酶解的海藻顆粒細(xì)化至100nm；

6)二級酶解

將步驟5)獲得的均質(zhì)酶解液調(diào)節(jié)至ph6.5，溫度調(diào)節(jié)至50℃，加入海藻干重0.3％的蛋白酶，3％的果膠酶，0.2％的淀粉酶，間歇式攪拌進(jìn)行二級酶解，酶解時間4h；

7)后處理

將步驟6)得到的酶解液通過臥式螺旋卸料沉降離心機進(jìn)行固液分離，可獲得固形物含量在10％的海藻酶法提取液；

8)促生長素的分離純化

①將單羥乙基胺投入7)獲得的海藻酶法提取液中，再將混合后的濃縮液置入超聲振蕩設(shè)備，以300w的功率振蕩35min，獲得終末漿料；

③采用一氯三嗪-β-環(huán)糊精浸入有機溶液中，以每10s間隔攪拌10s，攪拌速率150r/min的攪拌工藝攪拌2h，即可吸附出所需植物生長調(diào)節(jié)劑；

⑤采用去離子水浸泡吸附的高純植物生長調(diào)節(jié)劑進(jìn)行水解離，并在水解離容器外施加強度為350v/m的直流電場，40min后取出一氯三嗪-β-環(huán)糊精，留于去離子水中的即為分離出的高純促生長素；

根據(jù)本實施例生產(chǎn)的整體生物酶解法制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑，田間肥效實驗情況為：海藻植物生長調(diào)節(jié)劑在草莓上的實驗效果：草莓的果實大小明顯比清水對照組大，平均增重23.97％；草莓的甜度相比清水對照組，增加更大，平均甜度增大40.0％。

實施例3

一種整體生物酶解法制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑的方法，整體與實施例1一致，差異之處在于：

2)原料的預(yù)處理：

將干海藻整體浸泡于5倍重量的水中酶解罐，其中水中含有干海藻重量5％的亞硫酸鉀并混合均勻，在溫度60℃與間歇性攪拌的條件下對海藻進(jìn)行軟化3h，得到一種ph約為7的海藻漿液。

3)一級酶解

將溫度控制在50℃，在海藻漿液中加入以海藻干重計1％的纖維素酶，0.3％的褐藻多糖酶，間歇式攪拌，酶解時間6h，此時酶解液ph6.5，結(jié)束一級酶解；

5)酶解液均質(zhì)

將完成步驟3)和步驟4)，已基本液化的酶解海藻漿液，通過膠體磨或均質(zhì)機進(jìn)行進(jìn)一步細(xì)化處理，使未徹底酶解的海藻顆粒細(xì)化至10μm；

6)二級酶解

將步驟5)獲得的均質(zhì)酶解液調(diào)節(jié)至ph7.5，溫度調(diào)節(jié)至50℃；

7)后處理

將步驟6)得到的酶解液通過臥式螺旋卸料沉降離心機進(jìn)行固液分離，可獲得固形物含量在3％的海藻酶法提取液；

根據(jù)本實施例生產(chǎn)的整體生物酶解法制備海藻植物生長調(diào)節(jié)劑，田間肥效實驗情況為：海藻植物生長調(diào)節(jié)劑在草莓上的實驗效果：草莓的果實大小明顯比清水對照組大，平均增重19.56％；草莓的甜度相比清水對照組，增加更大，平均甜度增大33.8％。

綜上試驗說明，采用鮮海藻獲取的海藻植物生長調(diào)節(jié)劑效果優(yōu)于干海藻，與同時申報的另一發(fā)明相比，說明高純度的促生長素相較于高活性多雜質(zhì)的促生長素對植物生長的促進(jìn)作用更加明顯。

對所公開的實施例的上述說明，僅為了使本領(lǐng)域?qū)I(yè)技術(shù)人員能夠?qū)崿F(xiàn)或使用本發(fā)明。對這些實施例的多種修改對本領(lǐng)域的專業(yè)技術(shù)人員來說將是顯而易見的，本文中所定義的一般原理可以在不脫離本發(fā)明的精神或范圍的情況下，在其它實施例中實現(xiàn)。因此，本發(fā)明將不會被限制于本文所示的這些實施例，而是要符合與本文所公開的原理和新穎特點相一致的最寬的范圍。