本發(fā)明涉及分子生物學(xué)
技術(shù)領(lǐng)域：
，尤其是涉及一種用于鑒定山雞椒性別的snp標(biāo)記及該snp標(biāo)記的篩選方法。
背景技術(shù)：
：山雞椒(litseacubeba(lour.)pers.)，又名山蒼子，木姜子等，屬于樟科(lauracea)木姜子屬(litsealam)落葉灌木或小喬木，是原產(chǎn)于我國的珍貴天然香料植物。其果實(shí)、葉、花等組織可蒸提精油，精油中檸檬醛含量高達(dá)60-90％，是制造高級(jí)化妝品、藥品、食品添加劑、病蟲害防治劑、潤滑油等的重要原料。山雞椒為雌雄異株植物，天然林中雌雄株比例大約為1：0.59～0.75，但是僅有少數(shù)的雄株即可保證充足的花粉供應(yīng)(1:0.18)。然而在實(shí)際種植中，由于山雞椒雌雄株在形態(tài)上差異不大，無法對(duì)造林材料進(jìn)行性別鑒定，導(dǎo)致雌雄株比例不能達(dá)到1:0.18，只能在山雞椒生長三年開花后，通過花形態(tài)辨別雌雄株，再去除多余雄株以達(dá)到此比例。這種方式造成了巨大的時(shí)間延誤和資源浪費(fèi)，阻礙了山雞椒雌雄株資源的優(yōu)化配置及其合理利用，延長了山雞椒苗木育種周期，降低了苗木結(jié)實(shí)率及苗木育種者的經(jīng)濟(jì)效益。因此，開發(fā)一種能夠快速有效，并且能夠準(zhǔn)確鑒定山雞椒性別的方法尤為重要。有鑒于此，特提出本發(fā)明。技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：本發(fā)明的第一個(gè)目的在于提供山雞椒基因組中snp位點(diǎn)在鑒定所述山雞椒性別中的應(yīng)用，本發(fā)明的第二個(gè)目的在于提供一種能夠鑒定山雞椒性別的snp位點(diǎn)的篩選方法，本發(fā)明的第三個(gè)目的在于提供一種用于鑒定山雞椒性別的產(chǎn)品，以緩解現(xiàn)有技術(shù)中存在的沒有快速有效，并且準(zhǔn)確的鑒定山雞椒性別的方法的技術(shù)問題。本發(fā)明提供的山雞椒基因組中snp位點(diǎn)在鑒定所述山雞椒性別中的應(yīng)用，所述snp位點(diǎn)為lcu266763。本發(fā)明還提供了一種用于鑒定山雞椒性別的snp位點(diǎn)的篩選方法，所述篩選方法包括如下步驟：步驟(a)：從待測(cè)山雞椒中提取基因組dna，構(gòu)建rad文庫，并進(jìn)行測(cè)序，得到原始數(shù)據(jù)；步驟(b)：對(duì)所述原始數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化篩選，得到rad測(cè)序數(shù)據(jù)；步驟(c)：將所述rad測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并獲得每個(gè)個(gè)體rad-標(biāo)簽的數(shù)目和深度；步驟(d)：根據(jù)所述rad-標(biāo)簽的深度進(jìn)行一次歸類，并根據(jù)所述一次歸類后的差異堿基數(shù)進(jìn)行二次歸類，對(duì)snp標(biāo)記基因分型，根據(jù)最大似然法確定所述snp位點(diǎn)。進(jìn)一步地，在所述步驟(a)中，所述基因組dna為從所述待測(cè)山雞椒的花蕾中提取。進(jìn)一步地，在所述步驟(b)中，所述優(yōu)化篩選為去除所述原始數(shù)據(jù)中的接頭序列，過濾小片段序列、rad-tag不明確的序列及測(cè)序質(zhì)量評(píng)估低于質(zhì)量10的序列。進(jìn)一步地，在所述步驟(d)中，所述一次歸類為將深度超過3且序列完全相同的rad-標(biāo)簽聚為stack，所述二次歸類為差異堿基數(shù)少于4的所述stack聚為locus。進(jìn)一步地，所述snp位點(diǎn)滿足以下條件(1)-(5)中的一條或多條：(1)在所述待測(cè)山雞椒的樣本中有40％及以上的個(gè)體具有該位點(diǎn)；(2)至少有一個(gè)所述stack或locus具有該位點(diǎn)；(3)測(cè)序深度大于等于3；(4)最小等位基因頻率大于等于0.05；(5)一個(gè)位點(diǎn)中有多個(gè)snps時(shí)隨機(jī)選取一個(gè)。進(jìn)一步地，所述snp位點(diǎn)表現(xiàn)為在雄性中出現(xiàn)，在雌性中缺失，或者在雌性中出現(xiàn)，在雄性中缺失。進(jìn)一步地，所述snp位點(diǎn)為lcu266763。進(jìn)一步地，所述lcu266763表現(xiàn)為如下(a)和(b)：(a)雌中純合，等位基因核苷酸為g；(b)雄中雜合，等位基因核苷酸為g和a。另外，本發(fā)明還提供了一種用于鑒定山雞椒性別的產(chǎn)品，所述產(chǎn)品包括能夠特異性檢測(cè)所述lcu266763的引物對(duì)。本發(fā)明提供了山雞椒基因組中snp(singlenucleotidepolymorphisms，單核苷酸多態(tài)性)位點(diǎn)在鑒定所述山雞椒性別中的應(yīng)用，通過檢測(cè)snp位點(diǎn)lcu266763能夠快速準(zhǔn)確地鑒定山雞椒的性別。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)山雞椒性別的snp位點(diǎn)的篩選方法，通過rad(restrictionsiteassociateddna)測(cè)序技術(shù)對(duì)待測(cè)山雞椒樣品進(jìn)行測(cè)序分析，尋找到了一個(gè)只存在于雄性山雞椒或雌性山雞椒中的功能性snp分子標(biāo)記，通過該snp標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)山雞椒性別的準(zhǔn)確鑒定。附圖說明為了更清楚地說明本發(fā)明具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)中的技術(shù)方案，下面將對(duì)具體實(shí)施方式或現(xiàn)有技術(shù)描述中所需要使用的附圖作簡單地介紹，顯而易見地，下面描述中的附圖是本發(fā)明的一些實(shí)施方式，對(duì)于本領(lǐng)域普通技術(shù)人員來講，在不付出創(chuàng)造性勞動(dòng)的前提下，還可以根據(jù)這些附圖獲得其他的附圖。圖1為本發(fā)明實(shí)施例1提供的部分待測(cè)山雞椒樣品提取基因組dna電泳結(jié)果圖；圖2為本發(fā)明實(shí)施例1提供的部分待測(cè)山雞椒樣品rad-標(biāo)簽測(cè)序深度分布情況結(jié)果圖；圖3本發(fā)明實(shí)施例4提供的lcu266763與性別相關(guān)性及性別預(yù)測(cè)的結(jié)果圖。具體實(shí)施方式下面將結(jié)合實(shí)施例對(duì)本發(fā)明的技術(shù)方案進(jìn)行清楚、完整地描述，顯然，所描述的實(shí)施例是本發(fā)明一部分實(shí)施例，而不是全部的實(shí)施例?；诒景l(fā)明中的實(shí)施例，本領(lǐng)域普通技術(shù)人員在沒有做出創(chuàng)造性勞動(dòng)前提下所獲得的所有其他實(shí)施例，都屬于本發(fā)明保護(hù)的范圍。本發(fā)明提供了山雞椒基因組中snp位點(diǎn)在鑒定山雞椒性別中的應(yīng)用，其中，snp位點(diǎn)為lcu266763。本發(fā)明還提供了一種用于鑒定山雞椒性別的snp位點(diǎn)的篩選方法，所述篩選方法包括如下步驟：步驟(a)：從待測(cè)山雞椒中提取基因組dna，構(gòu)建rad文庫，并進(jìn)行測(cè)序，得到原始數(shù)據(jù)；步驟(b)：對(duì)所述原始數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化篩選，得到rad測(cè)序數(shù)據(jù)；步驟(c)：將所述rad測(cè)序數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并獲得每個(gè)個(gè)體rad-標(biāo)簽的數(shù)目和深度；步驟(d)：根據(jù)所述rad-標(biāo)簽的深度進(jìn)行一次歸類，并根據(jù)所述一次歸類后的差異堿基數(shù)進(jìn)行二次歸類，對(duì)snp標(biāo)記基因分型，根據(jù)最大似然法確定所述snp位點(diǎn)。在本發(fā)明中，在步驟(a)中，山雞椒基因組dna為從待測(cè)山雞椒的花蕾中提取；測(cè)序?yàn)椴捎胕lluminape測(cè)序技術(shù)進(jìn)行雙尾端測(cè)序；在本發(fā)明中，在步驟(b)中，優(yōu)化篩選為去除所述數(shù)據(jù)中的接頭序列，過濾小片段序列、rad-tag不明確的序列及測(cè)序質(zhì)量評(píng)估低于質(zhì)量10的序列。其中，測(cè)序質(zhì)量評(píng)估應(yīng)用slidingwindow(長度為截取后序列長度的15％)。在本發(fā)明中，在步驟(d)中，利用stacks軟件進(jìn)行snp標(biāo)記基因分型，將rad-標(biāo)簽深度超過3的完全相同序列聚為一個(gè)stack，將差異堿基數(shù)少于4的stacks聚為一個(gè)locus，根據(jù)最大似然法確定snps。在本發(fā)明中，上述snp位點(diǎn)滿足以下條件(1)-(5)中的一條或多條：(1)在待測(cè)山雞椒的樣本中有40％及以上的個(gè)體具有該位點(diǎn)；(2)至少有一個(gè)stack或locus具有該位點(diǎn)；(3)測(cè)序深度大于等于3；(4)最小等位基因頻率大于等于0.05；(5)一個(gè)位點(diǎn)中有多個(gè)snps時(shí)隨機(jī)選取一個(gè)。在本發(fā)明中，snp位點(diǎn)表現(xiàn)為在雄性中出現(xiàn)，在雌性中缺失，或者在雌性中出現(xiàn)，在雄性中缺失。在本發(fā)明中，上述snp位點(diǎn)為lcu266763。其中，lcu266763表現(xiàn)為如下(a)和(b)：(a)雌中純合，等位基因核苷酸為g；(b)雄中雜合，等位基因核苷酸為g和a。另外，本發(fā)明還提供了一種用于鑒定山雞椒性別的產(chǎn)品，包括能夠特異性檢測(cè)lcu266763的引物對(duì)，其中，lcu266763的上游引物為：5'-atcttctaatccggccgttc-3'(如序列表中seqidno.1所示)；lcu266763的下游引物為：5'-gatcttctaatccggccgtt-3'(如序列表中seqidno.2所示)。在本發(fā)明中，用于鑒定山雞椒性別的產(chǎn)品例如可以為，但不限于試劑盒。本發(fā)明提供了山雞椒基因組中snp位點(diǎn)在鑒定所述山雞椒性別中的應(yīng)用，通過檢測(cè)snp位點(diǎn)lcu266763能夠快速準(zhǔn)確地鑒定山雞椒的性別。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)山雞椒性別的snp位點(diǎn)的篩選方法，通過rad(restrictionsiteassociateddna)測(cè)序技術(shù)對(duì)待測(cè)山雞椒樣品進(jìn)行測(cè)序分析，尋找到了一個(gè)只存在于雄性山雞椒或雌性山雞椒中的功能性snp分子標(biāo)記，通過該snp標(biāo)記，實(shí)現(xiàn)對(duì)山雞椒性別的準(zhǔn)確鑒定。為了有助于更清楚的理解本發(fā)明的內(nèi)容，現(xiàn)結(jié)合具體的實(shí)施例詳細(xì)介紹如下。實(shí)施例1山雞椒rad測(cè)序2014年10月于貴州省黔東南自治州黎平縣永從鄉(xiāng)，隨機(jī)采集天然分布的11株山雞椒雌株、11株山雞椒雄株花蕾，置于液氮中帶回實(shí)驗(yàn)室，利用dn15植物基因組dna提取試劑盒提取基因組dna(結(jié)果如圖1所示)，用于構(gòu)建rad文庫，并采用illuminape測(cè)序技術(shù)進(jìn)行雙尾端測(cè)序。22個(gè)樣品共獲得261,462,739bp原始數(shù)據(jù)。通過去除原始數(shù)據(jù)中的接頭序列、過濾小片段序列及rad-tag不明確的序列、利用slidingwindow(長度為截取后序列長度的15％)進(jìn)行測(cè)序質(zhì)量評(píng)估，過濾掉低于質(zhì)量10的序列后，共保留了84.04％的原始數(shù)據(jù)(219,745,695bp)，如表1所示。表1山雞椒rad測(cè)序數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)根據(jù)相同酶切位置rad-標(biāo)簽測(cè)序數(shù)據(jù)之間的序列全同性，將數(shù)據(jù)進(jìn)行計(jì)數(shù)并獲得每個(gè)個(gè)體rad-標(biāo)簽的數(shù)目和深度信息，用于評(píng)估rad技術(shù)對(duì)于酶切區(qū)域的富集效果。通過對(duì)5’端非酶切位點(diǎn)起始的序列、rad-標(biāo)簽深度值為1的序列進(jìn)行過濾后，進(jìn)一步統(tǒng)計(jì)數(shù)目標(biāo)簽數(shù)目和深度信息，結(jié)果如圖2所示。22個(gè)樣品共得到30373871個(gè)rad-標(biāo)簽。通過表2與圖1可以看出，樣品的酶切實(shí)驗(yàn)富集效果良好。表2rad-標(biāo)簽數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)實(shí)施例2snp標(biāo)記基因分型利用stacks軟件進(jìn)行snp標(biāo)記基因分型，將標(biāo)簽深度超過3的完全相同序列聚為一個(gè)stack，將差異堿基數(shù)少于4的stacks聚為一個(gè)locus，根據(jù)最大似然法確定snps。挑出滿足以下條件的snps：(1)在所有樣本中有40％的個(gè)體具有該位點(diǎn)；(2)至少有一個(gè)群體具有該位點(diǎn)；(3)stack測(cè)序深度必須大于等于3；(4)最小等位基因頻率必須大于等于0.05；(5)一個(gè)位點(diǎn)中有多個(gè)snps時(shí)隨機(jī)選取一個(gè)。22個(gè)樣品共得到80769個(gè)snp標(biāo)記，結(jié)果如表3至表8所示。表3基因型數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)表表4基因型數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)表續(xù)表-1poscnt9x10x11x1c2c3c4c133310a|11a|9a|8a|9a|2/g|3a|8-2181515c|13c|8a|5/c|7a|14a|4/c|4a|8-3196112g|8g|5--g|6g|7-4279410g|7g|6g|5-g|9g|8-5485010-c|13t|15c|8c|5t|9-6498113g|13-g|9g|10g|8--7556410c|6-c|7--c|8-8636812t|23--c|8-c|6/t|12c|59655310--c|6/t|3t|6t|5t|19-10951910-a|5/c|3--c|8-c|11111042914g|25--g|8g|5g|13a|6121046910-c|5/t|5t|15t|16t|7--131105415g|11g|6g|10g|6g|7g|7g|5141386714a|18a|6a|14a|4/c|4a|5a|10-151465811g|19-g|10a|4/g|3g|7g|7-161653710---c|13/g|5c|9c|21-172110711g|8-g|5g|6g|9--……………………………………………………表5基因型數(shù)據(jù)信息統(tǒng)計(jì)表續(xù)表-2其中，“pos”是變異位點(diǎn)的位置；“cnt”表示有多少樣本具有該位點(diǎn)；其后是個(gè)體基因型：“/”表示該個(gè)體在此處為雜合位點(diǎn)，兩側(cè)是等位基因堿基型(無“/”則是純合位點(diǎn))，“|”后面是該堿基的測(cè)序深度，“-”為缺失位點(diǎn)。表622個(gè)樣品snp信息統(tǒng)計(jì)表poscnt1x2x3x4x5x6x7x8x133310---a---a2181515---a--cc3196112-g-----g4279410-g-----g5485010------tt6498113---a/ggg-a/g7556410----cc-c8636812---c/t---c/t9655310c--c/t---c/t10951910c-c-cc--111042914-g-----g121046910---ttt--131105415--g----g141386714----a--a151465811----gg-g161653710----c/g-cc172110711--gggg--……………………………………………表722個(gè)樣品snp信息統(tǒng)計(jì)表續(xù)表-1表822個(gè)樣品snp信息統(tǒng)計(jì)表續(xù)表-2poscnt5c6c7c8c9c10c11c133310a-a----2181515-cacca/cc3196112ag-gggg4279410-ga---g5485010c/tt-t---6498113g-g-ggg7556410-c--ctc8636812ctc-ttt9655310t-t---c10951910-cc---c111042914a/ggga/ga/gga/g121046910-tt--t-131105415ggg-gag141386714a-a/caaaa151465811--a/g--gg161653710--cc/g-cc/g172110711--ga--g……………………………………………………實(shí)施例3山雞椒性別相關(guān)的snps位點(diǎn)篩選對(duì)山雞椒雌、雄dna池的rad-標(biāo)簽進(jìn)行比對(duì)，過濾后得到89個(gè)snp位點(diǎn)，表現(xiàn)出雌池(或者雄池)中存在，而在雄池(或者雌池)中缺失，如表9所示。進(jìn)一步評(píng)估這89個(gè)標(biāo)記，篩選出兩個(gè)標(biāo)記可能與性別相關(guān)(lcu136163和lcu266763)，其分別在超過5個(gè)以上的樣本中表現(xiàn)出雌中純合(g)，雄中雜合(等位基因‘g’和‘a(chǎn)’)。表989個(gè)snp信息統(tǒng)計(jì)表其中，“/”表示該個(gè)體在此處為雜合位點(diǎn)，兩側(cè)是等位基因堿基型(無“/”則是純合位點(diǎn))，“-”為缺失位點(diǎn)。實(shí)施例4snps性別關(guān)聯(lián)驗(yàn)證及性別預(yù)測(cè)2016年1月，于富陽新沙島山雞椒種質(zhì)資源庫中采集48株山雞椒植株(24株雌株和24株雄株)，利用等位基因特異pcr基因分型方法驗(yàn)證rad標(biāo)記lcu136163和lcu266763與性別關(guān)聯(lián)性，引物信息見表10。結(jié)果顯示，rad標(biāo)記lcu136163標(biāo)記未表現(xiàn)出與性別具有相關(guān)性，rad標(biāo)記lcu266763表現(xiàn)出與性別相關(guān)性，預(yù)示著山雞椒性別決定的遺傳機(jī)制是基于雄性雜合性(g/a)。表10引物信息此外，對(duì)富陽城市森林公園的36株樣品(實(shí)際性別為18株雌株，18株雄株)進(jìn)行性別預(yù)測(cè)，以驗(yàn)證snps位點(diǎn)的正確性。除兩個(gè)雌株外，lcu266763能較穩(wěn)定的顯示出山雞椒雌雄間的差異，利用等位基因特異kasp方法進(jìn)行相關(guān)性驗(yàn)證及預(yù)測(cè)。讀取每個(gè)樣品的fam熒光發(fā)射系數(shù)和calfluororange560熒光系數(shù)，與空白對(duì)照進(jìn)行比較。結(jié)果如圖3所示。通過以上實(shí)驗(yàn)結(jié)果可以說明，本發(fā)明通過檢測(cè)snp位點(diǎn)lcu266763能夠快速準(zhǔn)確地鑒定山雞椒的性別。本發(fā)明提供的用于檢測(cè)山雞椒性別的snp位點(diǎn)的篩選方法，尋找到了一個(gè)只存在于雄性山雞椒或雌性山雞椒中的功能性snp分子標(biāo)記lcu266763，通過該lcu266763，實(shí)現(xiàn)對(duì)山雞椒性別的準(zhǔn)確鑒定。最后應(yīng)說明的是：以上各實(shí)施例僅用以說明本發(fā)明的技術(shù)方案，而非對(duì)其限制；盡管參照前述各實(shí)施例對(duì)本發(fā)明進(jìn)行了詳細(xì)的說明，本領(lǐng)域的普通技術(shù)人員應(yīng)當(dāng)理解：其依然可以對(duì)前述各實(shí)施例所記載的技術(shù)方案進(jìn)行修改，或者對(duì)其中部分或者全部技術(shù)特征進(jìn)行等同替換；而這些修改或者替換，并不使相應(yīng)技術(shù)方案的本質(zhì)脫離本發(fā)明各實(shí)施例技術(shù)方案的范圍。sequencelisting<110>中國林業(yè)科學(xué)研究院亞熱帶林業(yè)研究所<120>用于鑒定山雞椒性別的snp標(biāo)記及該snp標(biāo)記的篩選方法<160>2<170>patentinversion3.5<210>1<211>20<212>dna<213>人工序列<400>1atcttctaatccggccgttc20<210>2<211>20<212>dna<213>人工序列<400>2gatcttctaatccggccgtt20當(dāng)前第1頁12