本發(fā)明涉及急性早幼粒細(xì)胞白血病檢測(cè)技術(shù)的研究領(lǐng)域，更具體地說(shuō)，是可用于分子水平上檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病的核酸適配體及其篩選方法和應(yīng)用。

背景技術(shù)：

白血?。╨eukemia）是一種較常見(jiàn)的造血系統(tǒng)惡性腫瘤，其特點(diǎn)為骨髓及其它造血組織中的白血病細(xì)胞異常增生，浸潤(rùn)破壞各種器官和組織，導(dǎo)致該組織和臟器的結(jié)構(gòu)與功能損害。該病死亡率較高，危害性大，病情進(jìn)展迅速，如不及時(shí)治療，患者通常在患病后數(shù)周或數(shù)月內(nèi)死亡。目前對(duì)于急性白血病，包括急性早幼粒細(xì)胞白血?。╝cutepromyelocyticleukemia，apl）的診斷和治療手段非常有限。apl是一種特殊類(lèi)型的急性非淋巴細(xì)胞白血病，臨床特點(diǎn)為起病急、出血重，患者常因?yàn)椴荒茉缙谠\斷，失去治療時(shí)機(jī)而死亡。這主要是由于對(duì)白血病細(xì)胞表面特異性分子標(biāo)記物的認(rèn)識(shí)仍然不是很清楚,缺乏分子水平的診斷，延誤診斷及治療時(shí)機(jī)。

目前白血病的診斷和分型主要依靠細(xì)胞形態(tài)學(xué)、遺傳學(xué)以及免疫學(xué)等技術(shù)，缺乏一種方便、快捷、精準(zhǔn)的診斷方法。

臨床上不同類(lèi)型的白血病有不同的化療方案和病情預(yù)后，因此白血病的準(zhǔn)確分型對(duì)于該病的臨床診斷、治療方案的選擇以及預(yù)后的判斷等意義重大^[4]。

綜上，目前臨床上對(duì)白血病的發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制缺乏全面了解，白血病診斷的特異性和準(zhǔn)確性還有待進(jìn)一步提高。因此如何找到白血病細(xì)胞特異性分子標(biāo)記物，從而更深入的了解急性白血病發(fā)生與發(fā)展的機(jī)制，進(jìn)而研發(fā)新的診斷方法，成為目前白血病診斷急需解決的難題。

selex技術(shù)的出現(xiàn)為腫瘤標(biāo)志物的尋找?guī)?lái)了新的思路。指數(shù)富集的配基系統(tǒng)進(jìn)化技術(shù)，簡(jiǎn)稱(chēng)selex（systematicevolutionofligandsexponentialenrichment）技術(shù)，是近十幾年興起并迅速得到發(fā)展的高通量生物文庫(kù)篩選技術(shù)。其基本原理是利用分子生物學(xué)技術(shù)，構(gòu)建人工合成的單鏈隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)，由于單鏈寡核苷酸片段能形成靈活多變的空間三維結(jié)構(gòu)，理論上可以同各種靶分子結(jié)合，一個(gè)足夠容量（10¹⁵-10¹⁸）的寡核苷酸庫(kù)包容了所有可能的立體結(jié)構(gòu)，因此有可能從中篩到任何種類(lèi)靶分子的高親和力配體。利用這一原理，將隨機(jī)寡核苷酸文庫(kù)與靶分子相互作用，保留特異的寡核苷酸配體，并以此為模板利用pcr體外擴(kuò)增技術(shù)，以指數(shù)級(jí)富集與靶分子特異結(jié)合的寡核苷酸，經(jīng)過(guò)幾輪或數(shù)十輪反復(fù)擴(kuò)增、篩選過(guò)程，最終獲得高親和力高特異性的寡核苷酸配體(aptamer)。aptamer又被稱(chēng)作核酸適配體，是一類(lèi)新型的分子探針，由于其自身優(yōu)越性越來(lái)越受到人們的關(guān)注。核酸適配體功能類(lèi)似于單克隆抗體，能與靶物質(zhì)高特異性、高親和力結(jié)合，但與蛋白質(zhì)類(lèi)抗體相比，核酸適配體具有更多的優(yōu)勢(shì)，如不受免疫條件和免疫原性限制、無(wú)免疫原性、識(shí)別能力精確、分子小易滲透、可體外人工合成修飾、變性與復(fù)性可逆、有利于長(zhǎng)期保存和室溫運(yùn)輸?shù)取?/p>

核酸適配體的出現(xiàn)，打破了傳統(tǒng)意義上關(guān)于核酸只是遺傳信息存儲(chǔ)和轉(zhuǎn)運(yùn)載體的認(rèn)識(shí)，也為血液腫瘤的早期診斷及研發(fā)新的治療方法提供了新的契機(jī)，有望作為一種“化學(xué)抗體”應(yīng)用于白血病的早期診斷和靶向治療。

本發(fā)明以人急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞為靶細(xì)胞，應(yīng)用cell-selex技術(shù)通過(guò)正向及削減篩選過(guò)程制備了高特異性和高親和性的hl-60細(xì)胞適配體（ssdna）。該適配體的特點(diǎn)如下：對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的細(xì)胞膜蛋白質(zhì)靶點(diǎn)具有高度選擇性與高度親和性；急性早幼粒細(xì)胞白血病-ssdna文庫(kù)的構(gòu)建，為未來(lái)的臨床應(yīng)用提供了省時(shí)、簡(jiǎn)便、成本低、效率高的保證；在適配體合成過(guò)程中可依據(jù)試驗(yàn)的需要進(jìn)行生物化學(xué)的改造，例如連接生物素、羧基、氨基或者巰基。這些修飾并不影響生物探針對(duì)蛋白質(zhì)靶點(diǎn)的辨認(rèn)?；谠撨m配體這一獨(dú)到的特點(diǎn)，其可以連接藥物分子、核酸酶阻抗堿基的修飾（保護(hù)核酸不被水解）。這樣有利于體內(nèi)的試驗(yàn)跟蹤以及直接將連接的藥物分子送達(dá)到白血病細(xì)胞表面，起到特異診斷與靶向治療的雙重效果。

技術(shù)實(shí)現(xiàn)要素：

我們應(yīng)用正向篩選同時(shí)穿插反向消減技術(shù)完成了高特異性和高親和性的急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞適配體（aml-m3-ssdna）的構(gòu)建。因此本發(fā)明提供特異結(jié)合急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的核酸適配體探針；提供核酸適配體檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病的應(yīng)用方法，為急性早幼粒細(xì)胞白血病的靶向治療奠定方法學(xué)基礎(chǔ)。具體步驟如下：

（1）合成隨機(jī)單鏈dna文庫(kù)和引物

隨機(jī)單鏈dna文庫(kù)：5'-atccagagtgacgcagca-40nt-tggacacggtggctt

agt-3'

上游熒光素標(biāo)記的引物：5'-fitc-atccagagtgacgcagca-3'

下游生物素標(biāo)記的引物:5'-bio-actaagccaccgtgtcca-3'

上游引物：5'-atccagagtgacgcagca-3'

下游引物:5'-actaagccaccgtgtcca-3'

（2）cell-selex篩選流程

應(yīng)用含有10％新生牛血清的1640培養(yǎng)液培養(yǎng)人急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞（該細(xì)胞株由吉林大學(xué)贈(zèng)送），當(dāng)細(xì)胞數(shù)量達(dá)5x10⁶／ml后繼續(xù)培養(yǎng)12h，離心獲得沉淀，將隨機(jī)單鏈dna文庫(kù)配制成工作液加入沉淀中（終濃度1000nm）搖勻，37℃振蕩60min，洗滌去除尚未與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的ssdna，恒溫金屬浴95℃加熱10min，12000r/min離心5min，獲取上清，即為急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞的特異性核酸適配體。

（3）文庫(kù)擴(kuò)增

利用步驟（1）中的上、下游引物對(duì)在步驟（2）中獲得的急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞的特異性核酸適配體進(jìn)行pcr擴(kuò)增，得到的產(chǎn)物為雙鏈dna（dsdna）。

pcr擴(kuò)增體系為1000μl:2×taqpcrmix500μl，模板400μl,上游引物40μl,下游引物40μl,ddh2020μl,擴(kuò)增程序?yàn)?95℃150s，95℃30s，56.3℃30s，72℃30s，經(jīng)過(guò)10輪循環(huán)，72℃180s。

（4）dna單鏈文庫(kù)的制備

利用步驟（3）中獲得的dsdna上的標(biāo)記與鏈霉親和素化瓊脂糖微珠上鏈霉素的親和作用，將dsdna結(jié)合到磁珠表面，在磁珠中加入堿液反應(yīng)后，回收得到上清液，然后加入無(wú)水乙醇，離心后獲得沉淀。將沉淀溶于水中測(cè)定濃度，分裝出需要的重量并制成干粉，即為急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞的特異性核酸適配體，用作下一輪篩選的ssdna文庫(kù)。

（5）重復(fù)多輪篩選

將步驟（4）收集到的ssdna代替步驟(1)中的隨機(jī)文庫(kù)，重復(fù)以上步驟(2)～(4)至少12次，即得到用于檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病的核酸適配體。每輪篩選后都要進(jìn)行最佳pcr條件的優(yōu)化：選擇最佳循環(huán)次數(shù)、模板濃度等優(yōu)化的pcr條件進(jìn)行大量制備dsdna（圖1，2）。

（6）消減篩選

以上述方式完成12輪次的篩選過(guò)程中，穿插2次慢性粒細(xì)胞白血病k562細(xì)胞進(jìn)行消減篩選，以此達(dá)到去除與急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞結(jié)合的非特異性寡核苷酸的目的。消減純化的ssdna再進(jìn)行pcr擴(kuò)增轉(zhuǎn)變成dsdna、純化、親和層析再制備成ssdna文庫(kù)。

（7）篩選后結(jié)合穩(wěn)定性測(cè)定

為保證篩選出的核酸適配體識(shí)別急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的能力最強(qiáng)，需進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定。將后幾輪的篩選產(chǎn)物，用標(biāo)記有fitc的上游引物和標(biāo)記有生物素的下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增。pcr所得的dsdna用鏈霉親和素化瓊脂糖微珠和堿的體系使其解鏈，收集含有fitc的鏈在520nm進(jìn)行熒光測(cè)定。當(dāng)熒光強(qiáng)度的增加趨于飽和，表明經(jīng)過(guò)篩選后，ssdna文庫(kù)與hl-60細(xì)胞的親和力達(dá)到了最大，hl-60細(xì)胞的特異性ssdna文庫(kù)即構(gòu)建成功（圖3）。

（8）核酸適配體的特異性檢測(cè)

分別取急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞、急性淋巴細(xì)胞白血病jurkat細(xì)胞、急性單核細(xì)胞白血病u-937細(xì)胞，計(jì)數(shù)細(xì)胞數(shù)達(dá)2x10⁶/ml，離心獲得細(xì)胞沉淀。將篩選獲得的急性早幼粒細(xì)胞白血病的核酸適配體配制成工作液加入細(xì)胞沉淀中（終濃度1000nm）搖勻、振蕩30min、洗滌去除尚未與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的ssdna、收集細(xì)胞加熱95℃10min后冷卻、離心，收集上清，進(jìn)行pcr擴(kuò)增、瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)是：在50-100bp之間（76bp）出現(xiàn)條帶說(shuō)明核酸適配體能夠與細(xì)胞結(jié)合，不出現(xiàn)條帶的即不能結(jié)合。結(jié)果發(fā)現(xiàn)：篩選獲得的核酸適配體能與急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞特異性結(jié)合，電泳后有明顯的條帶，而與急性淋巴細(xì)胞白血病jurkat細(xì)胞、急性單核細(xì)胞白血病u-937細(xì)胞幾乎沒(méi)有結(jié)合（圖4）。

附圖說(shuō)明

圖1是最佳pcr條件優(yōu)化的電泳圖：

m：100bp標(biāo)準(zhǔn)dna；

1-4：模板濃度均為5%，擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)依次為6,8,10和12；

5-8模板濃度均為10%，擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)依次為6,8,10和12；

9-12模板濃度均為15%，擴(kuò)增循環(huán)次數(shù)依次為6,8,10和12。

圖2是大量制備的dsdna純化后電泳圖：

m：100bp標(biāo)準(zhǔn)dna；1：大量制備的dsdna

圖3是不同篩選次數(shù)520nm熒光光譜：

6：第6輪熒光光譜；7：第7輪熒光光譜；10：第10熒光光譜；

11、12：第11、12輪熒光光譜

圖4是核酸適配體的特異性檢測(cè)電泳圖

m：50bp標(biāo)準(zhǔn)dna；

1：空白對(duì)照

2：急性單核細(xì)胞白血病u-937細(xì)胞與適配體的結(jié)合；

3：急性淋巴細(xì)胞白血病jurkat細(xì)胞與適配體的結(jié)合；

4：急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞與適配體的結(jié)合

圖5是急性早幼粒細(xì)胞白血病核酸適配體的臨床應(yīng)用電泳圖

m：100bp標(biāo)準(zhǔn)dna；

1：急性淋巴細(xì)胞白血病患者骨髓細(xì)胞與適配體的結(jié)合；

2~3：急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞與適配體的結(jié)合；

4：急性單核細(xì)胞白血病患者骨髓細(xì)胞與適配體的結(jié)合；

5~8：臨床診斷明確的急性早幼粒細(xì)胞白血病患者骨髓細(xì)胞與適配體的結(jié)合；

9：空白對(duì)照。

具體實(shí)施方式

實(shí)施例一：

1.合成隨機(jī)單鏈dna文庫(kù)和引物

隨機(jī)單鏈dna文庫(kù)：5'-atccagagtgacgcagca-40nt-tggacacggtggctt

agt-3'

上游熒光素標(biāo)記的引物：5'-fitc-atccagagtgacgcagca-3'

下游生物素標(biāo)記的引物:5'-bio-actaagccaccgtgtcca-3'

上游引物：5'-atccagagtgacgcagca-3'

下游引物:5'-actaagccaccgtgtcca-3'

2.cell-selex篩選流程

cell-selex篩選獲得特異性識(shí)別急性早幼粒細(xì)胞白血病的核酸適配體

2.1取10μm的上述隨機(jī)ssdna文庫(kù)1μl溶解在350μlbindingbuffer中，95℃恒溫水浴5min，然后立即置于冰盒上備用。

2.21640培養(yǎng)液中加入10％新生牛血清培養(yǎng)急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞，當(dāng)細(xì)胞數(shù)達(dá)到5×10⁶/ml時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。800r/min離心3min，棄去上清留下細(xì)胞沉淀，用3ml清洗緩沖液輕柔洗滌細(xì)胞沉淀，重復(fù)三次，最終留下的細(xì)胞沉淀，用330μlbindingbuffer分多次溶解轉(zhuǎn)移到另一個(gè)新的ep管中備用。

2.3將2.1和2.2的溶液混合到一起，混勻后，放入37℃恒溫氣浴振蕩器中，50r/min勻速震蕩1h。

2.4結(jié)合完成后，6000r/min離心30s，棄去上清液，用清洗緩沖液洗滌沉淀3次，最后，沉淀用500μl無(wú)dna酶的高壓滅菌去離子水分多次溶解轉(zhuǎn)移到新ep管中，恒溫金屬浴95℃加熱10min，12000r/min離心5min，獲取上清，即為急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞的特異性核酸適配體。

擴(kuò)增篩選文庫(kù)

取400μl篩選得到的急性早幼粒細(xì)胞白血病hl-60細(xì)胞特異核酸適配體進(jìn)行pcr擴(kuò)

增，具體的擴(kuò)增條程序是：95℃150s，95℃30s，56.3℃30s，72℃30s，經(jīng)過(guò)10輪循環(huán)，72℃180s。第一輪篩選后得到的上清液，要全部用于pcr擴(kuò)增，得到擴(kuò)增產(chǎn)物。

單鏈文庫(kù)的制備

4.1將預(yù)先由naoh溶液清洗并用1×dpbs潤(rùn)洗過(guò)的親和層析柱固定在支架上，使之保持直立，并向?qū)游鲋屑尤爰s3/4體積的1×dpbs溶液，平衡層析柱。

4.2向?qū)游鲋闹醒刖徛尤?00μl鏈霉親和素化瓊脂糖微珠，再沿壁滴加1×dpbs溶液，使液體充滿(mǎn)層析柱，微珠介質(zhì)均勻平整的分布在層析柱的濾膜之上。

4.3打開(kāi)層析柱的蓋子，液體流盡后即刻加入樣本溶液，將樣品加到微球?qū)又?。向?qū)游鲋屑訚M(mǎn)1×dpbs溶液，待液體流盡馬上沿壁加入500μl200mm的naoh溶液，使dsdna發(fā)生解鏈反應(yīng)，含有生物素的一條ssdna鏈與鏈霉親和素化瓊脂糖微珠發(fā)生結(jié)合，吸附在微珠上，被留在了層析柱的濾膜之上，而另一條不含生物素的ssdna鏈則隨naoh溶液流出，收集流出的溶液于新的ep管中。

4.4向收集的溶液中加入2倍體積無(wú)水乙醇，-20℃冰箱保存90min，取出后以4℃，12000r/min離心10min，70%乙醇洗滌沉淀，4℃，12000r/min離心10min，棄去上清液，室溫自然干燥。

4.5將沉淀溶于無(wú)dna酶的高壓滅菌去離子水中，取一部分用紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)測(cè)定吸光度值并計(jì)算出ssdna克數(shù)，分裝出需要的重量，并用真空濃縮干膠系統(tǒng)制成干粉，用作下一輪篩選的ssdna文庫(kù)。

重復(fù)多輪篩選

將步驟4收集到的ssdna代替步驟1中的隨機(jī)文庫(kù)，重復(fù)以上步驟(2)～(4)至少12次，即得到用于檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病的核酸適配體。每輪篩選后都要進(jìn)行最佳pcr條件的優(yōu)化：選擇最佳循環(huán)次數(shù)、模板濃度等優(yōu)化的pcr條件進(jìn)行大量制備dsdna。

消減篩選

以上述方式完成12輪次的篩選過(guò)程中，穿插2次慢性粒細(xì)胞白血病k562細(xì)胞進(jìn)行消減篩選（第8輪和第9輪），以此達(dá)到去除與急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞結(jié)合的非特異性寡核苷酸的目的，提高篩選效率。具體的消減篩選過(guò)程為：

6.1用200μlbindingbuffer溶解上一輪所獲得的ssdna文庫(kù)，95℃恒溫水浴、冰浴后備用；

6.2計(jì)數(shù)慢性粒細(xì)胞白血病k562細(xì)胞3×10⁶/ml，800r/min離心3min，棄上清，用清洗緩沖液洗滌沉淀，800r/min離心3min，重復(fù)操作3次，將剩余的細(xì)胞沉淀物分多次溶解到250μlbindingbuffer里。

6.3將細(xì)胞混合液與準(zhǔn)備的ssdna文庫(kù)混勻，放在37℃氣浴恒溫振蕩器中，以50r/min的速度，勻速震蕩40min；離心收集上清液，即為經(jīng)過(guò)消減篩選的高特異性識(shí)別急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的核酸適配體。

輪篩選后結(jié)合穩(wěn)定性測(cè)定

為保證篩選出的核酸適配體識(shí)別急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞的能力最強(qiáng)，需進(jìn)行穩(wěn)定性測(cè)定。

7.1將第6、7、10、11、12輪的篩選產(chǎn)物，用標(biāo)記有fitc的上游引物和標(biāo)記有生物素的下游引物進(jìn)行pcr擴(kuò)增（同步驟3）。

7.2pcr所得的dsdna用鏈霉親和素化瓊脂糖微珠和堿的體系使其解鏈，收集含有fitc的鏈在520nm進(jìn)行熒光測(cè)定。

7.3篩選輪數(shù)增加后，熒光強(qiáng)度值也增加，第6輪以后增加幅度明顯，到第11輪和第12輪時(shí)，520nm熒光強(qiáng)度的增加趨近于飽和。

7.4經(jīng)過(guò)12輪的篩選，ssdna文庫(kù)與hl-60細(xì)胞的結(jié)合穩(wěn)定性達(dá)到最大，hl-60細(xì)胞的特異性ssdna文庫(kù)構(gòu)建成功。

7.5將所得擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)克隆測(cè)序分析后，最終得到6條與急性早幼粒細(xì)胞白血病細(xì)胞hl-60結(jié)合力不同的核酸適配體，序列如seqidno1～6所示，其結(jié)合能力由高到低依次為seqidno5、1、3、2、6、4。

核酸適配體的臨床應(yīng)用

獲取臨床診斷明確的急性早幼粒細(xì)胞白血病、急性淋巴細(xì)胞白血病、急性單核細(xì)胞白血病病人的骨髓液，用淋巴細(xì)胞分離液分離單個(gè)核細(xì)胞，細(xì)胞數(shù)達(dá)2x10⁶/ml。離心獲得細(xì)胞沉淀。將篩選獲得的seqidno5配制成工作液加入細(xì)胞沉淀中（終濃度1000nm）搖勻、振蕩30min、洗滌去除尚未與目標(biāo)細(xì)胞結(jié)合的ssdna、收集細(xì)胞加熱95℃10min后冷卻、離心，收集上清，進(jìn)行pcr擴(kuò)增及瓊脂糖凝膠電泳。電泳結(jié)果的判斷標(biāo)準(zhǔn)是：在50-100bp之間（76bp）出現(xiàn)條帶說(shuō)明核酸適配體能夠與細(xì)胞結(jié)合，不出現(xiàn)條帶的即不能結(jié)合。實(shí)驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)：seqidno5核酸適配體能夠與急性早幼粒細(xì)胞白血病病人的骨髓細(xì)胞結(jié)合，而不能與急性淋巴細(xì)胞白血病、急性單核細(xì)胞白血病病人的骨髓細(xì)胞結(jié)合（圖5）。

<110>北華大學(xué)

<120>一種檢測(cè)急性早幼粒細(xì)胞白血病適配體的篩選方法與應(yīng)用

<160>6

<210>1

<211>40

<212>dna

<213>人白細(xì)胞（humanumleukocyte）

<400>1

cacacttccctcttgctcgttttgggttttctccgcccgc40

<210>2

<211>40

<212>dna

<213>人白細(xì)胞（humanumleukocyte）

<400>2

ccacacgccataccttctttctcgtttcctcttggctccc40

<210>3

<211>40

<212>dna

<213>人白細(xì)胞（humanumleukocyte）

<400>3

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